变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳

摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。它们在突变分析上都有着重要的作用。

关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳

1、前言：

随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。

2、基本原理

2.1变性梯度凝胶电泳

由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性荆有尿素(urea)和甲酰胺(formamide)。根据DGGE变性梯度方向与电泳方向是否一致，可将其分为两种形式的DGGE：垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直，可用于优化样本的分离条件，也可用于分析PCR产物的组成；平行DGGE的变性梯度方向与电泳方向一致，可用于同时分析多个样本。检测某种突变的变性剂浓度一般通过变性

梯度凝胶电泳来确定。实际应用时。如果突变发生在高熔点区时，往往难以检测到。这主要是由于DNA熔解区域温度的增加导致迁移率的变化减少，难以将正常DNA分子和突变DNA分子分开。此外，高熔点区的解链时间较长，也使得应用DGGE受到限制。解决的办法一般是在PCR引物的5’末端加上一段40～50 bp的GC夹。但如果突变发生在CpG岛，则检测仍有困难。

2.2恒定变性凝胶电泳(CDGE)

Hovig等口3于1991年建立了一种恒定变性凝胶电泳(CDGE)，它是由DGGE经改变而来，其主要化学物质和基本方法都一样，只是凝胶浓度由垂直DGGE确定后，用均一的变性浓度凝胶代替梯度凝胶，使得整个电泳变得更加简单快速。

2.3瞬时温度梯度电泳(TTGE)

其检测突变的能力和DGGE差不多，但却不需要变性梯度胶。基本方法是：在加有一定浓度尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，使外界温度恒定地增加，这样在跑胶的过程中形成一个温度梯度，变性环境是由恒定浓度的尿素和瞬时温度梯度共同形成。这样使得全过程更加简单迅速，分辨率极高。

2.4温度梯度凝胶电泳(TGGE)

基本原理与DGGE差不多，只是由变性剂形成的梯度被温度梯度所代替。这样的梯度可由微处理器控制，与DGGE相比。更加稳定可靠。如在变性高压液相色谱(denaturing high pressure liquid chro—matography，DHPLC)Ⅲ中［2］，其杂台双链和纯合双链的分离就是通过精确的温度控制，使杂合双链部分变性，从而与纯合双链分离开来。

3.主要优缺点

①突变检出率高。在TGGE中，一般2mm可对应0．6℃温差，而在TTGE中，每小时升温可控制为0．1℃，极小的Tm值的差异也可以检测出来，尤其适用于单对碱基突变个体的筛查。如果突变发生在最先解链的DNA区域，则其检出率可不低于99％，而其他方法如PcR／sscP的检出率仅70％。②检测片段可达lkb，尤其适于100bp～500bp的片段。而PCR ／SSCP一般只适用于150bp～200bp，对较大片段的突变检出率将大大降低。③DGGE对肿瘤的突变检测有困难，尤其是实体瘤。仅改进后的CDGE和TGGE应用于肿瘤相关基因的筛查均已有文献报道。④加样量小。仅需1 ng～5 ng的DNA。⑤重复性好，因为主要电泳条件都由微处理器控制。⑧操作简便，快速。BIO—RED公司的Dcode普通突变检测系统最快在2小时内可检测64个样品。⑦该法的缺点是一般不能确定突变位置，最终还得依赖于DNA测序。

4.仪器与操作

DGGE、CDGE、TTGE和TGGE的操作基本一样，美国的BIO—RED公司开发出的Dcode普通突变检测系统将前三者与SSCP合而为一。给使用者带来了极大的方便。Dcode系统有一个温度调节装置，该装置由微处理器控制的加热器、缓冲液循环泵和搅拌器所组成。温控范围为5～70℃，如果跑胶温度要超过此范围，只要外接一个制冷器即可，十分方便。该温度调节装置的另一个好处是十分适应实验室的需要，如在65℃进行了DGGE分析，现在要挟成10℃下的SSCP，只要在系统中加人SSCP的成套装置即可。其他配置和普通电泳的装置差不多。操作上和SSCP相似，但对条件的控制更容易，操作更方便。固定、染色、显色程序与普通电泳一样。TGGE的仪器与操作见陈汉奎等01的综述。

5.应用

5.1对未知基因突变的筛选

PcR／DGGE可以准确鉴定单碱基替换、移框突变和少于10个碱基的缺失突变。一般来讲，就是用病人的基因组DNA或者是有突变个体的DNA进行PCR扩增，然后用DGGE分析。为提高检出率，常将突变的DNA和正常人的DNA混台变性，这样电泳后可形成四条带。最早由DGGE筛查的人类基因是珠蛋白位点口。以后有很多位点被分别筛查，如生长因子Ⅷ基因，生长因子D等。该法尤其适用于大样本的筛查，对一些罕见突变型的筛查十分有用。利用Riesner等口目设计的PCR／TGGE，根据条带位置的改变，利用热动力学统计方程还可计算确定突变发生的位置。

5.2在突变谱和拷贝数确定中的应用

DGGE的另一个作用是可分析突变的组成，即突变谱(mutational spectra)，主要是利用诱变剂体外诱变人类原始淋巴细胞株，使之生成大量的HPRT一突变体，然后进行PCR 扩增，用DGGE分析。用定量PCR／TGGE方法[13,141还可以确定标本中某特异DNA序列的拷贝数。其原理是将已知拷贝数的内参照与标本中的靶基因共同扩增，然后TGGE分离两者扩增产物，根据其比率可以确定标本中靶基因的拷贝数。

5.3检测DNA聚合酶的忠实性

DGGE还可用于检测DNA聚合酶在PCR中的忠实性口。DNA经DNA聚合酶PCR扩增后，其组成是具有一定多态性的。通过DGGE可以检测到DNA聚合酶合成时所产生的错误，从而计算该酶的忠实性。通过测序，还可以确定由DNA聚合酶导致的变异类型。

5.4在人类遗传病和肿瘤基因研究中的应用

1991年，Borresen等应用CDGE检测乳腺癌患者的p53基因，证明该方法快速有效。1995年，Kappes等应用TGGE分析了卵巢肿瘤病人中p53基因的突变。Z001年，Cordula等应用TGGE检测了皮肤的T细胞淋巴瘤。同年，我国赵永忠等应用TGGE成功地分析了非缺失型n一地中海贫血突变。

5.5在蛋白构象研究中的应用