《环境微生物检测》PPT课件

到淋巴组织，脾脏肿大， 躯干上出现红斑，胃肠
壁溃疡产生腹泻。
伤寒沙门氏菌
h
12
二、痢疾杆菌
痢疾杆菌可引起 细菌性痢疾(与阿 米巴痢疾不同)， 症状为急性腹泻， 通常大便中有血 及粘液，某些病 例中有发烧。
h
13
三、霍乱弧菌
病症：霍乱
症状：轻型病例中， 只造成腹泻。
在较严重或较典
型的病例中，除腹泻
h
2
h
3
(2) 自然沉降法
自然沉降法是靠重力的作用将空气中 携带微生物的悬浮颗粒沉陷到直径9cm的 营养琼脂培养基平皿上，经37℃，48h培养 后计生长的细菌菌落数。
h
4
由于沉降法是被动采样，会造成很大的误差。 通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出。
h
5
通常设置5个采样点，即室内墙角对角 线交点为1个采样点，该交点与四墙角连续 的中点为另外4个采样点。采样高度为 1.2～1.5m。采样点心远离墙壁1m以上，
h
16
这些寄生菌通常与人体构成互利共生关系， 当人体免疫力下降时，他们则有可能成为引起肠 炎的致病菌，他们中的个别变种还会变为极具毒 性的病菌。
如大肠埃希氏菌可引起幼儿腹泻，引起美国 和日本传染病流行的O-157也是大肠埃希氏菌的 变种菌株。
h
17
中国水质标准中规定的大肠菌群数(个／L)
饮用水
≤3
36
(2)试剂 牛肉膏蛋白陈培养基
牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g．Nacl 5.0g,水
1000mL.pH7.2~7.4
S9mix 大鼠肝匀浆S9与NADP、G-6-P、KCl、
Na2 HPO4、KH2PO4和水配成混合液。
h
37
(3)菌种鉴定 在试验之前都要进行全面的生物学特
性和敏感性鉴定，符合要求才能使用。 ①脂多糖屏障丢失 判定是否是缺陷型 ②R因子 判断菌体是否存在或失去了某种
h
29
h
30
11.3.2 发光细菌法检测的操作
目前国内外发光细菌的测定常用的有两种方法。 ①新鲜发光细菌培养测定法
即将发光菌接种于液体培养基中，在适当条 件下(20±0.5)℃振荡培养到对数生长期，配制含3 ％NaCl盐度的适当浓度的菌悬液加入测试管中， 再加入待测液，使之与菌液接触，作用5～15min 后，读出并记录对照管和样品管发光强度。此法 操作较为简便。
根据肯定有大肠菌群存在的初步发酵 试验的发酵管或瓶的数目及试验所用 的水样量，即可利用数理统计原理， 查表得出结果。
h
25
（2）膜滤法 使用的滤
膜是孔径为 0.45～ 0.65μm的微 孔滤膜；
转移至伊红美兰 平板上。
h
26
11.2.3 水微生物污染的控制
控制水体微生物的污染首先必须从源头 做起，即控制排放废水，尤其是医院废水 等微生物的含量,避免大量有害微生物进入 水体；
游泳池水
≤ 100
地表水 第一级 ≤ 500
第二级 ≤ 10000
第三级 ≤ 50000
h
18
11.2.2.1 大肠菌群检测的目的和原理
(一) 生理习性与肠道病原菌类似，即在外界的生存 时间基本一致；（代表性）
(二) 在粪便中的数量较多；（比病原菌多，不会漏 检）
(三)检验技术较简单;（操作方便）
抗药性质粒。 ③紫外线损伤修复缺陷
h
38
④自发回变
⑤回变特性——诊断性试验 ⑥组氨酸营养缺陷型
(4)操作方法 Ames试验的典型操作方法有平板掺入
试验和斑点试验两种。
h
39
11.4.2 Ames试验的应用
①检测食品添加剂、化妆品等的致突变性， 由此推测其致癌性。
②检测水源水和饮用水的致突变性，探索较 现行方法更加卫生安全的消毒措施。
出现特征
菌落
阳性
不符合
特征菌落
阴性
结论：无大肠菌群
菌落革兰氏染色
阳性
阴性
结论：无大肠菌群
h
复发酵
24
C.复发酵
目的：验证
将可疑的菌落再移植于糖类培养基中， 观察其是否发酵，是否产酸产气，最 后肯定有无大肠菌群存在。
对于自来水厂出水，初步发酵试验一 般都在10个小发酵管和2个大发酵管 (或发酵瓶)内进行，复发酵试验则在 小发酵管内进行。
并避开空调、门窗等空气流通处。检测点 数越多越准确，以20～30个测点数为宜， 最少测点数为5～6。
h
6
(3)过滤法
过滤法是在负压下抽滤空气，使空气 通过经灭菌的微孔滤膜，空气中细菌被截 留在膜上，然后将膜转移到培养基上，使 滤膜与培养基完全贴紧，倒置于37℃恒温 箱培养24h。通过计平板上的菌落数，测定 空气中细菌的数量。
其次，消除微生物兹生的环境。净化水 体，对地表水、游泳池水要进行定期检测， 必要时加入消毒剂以杀灭微生物。
h
27
11.3 发光细菌的微毒检测
发光细菌法是20世纪70年代后期提出的 一种微生物检测环境水质毒性的新方法。 发光细菌法简便、快速、灵敏、精度高， 凡有毒化合物、废水、废物的生物毒性均 可测定。
h
9
日本建议的评价空气清洁程度的标淮见表
h
10
11.2 水的微生物检测及控制 11.2.1 水质的细菌学检测
我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85关于 饮用水中的细菌标准与大肠菌群数量标准为
1．细菌总数≤100个/ml 2．大肠菌群≤ 3 个/L
h
11
一、伤寒杆菌
病症：伤寒或副伤寒。 表现：持续发烧，牵涉
第11章 环境微生物检测
h
1
11.1 空气中微生物的检测与控制
11.1.1 空气中微生物的检测方法
(1)撞击法
撞击法是采用撞击式空气微生物采 样器，通过抽气动力作用，使空气通过狭 缝或小孔而产生高速气流，使悬浮在空气 中的带菌轮子撞击到转动的营养琼脂培养 基平皿上。经37℃、48h培养，计算出每 立方米空气中所含的细菌菌落数。
h
7
空气中微生物总数目前用CFU／m3， 计量。即每立方米空气落下的细菌数，一 般以室内空气中细菌总数500－1000 CFU ／m3以作为空气污染指标。
h
8
11.1.2 空气微生物污染的控制
控制空气微生物污染，必须减少空气 中微生物的来源，特别是微生物污染严重 的医院，肉类加工等行业废水废物的处理 消毒工作；搞好室内外环境卫生。减少微 生物滋生；绿化造林也是净化市气、除尘、 杀菌和吸收有害气体的重要途径；另外空 气消毒和空气净化器对净化空气也起一定 的作用。
h
41
⑦检测农药在微生物降解前后的致突变性， 了解农药在施用后代谢过程中对人类有无 隐患。
⑧筛选抗突变物，研究开发新的抗痛药。抗 诱变因素在抗癌作用上至关重要、随着遗 传毒理学的发展，通过筛选已发现天然食 物如蔬菜类、茶叶、中草药等都员有抗诱 变作用。
h
42
11.5 生物传感器
11.5.1 生物传感器的定义与分类 传感器是能感受特定的被测量的物质
传播方式：除了饮水不卫生外，更多的是通过食物以及 昆虫血液传播
如疟疾是蚊子传播，食用生肉感染肉类寄生虫等
h
15
11.2.2 水质指示微生物——大肠菌群
大肠菌群是人肠道中正常的寄生菌， 是一群需氧和兼性厌氧的，能在37℃，24h 内使乳糖发酵产酸产气的革兰阴性无芽孢 杆菌，又称总大肠菌群。
大肠菌群作为水体被粪便污染的指标， 也是饮水、食品等的细菌学常规检验指标 之一，通常用“大肠菌群指数”和“大肠 菌群值”表示。
h
21
试验中的培养基中加入了酸碱指示剂紫色的溴甲酚紫， 产酸时指示剂变黄，同时培养基中口朝下放置了装满同 样培养基的小试管，产气时小试管中会封闭一段气体， 被作为培养中是否产气的依据。
h
22
B.平板分离
目的：鉴定产酸产气菌的染色特征、好氧与否、 芽孢特征。
根据：大肠菌群在固体培养基上可以在空气生 长，革兰氏染色呈阴性和不生芽孢的特性
③检测城市污水和工业废水的致突变性，结 合化学分析，追踪污染源，为研究防治对 策提供依据。
h
40
④检测土壤、污泥、工业废物堆肥、废物灰烬的致 突变性。以防止维系生命的土壤受致突变物污染 后，再通过农作物危害人类。
⑤检测气态污染物的致突变性，防止污染物经出大 气，通道呼吸对人体发生潜在危害。
⑥研究化合物结构与致突变性的关系。为合成对环 境无潜在危害的新化合物提供型论依据。
源自文库发光细菌法已被中国国家环境保护总局 规定为测定水环境急性毒性的国家标准。
h
28
11.3.1 发光细菌检测的原理
细菌的发光过积是菌体内一种新陈代谢的生理 过程。菌体含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要 素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微 弱荧光。
毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系， 发光细菌法就是利用灵敏的光电测量系统测定毒 物对细菌发光强度的抑制程度进而反映环境中毒 物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性 毒件。
h
23
在此阶段，先将上 一试验产酸的菌种 移植于品红亚硫酸 钠培养基(远藤氏培 养基)或伊红美蓝培 养基表面（划线接 种是为了分离出单 菌落，防治菌落不 纯干扰结果），这 一步氧气可以阻止 厌氧芽抱杆菌的生 长，而上述培养基 所含染料物质也有 抑制许多其它细菌 生长的作用。
远藤氏培养基 划线分离单菌落
h
19
11.2.2.2 大肠菌群的检测方法
常用的大肠菌群的检测方法有多管发酵法 与膜滤法。 1．多管发酵法（即最大可能数法， MPN ） 发酵法是大肠菌群测定的国家标准方法。分为 三步。 A．初发酵 目的：水中大肠菌群存在与否的初步判断。
h
20
A.初发酵
方法为将水样置于糖类液 体培养基中，在一定温度 下，经一定时间培养后， 观察有无酸和气体产生， 即有无发酵，而初步确定 有无大肠菌群存在。如采 用含有葡萄糖或甘露醇的 培养基，则包括副大肠杆 菌；如不考虑副大肠杆菌， 则用乳糖培养基。由于水 中除大肠菌群外，还可能 存在其它发酵糖类物质的 细菌，所以培养后如发现 气体和酸并不一定能肯定 水中含有大肠菌群，还需 根据这类细菌的其它特性 进行下两阶段的检验。
①在水质监测中的应用 ②在工业废水、固体废物、废气的急性毒性
检测中的应用 ③对重金属急性毒性效应的测定和评价 ④对化学品的毒性评价和安全性评价
h
33
11.4 污染物致突变性检测（Ames）试验
该试验是通过测定有污染物存在时鼠伤 寒沙门菌(Salmonella typhimurium)的组 氨酸营养缺陷型(his-)菌株发生回复突变的 概率来判断污染物的致癌、致突变效应。 其阳性结果与致癌物吻合率高达83％。
h
44
③以被测目标与分子识别元件的相互作用方 式进行分类有：生物亲和型生物传感器和 代谢型或催化型生物传感器。
三种分类方法之间互相交义，相互渗 透。
Ames试验就是通道在培养物中加入待测物， 根据不含组氨酸的培养基上组氨酸营养缺陷型茵 株长出回复突变菌落数目的多少判断待测物的致 突变性。
h
35
(1)试验菌株
采用鼠伤寒沙门菌变异株TA97，TA 98， TAl00，TAl02四种菌种，又增加了TA1535， TA1537，TA1538共七株。
h
并按照一定规律将其转换成可用信号的器 件或装置。
生物传感器是用固定化生物成分或生 物体作为敏感元件的传感器。
h
43
生物传感器的分类主要有三种方式。
①根据生物传感器中分子识别元件即敏感元 件可分为五类：酶传感器、微生物传感器、 细胞传感器、组织传感器和免疫传感器。
②根据生物传感器的换能器即信号转换器分 类有：生物电极传感器、半导体生物传感 器、光生物传感器、热生物传感器、压电 晶体生物传感器等。
h
31
②冷冻干燥发光细菌制剂测定法
即把培养到对数生长期的发光细菌， 以冷冻干燥法制成干粉剂，使用时加入冷 的2％NaCl溶液复苏，使其恢复到原来的生 理状态和发光水平，然后用于测定。这是 国家标准方法，其优点是可实行测定的质 量控制。冻干粉可长期保藏方便使用，操 作简便，节约时间。
h
32
11.3.3 发光细菌法的应用
外，症状还包括呕吐、
“米汤样”大便、腹疼
和昏迷等。病程短，
严重的常常在症状出
现后12h内死亡。
电镜照片使用的是结晶紫
单染色，若革兰氏染色则
为阴性红色
h
14
四、寄生虫
真菌一般通过接触传染，不通过水传播，
引起疾病的原生动物和小型后生动物也由水传播，通常 称为寄生虫。在目前发现的几千种原生动物中只有20种 能引起人类疾病
列为评价化学物质安全性的首选力法。
h
34
11.4.1 Ames试验的原理和方法
鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型菌株，在 不含组氨酸的培养基上不能生长。但当受到致突 变物作用后，大量细胞在遗传物质的特定座位发 生基因回复突变而成为野生型，能自行合成组氨 酸，此时培养物中虽不含组氨酸。组氨酸缺陷型 菌株亦能生长并形成菌落。