第八章荧光免疫技术
免疫学检验技术—荧光免疫技术
荧光显微镜光路图
透射荧光光路(a)
落射荧光光路(b)
三、荧光抗体染色及结果判断
• 荧光显微镜检查（结果判断）
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
“-”：无或极微弱 “+”：较弱但清晰可见
“++”：明亮
“+++”：耀眼
对照光：“-”或“±”
为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基 苯、I-等 。 * 荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；
消除非特异性荧光（本底）的干扰。
• Stokes位移 荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能
量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。 • 荧光偏振
荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并 发出单一平面的偏振荧光的现象。
知识目标
教学目标
1.熟练掌握：荧光抗体的制备及荧光抗体技术（重难点）。
2.掌握：常用的荧光物质，时间分辨荧光免疫测定（重点）、荧光偏振免 疫测定。
3.了解：荧光的基本知识、免疫芯片技术。
能力目标
1.掌握：荧光抗体技术标本的制作。
2.学会：荧光抗体染色与结果判断。
思政-素质目标
责任心、质控、生物安全意识、临床免疫学思维
（RB200 橘红）
CD4
三、关键技术
1.标本制作 2.荧光抗体染色 3.荧光显微镜检查 4.荧光抗体染色结果判读
标 组织切片：冷冻切片、石蜡切片 本 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 制 涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液 作 培养细胞：单层培养细胞
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细 胞结构欠清晰 石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第八章 荧光免疫技术
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第八章荧光免疫技术（附答案解析）1、荧光效率的决定因素是（）A、荧光素本身特性B、激发光波长C、激发光强度D、环境因素E、温度2、FITC的吸收波长为（）A、495nmB、520nmC、570nmD、450nmE、360nm3、荧光素发射荧光属于（）A、光照发光B、化学发光C、生物发光D、电化学发光E、偏振光4、纯化荧光素标记抗体时，去除游离荧光素可采用的方法是（）A、盐析法B、离子交换层析C、亲和层析D、透析法E、活性炭吸附5、下列何种方法的灵敏度最高（）A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法6、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法7、为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行对照试验。
下列选项中不必要的（）A、替代对照B、吸收试验C、阴性对照D、阳性对照E、补体对照8、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是（）A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜9、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是（）A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿10、荧光效率是（）=A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠（）A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力12、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对13、荧光免疫技术中，间接法所使用的第二抗体可以是（）A、抗种属特异性IgA荧光抗体B、抗种属特异性IgG荧光抗体C、抗种属特异性IgM荧光抗体D、以上都正确E、以上都不正14、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对15、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法16、实验本身即可避免内源性非特异性荧光干扰的检测方法为（）A、时间分辨荧光免疫测定B、荧光偏振免疫测定C、荧光酶免疫测定D、直接荧光抗体染色法E、间接荧光抗体染色法17、下述间接法描述不确切的是（）A、第一抗体为针对抗原的特异性抗体.B、第二抗体为荧光标记抗体，是针对第一抗体的抗抗体C、可用于检测抗原，也可用于检测抗体D、操作简便，特异性高E、可以用于多种抗体的检测18、下列有关间接荧光法的叙述错误的是（）A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测19、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外（）A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒20、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是（）A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光21、下列不符合荧光素标记免疫技术直接法的描述是（）A、荧光抗体直接加于标本上B、常用于抗核抗体的检测C、每检查一种抗原需制备特异的荧光素标记抗体D、灵敏度偏低E、特异性高，非特异荧光染色因素少22、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法（）A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法答案部分1、【正确答案】 A【答案解析】荧光效率的决定因素是荧光素本身特性。
荧光免疫组织化学技术
荧光免疫组织化学技术一、概述荧光免疫组织化学技术（Fluorescent Immunohistochemistry，简称IHC）是一种用来检测组织中特定蛋白质表达及其定位的重要工具。
通过使用荧光标记的抗体与组织标本中的特定抗原相结合，荧光免疫组织化学技术能够提供可视化的结果，有助于研究人员深入了解细胞和组织中蛋白质的表达模式与定位。
本文将从多个方面介绍荧光免疫组织化学技术的原理、应用、优缺点以及对研究领域的意义。
二、原理荧光免疫组织化学技术的原理基于免疫印记反应和荧光探针的特性。
待检组织标本经过特定处理，包括固定、脱水和脱脂等步骤，以保持其形态和结构。
采用特异性的抗体与目标抗原结合，形成免疫复合物。
接下来，引入荧光标记的二抗与免疫复合物发生特异性结合，形成荧光信号。
在荧光显微镜下观察和分析荧光信号，以获得有关目标抗原在组织中表达和定位的信息。
三、应用领域荧光免疫组织化学技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
在基础研究中，荧光免疫组织化学技术被用于研究组织生物学过程、发育学、疾病发生机制等。
通过定量和定位分析蛋白质的表达和定位，可以帮助科研人员深入了解蛋白质与常见疾病之间的关系。
在临床诊断中，荧光免疫组织化学技术可以用于医学实验室中针对疾病相关标志物的检测，如癌症标记物、免疫学指标等。
荧光免疫组织化学技术的高灵敏度和高特异性使其成为现代医学诊断技术中不可或缺的工具。
四、优点与挑战1. 优点：（1）高灵敏度：荧光免疫组织化学技术具有较高的灵敏度，能够检测到很低浓度下的目标抗原。
（2）高特异性：通过选择性地使用荧光标记的抗体与目标抗原结合，可以提供高度特异的检测结果。
（3）可视化结果：荧光免疫组织化学技术能够提供清晰的可视化结果，有助于研究人员直观地观察和分析目标抗原的定位和表达情况。
2. 挑战：（1）非特异性背景信号：在使用荧光免疫组织化学技术时，可能会出现非特异性背景信号，干扰对目标抗原信号的准确分析。
08第八章 荧光免疫技术
第八章
荧光免疫技术
一、CLSM的工作原理
激光束经照明针孔形成点光源，对标本内焦 平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探 测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管逐点 或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧 光图像。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
二、CLSM的参数
仪器的参数有：①物镜；②激光功率； ③激光扫描程度；④探测针孔；⑤光电倍增
换层析法;
(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固
相抗原吸收。
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第八章
荧光免疫技术
5. 荧光素标记抗体的鉴定 荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特
异性、抗体抗体特异性染色滴度。
6. 荧光记抗体的保存
加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免
反复冻融，-20℃冻存可保存1~2年，真空干燥 后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。
以及生物素、抗生物素蛋白法免疫芯片、细胞免疫
芯片。
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第八章
荧光免疫技术
1.液体芯片 一种免疫芯片与流式细胞术相结合的新技术。
将微小的乳胶颗粒（5.6um）用荧光染色的方法
进行编码，每种颜色的微粒代表一种检测标志物， 把针对不同检测物的彩色编码微粒混合后加入微 量病人标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性 地结合，通过激光流式仪判定后由电脑以数据信 息的形式记录下来。
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第八章
荧光免疫技术
FITC的衬比染色或双标记FAT， 也可单独采用 可与FITC共用488nm激发光双标 记FAT、流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 DNA染色 双激光管的仪器分析 时间分辨荧光免疫测定
免疫荧光技术
4 荧光素的荧光特性：
⑴ 停止供能，荧光现象随即终止 ⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性
入射光波长<发射光波长 ⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数
荧光效率= 吸收光的光量子数
⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱
5 常见荧光素：
⑴ FITC ⑵ RB200 ⑶ TRITC ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE ⑹ 其它
⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法
3 荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，
在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形 式释放，即发光，这种光称为荧光。
这种物质，称为荧光素
由光激发所引起的荧光，为光致荧光
------荧光免疫技术 由化学反应所引起的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ光，为化学荧光
未结合荧光素的抗体，所帶负电少， 最先洗出。
过量结合荧光素的抗体，所帶负电多， 最后洗出。
⑶ 除去非特异反应物质：
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其 它组织的组织粉预先吸收。
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液， 在用50mg/ml比例重复一次。
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的 0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的 抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗 脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后， 上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。
⑵ 除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE 纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲 液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行 分步洗脱。
实验八免疫荧光染色技术
实验八免疫荧光染色技术细胞骨架主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。
微管主要分布在核周围，呈放射状分布；微丝主要分布在细胞质膜的内侧，而中间纤维则分布在整个细胞中。
细胞骨架具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。
常用的细胞骨架的观察方法有：考马斯亮蓝R250染色法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法和间接免疫荧光法等。
考马斯亮蓝R250染色法和荧光素标记的鬼笔环肽染色法能清晰的显示出微丝结构。
本实验中采用间接免疫荧光法观察细胞中的微管蛋白，结合荧光素标记的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白。
实验原理微管是由管蛋白结构单体构成。
抗微管蛋白的抗体特异识别细胞内存在的微观蛋白，在加入荧光素偶联的二抗与一抗结合，从而使细胞内的微管间接带上荧光素。
在激发光下，荧光素发光，从而显示出细胞中微管的形态和分布。
材料和试剂培养细胞、6孔板、胰蛋白酶、完全培养基、湿盒、无水乙醇、Triton X-100、载玻片、盖玻片、指甲油（封片）。
0.01M PBS，固定液（0.01M PBS，2％葡萄糖，1％甲醛）、洗涤液（0.01mol/L PBS），封闭液（0.01mol/L PBS，2%BSA），透化液（0.25% Triton, 5mM EDTA，0.01mol/L PBS），考马斯亮蓝R250。
实验方法1.盖玻片处理，圆形盖玻片的处理： 3%醋酸浸泡盖玻片半小时，经过洗衣粉水洗净，蒸馏水冲洗三遍，再用75%的乙醇浸泡1小时以上。
于超净台中镊子取出盖玻片，过酒精灯火焰烧一下，使盖玻片上酒精及水分蒸发，最后放入12孔培养板中备用。
2.细胞爬片：经处理的盖玻片放入12孔板中，加入1x105/ml 细胞，细胞生长于盖玻片并通过细胞自身分泌的细胞外基质，粘附于盖玻片上，过夜培养后，取出玻片0.01mol/LPBS充分洗涤，5分钟洗1次；3. 固定30 min，0.01mol/L PBS洗3次，每次5分钟；4. 封闭30 min.5. 透化处理：0.2% TritonX-100的封闭液中10分钟；6. 加入anti-Tubulin抗体，室温1小时。
免疫学检测方法
ห้องสมุดไป่ตู้
图 胶体金标记免疫电镜结果 A D bar = 200 nm; B C bar = 100 nm
胶体金免疫技术
胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸 等作用下的水溶液,具有高电子密度,并能与 多种大分子发生物理吸附,因此,不但所有的 大分子物质都可被金标记,而且标记后大分 子物质活性不发生改变。
当抗原和金标抗体反应时,肉眼可见红色或 粉红色斑条 点 ,在显微镜下观察,抗原抗体 结合处为黑褐色的颗粒。
斑点免疫金渗滤法 DIGFA 的应用 与研究进展
是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法,具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和 HIV等。
第八章 免疫学检测方法
免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应 的原理建立的各种检测与分析技术,以 及建立这些技术的各种制备方法。
检测技术种类
一、免疫学检测
免疫凝集试验 免疫沉淀试验 酶联免疫试验 荧光免疫技术 免疫电镜技术 免疫印迹试验
细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应 中,将参与反应的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。
免疫金标层析法的应用与研究进展
免疫金层析法快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶 体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术
医学：乙肝表面抗原、心肌肌钙蛋白T 、 HCG
兽医：猪瘟抗体 食品：克伦特罗 瘦肉精 、氯霉素 其他：饲料中的磺胺类药物残留物、转基因产品
直接化学发光免疫分析
用吖啶酯直接标记抗体 抗原 ,与待测标本中相应的抗原 抗体 发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯 标记抗体复合物,这时只需加入氧化剂 H2O2 和NaOH使成 碱性环境,吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
关于荧光免疫技术详细介绍
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
医学免疫学荧光免疫技术资料
荧光(yíngguāng)抗体
• 荧光抗体(kàngtǐ)染色技术中常用的标记荧光物质
异硫氰酸荧光素 （FITC）
最大吸收 (xīshōu)波长
495nm
最大发射波长 525nm，黄绿色
四乙基罗丹明 （RB200）
570nm
595nm，红色
四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC）
550nm
的荧光 • 非特异性荧光 • 背景荧光 • 洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附
第九页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体染色法
• 技术类型 • 直接法 • 间接(jiàn jiē)法 • 补体结合法 • 双标记法
第十页，共18页。
• 原理(yuánlǐ)
直接(zhíjiē)法
荧光 荧光抗体
待测标本
第三页，共18页。
基质(jī zhì)片
• 将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原 • 根据标本来源不同可分为 • 组织印片、组织切片(qiē piàn)、细胞涂片、细菌涂片 • 制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存
第四页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体
• 用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成 • 荧光的基本知识 • 自然界某些物质能从外界吸收(xīshōu)能量（光能、化学能），
基本概念
• 抗原抗体反应具有高度特异性
• 荧光物质的检测具有灵敏性和直观性
• 荧光免疫技术是将两者有机的结合起来
• 将荧光物质与抗原（抗体）连接(liánjiē)，形成荧光标记物
• 再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光 强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测
• 按技术原理及用途分为
最新初级检验士考试(临床免疫学和免疫检验)练习题第八章荧光免疫技术资料
第八章荧光免疫技术一、A11、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜2、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿3、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒4、下列何种方法的灵敏度最高A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法5、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法6、免疫荧光技术的基本原理是A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对7、下列有关间接荧光法的叙述错误的是A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测8、荧光效率是（）。
A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率9、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光10、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力答案部分一、A11、【正确答案】D【答案解析】组成荧光显微镜的结构中，只有目镜与普通光学显微镜相同。
临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
①能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除
②荧光效率高 ③荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 ④结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫
离心
抗体溶液
②透析法：蛋白质含量低，样品体积小。
优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多
TITC 抗体溶液 反应过夜
PBS
FITC标记 的抗体溶液
③ 影响因素
温度和时间： pH：8.8～9.5 蛋白含量：20 ～25mg/mL蛋白为宜 荧光素的纯度：不应低于75%
四、 荧光标记抗体的纯化
常用于双重标记或对比染色；
激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。
(4)藻红蛋白（ PE） 最大吸收光谱: 565nm 。 最大发射光谱: 575nm 。 荧光颜色: 橙色。 应用：
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 铕(Eu3+)（应用最广）、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 ⑤安全无毒，不具有附加的抗原性。
2、常用的荧光色素： (1)异硫氰酸荧光素(FITC） 最大吸收光谱: 490-495nm 。 最大发射光谱: 520-530nm 。 荧光颜色: 黄绿色。 应用最广：
第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术
双抗原夹心法
固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相 抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行 酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。
荧光酶免疫测定
方法类型
固相抗原竞争法
待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤 除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留 下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原 含量成反比。
均相荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay）
荧光免疫测定的方法类型
非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：
荧光偏振免疫测定
去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法
去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收
荧光抗体的制备
荧光抗体的鉴定
荧光素与蛋白结合率：
F/P=
2.87 A495nm A280 nm 0.35 A495nm
抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
第三节 荧光免疫分析的类型
荧光免疫分析的基本原理
将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合， 用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧
光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行
定量测定。
荧光免疫技术的类型
荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光抗体技术 荧光免疫技术 荧光免疫测定
时间分辨荧光免疫测定
免疫荧光技术
免疫荧光技术荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。
这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。
与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。
国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。
近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
有关荧光的基本知识一、荧光现象（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。
荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。
可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。
由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。
荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
（二）荧光效率荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。
荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。
各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。
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第八章荧光免疫技术FluoreSCenCe ImmunoaSsay第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。
二、教学内容1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。
2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。
3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。
第二部分测试题一、选择题(一)单项选择题(A型题)1.如下有关荧光免疫技术正确的提法A．直观性检测抗原和抗体B．直观性检测抗原C．直观性检测抗体D．间接检测抗原或抗体E．间接检测抗原和抗体2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度A．10～15℃B．15～20℃C．20～25℃D．25～30℃E．30～35℃3．荧光抗体保存3～4年，应选择A．小量分装、4℃B．瓶分装、4℃C．瓶分装、-10℃D．瓶分装,-20℃E．小量分装、-20℃4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A．光源B．聚光器C．目镜D．物镜E．滤光片5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型A．直接法B．夹心法C．间接法D．补体法E．双标记法6．荧光抗体染色标本的观察时间A．当天B.第二天C．第三天D．1周内E．5天7．荧光抗体闭接法应标记A．抗原B．抗体C．补体D．抗抗体E．抗体及补体8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是A．直接法B．间接法C．双抗体夹心法D．补体法E．双标记法9．荧光抗体间接法可检测A．抗原B．抗体C.补体D．蛋白质E．抗原和抗体lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是A．抗原荧光染色B．抗体荧光染色C．补体荧光染色D．特异性荧光染色E．非特异性荧光染色11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术A．荧光偏振免疫测定B．荧光免疫显微技术C．时间分辨荧光免疫测定D．底物标记荧光免疫测定E．流式荧光免疫技术12．临床药物浓度检测的首选方法A．时间分辨荧光免疫测定B．荧光偏振免疫测定C．荧光免疫显微技术D．流式荧光免疫技术E．底物标记荧光免疫测定13．最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu)14．去除过度标记的荧光抗体最好用A.搅拌法B.透析法C.盐析法D.凝胶过滤法E.离子交换层析法15．目前使用最广泛的荧光色素为A.FITCB.RB200C.TRITCD.R-REE.Eu3+16．免疫标记技术中发展最早的技术是A.酶免疫技术B.同位素标记的免疫技术C.化学发光免疫技术D.荧光免疫技术E.免疫金银技术17．作为荧光抗体标记的荧光物质必须具备的条件中，与提高观察效果有关的是A.必须有活性化学基团B.性质稳定C.荧光效率高D.不影响蛋白质的活性E.标记方法简便快速18．决定荧光效率的因素主要是A.物质本身的物理特性B.激发光的波长C.激发光的强度D.溶剂pHE.溶剂极性19．荧光显微镜光路形式为A 衍射光、落射光B.折射光、透射光C. 透射光、落射光D.折射光、衍射光E .散射光、衍射光20．RB200产生的荧光色泽为A.橘红色B.黄绿色C.蓝紫色D.天青色E.褐黑色21．落射式荧光显微镜的吸收滤片应安装在A.激发滤片与分色镜之间B.分色镜与目镜之间C.物镜与分色镜之间D.物镜与载玻片之间E.光源与激发滤片之间22．能用于抗原定位检测的实验为A.直接法荧光抗体染色B.TRFIAC.荧光偏振免疫分析D.ELISAE.免疫比浊分析23．间接法荧光抗体染色与直接法相比,优点为A.非特异性荧光染色少B.操作更简便C.可用于抗原的定位检测D.可用于抗原定性检测E.检测不同的抗原,只需制备一种荧光抗体24．荧光免疫技术中,应用最广泛的金属元素为A.TbB.CeC.EuD.AuE.Zn25．关于直接法荧光抗体染色的特点,错误的是A.简单易行,特异性高B.敏感度偏低C.非特异性荧光染色因素少D.可检测抗原及抗体E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体26．临床常用的荧光猝灭剂不包括A.亚甲蓝B.甲基红C.碱性复红D.伊文思蓝E.碘溶液27．荧光显微镜观察时的注意事项错误的是A.暗室内观察B.染色后标本立即观察C.37℃观察,效果最好D.不宜长时间观察一个视野E.宜用无荧光镜油28．荧光显微镜与普通光学显微镜的不同之处错误的是A.光源B.滤片C.聚光镜D.电源E.镜头29.不宜用于荧光抗体染色的标本是A.血涂片B.肝印片C.肿瘤切除物切片D.细菌涂片E.尿液30.下述物质不是荧光色素的是A.异硫氰酸荧光素B.四乙基罗丹明C.四甲基异硫氰酸罗丹明D.四甲基伞酮-β-D半乳糖苷E.藻红蛋白(二)多项选择题(x型题)1．对荧光标记物影响的因素有A．pH、温度B．溴化物、碘化物等杂质C．荧光素的浓度D．细胞固定剂E．化合物2．常用的荧光素是指A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu2+)3．有关荧光显微技术中制作组织标本过程要求A．尽量保持抗原完整性B．切片尽量薄C．用丙酮或乙醇固定D．制好的标本尽快染色E．制好的标本无法及时染色，应置-20℃下低温干燥保存4．荧光免疫显微技术在临床可用于A．血清中自身抗体的检测B．各种微生物的快速检查和鉴定C．寄生虫感染的诊断D．白细胞分化抗原的检测E．HLA分型检测5．荧光显微技术在组织学检查中具有如下优点A．抗原或抗体的定位B．抗原或抗体的定性检查C．抗原抗体反应的高度特异性D．荧光标本能持久保存E．能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强6．间接荧光免疫法的优点是A．敏感性高于直接法B．制备一种荧光抗体即可检测多种抗原或抗体C．操作时间较短D．不易出现非特异荧光E．反应参与的因素多二、填空题1．荧光免疫技术的主要类型包括()和()。
2．荧光物质有()和()。
3．荧光抗体染色技术可分为()和()。
4．镧系稀土元素标记物制备的螯合剂有()、()、()和()5．荧光免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的荧光标记物而分为()和()两种类型。
6．非均相荧光免疫测定法包括()和()。
7．均相荧光免疫测定法包括()和()。
8．荧光素标记抗体的方法有()和()。
三、名词解释1．荧光免疫技术(f l u o r e s c e n c e i m m u n o a s s a y)2．荧光效率(fluorescent efficiency)3．荧光寿命(nuorescence lifetime)4．荧光的淬灭(fluorescent dyked)5．荧光素(fluorescein)6．荧光抗体(fluorescent antibody)7．非均相荧光免疫测定法(aneven phase fluoroimmunoassay)8．均相荧光免疫测定法(even phase fluoroimmunoassay)9．时间分辨荧光免疫测定(time resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA)四、问答题1．试述用于标记的荧光素应具备什么条件?2．试述荧光免疫显微技术基本原理。
3．试述荧光免疫显微技术的临床应用。
4．试述荧光偏振免疫测定基本原理。
5．时间分辨荧光免疫测定法具有哪些优点?6.简述荧光显微镜的滤片系统。
7.目前临床检验中常用的荧光物质有哪些？8.简述荧光抗体的制备及纯化方法。
六、论述题1.荧光抗体技术有哪些优缺点，在临床上有哪些应用？第三部分参考答案与题解一、选择题(一)单项选择题(A型题)1．A 2．B 3．E 4．D 5．B 6．A 7．D 8．B 9．E 10．E 11．C 12．B 13.E 14．E 15 A 16 D 17 C 18 A 19 C 20 A21 B 22A 23 E 24 C 25 D 26 B 27 C 28 D 29 E 30 D(二)多项选择题(x型题)1．ABCDE 2．ABCD、 3．ABCDE 4．ABCDE 5．ABCE 6．AB 二、填空题1．荧光抗体染色技术荧光免疫测定技术2．荧光素其他荧光素物质(镧系稀土元素)3．荧光免疫显微技术流式荧光免疫技术4．多羧基酸类螯合剂 B-二酮体类螯合剂 BCPDA，菲洛林5．均相,非均相6．时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定7．荧光偏振免疫测定底物标记荧光免疫测定8．搅拌标记法透析标记法三、名词解释1．荧光免疫技术：是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种免疫分析技术。
2．荧光效率：是指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。
3．荧光寿命：指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。
4．荧光的淬灭：指荧光分子在某些理化因素作用下、荧光分子的辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。
5．荧光素：是能产生荧光并能作为染料使用的有机化合物。
6．荧光抗体：荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成，是免疫荧光技术的关键试剂。
7．非均相荧光免疫测定法：在抗原抗体反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的Ag量，该方法称非均相荧光免疫测定法。
8．均相荧光免疫测定法：在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物失去荧光特性，则不需进行Ab*Ag与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标本中的Ag量，该方法称为均相荧光免疫测定法。
9．时间分辨荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定是用镧系稀土元素螯合物(如螯合物)标记抗体或抗原，检测标本中的相应抗原或抗体的荧光免疫测定技术。
四、问答题1．用于标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易解离，而未结合者易清除；②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
2．荧光免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术。
3．临床常应用于：①血清中自身抗体的检测；②各种微生物的快速检查和鉴定；⑧寄生虫感染的诊断；④白细胞分化抗原的检测。