GE公司培训讲义—凝胶过滤层析技术
凝胶过滤和亲和层析
三、凝胶过滤的材料 最常使用的材料是聚合的有机化合物，它们都具有立体 的孔型网状结构。 （一）、交联葡聚糖（Sephadex） 交联葡聚糖为葡聚糖与表氯醇交联得到的，改变交联度 可以得到不同类型的Sephadex。 排阻极限：被凝胶完全排阻在孔外的大分子的最低分子量， 称为凝胶的排阻极限。 吸水值：1克干胶在完全膨胀后凝胶颗粒所吸取的水量。
2）、有实际应用价值的基质
(1)纤维素 (2)交联葡聚糖 (3)琼脂糖 (4)交联琼脂糖
2、间隔臂 配位体直接和基质骨架偶联，它与互补蛋白质的相互 作用将受到空间阻碍的影响。配位体必须远离网络骨架。 一般是将配位体与基质骨架间加入一段长链，称为间隔臂。
1）、间隔臂的长度 一般认为，为了互补大分子获得最佳相互作用，配位 体与骨架间必须插入至少4到6个亚甲基的臂。然而，当互 补大分子的分子量低或与配位体亲和性高，则间隔臂长度 不像大蛋白质分子或低亲和系统中那样严格。 目前还有采用长链间隔分子的,如聚赖氨酰丙氨酸， 分子量约260,000，纯化作用较短链强。 2）、间隔臂的性质 惰性间隔分子：原认为脂肪族碳氢化合物是惰性的， 但是实验证明存在空间干扰和非特异吸附。 亲水性间隔分子：在长轴方向引入极性基团，如二级 胺、羟基、肽能极大降低非特异性吸附作用，但亲和层析 结果不好。 疏水性间隔分子： 甘氨酸倍半肽（亲水）对肝葡糖激酶吸附差 6-氨基乙酸（疏水）对肝葡糖激酶吸附好
（二）、凝胶级别的选择 1.细的（20-80μm）： 2.超细的（10-40μm）：以上二者区带窄， 分辨率高。 3.中等的（50-150μm）： 4.粗的（100-300μm）：以上二者流速快， 适用于制备，组分离。
（三）、层析柱的选择
1.柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。 2.柱内径：大小由载样量决定。 3.加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。 4.死体积：样品经柱分离后避免再混合。 5.层析床支持物：避免阻塞。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶层析的原理基于分子在固定凝胶柱上通过孔隙的能力。
凝胶是由交联的聚合物构成的，形成了许多孔隙，这些孔隙的大小和分子的大小具有相关性。
分子大小较大的物质将难以进入凝胶孔隙内，流速比较快，从而在柱体积内快速通过，出现在柱体积较大的位置；而分子大小较小的物质则能够进入凝胶孔隙内，流速比较慢，从而在柱体积内停留更长时间，出现在柱体积较小的位置。
凝胶层析的柱层结构是由一段硬基质构成，上面带有孔隙性的功能性聚合物层。
功能性聚合物的孔隙大小可以根据需要而定，常见的为分子质量在1000道尔顿到几十万道尔顿之间的分离。
当样品在凝胶柱上通过时，较小的分子能进入到凝胶层的孔隙内，流速较慢，溶液逐渐扩散。
而较大的分子无法进入到孔隙内，流速较快。
因此，凝胶层明显的区分了分子的大小。
在凝胶柱中选择的凝胶颗粒可以根据目标物质的分子量范围和理化性质进行选择。
通常使用的材料包括葡聚糖、琼脂糖、琼脂糖琼脂、琼脂糖琼脂纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶材料的孔隙大小和梯度能根据需要进行调整，以实现对样品分子的精确分离。
在进行凝胶层析的过程中，凝胶柱首先需要经过预处理，以去除杂质和活性剂。
样品可以直接在预处理后的缓冲液中加载到凝胶柱上，并在适当的流速下通过。
样品分子会在凝胶柱中发生分配，分子量较大的物质会穿过凝胶颗粒的外层，较小的分子则进入凝胶颗粒孔隙内。
这样，在整个流程中分子会逐渐分离并收集在柱底。
1.相对于其他层析技术，凝胶层析是一种非毒性和温和的技术，对生物大分子的分离影响较小。
2.凝胶层析具有良好的分辨率和高效率，可以实现对不同分子大小物质的分离。
3.凝胶层析可以在无需进行特殊环境条件下进行，如室温和常压。
4.凝胶层析可与其他分离技术如亲和层析、离子交换层析等相结合，实现更精确的纯化和分离过程。
总结起来，凝胶层析是一种基于分子大小的层析技术，通过凝胶柱的孔隙大小来实现分离物质的纯化。
它是一种相对简单且温和的分离方法，适用于大多数生物分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography
凝胶过滤层析gel filtration chromatogra phy定义凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛chromatography）、分子筛层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography）Chromatography）应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
进行脱盐、去热源和脱色。
原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。
小分子进入当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子葡聚糖珠内质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进相对分子质量较小的物质可自由地进大分子不出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移能进入珠内，经珠动速率慢而最后流出层析柱。
之间缝隙中等大小的分子在大分子物质与小分中等大小的分子在大分子物质与小分流出子物质之间被洗脱。
这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。
带网孔的葡聚糖珠固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构小分子样品流动相大分子分子筛效应：分子筛效应：按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异有差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
凝胶过滤层析资料
分类
以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水 溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。
以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机 溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶渗透层析。
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。
葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10-20μg当量的羧基基团所致。
羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到
45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环
凝胶过滤层析
gel filtration chromatogra
phy,GFC
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离
物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的
凝胶过滤与分配层析
凝胶过滤与分配层析一、凝胶过滤凝胶过滤是一种基于分子大小不同的分离技术，通过将样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子，根据分子大小不同，样品中的组分被分离。
凝胶颗粒的孔径可以控制，从而可以选择性地保留或排除特定大小的分子。
凝胶过滤主要用于蛋白质、DNA等生物分子的分离和纯化。
凝胶过滤的原理是：样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子时，分子较大的物质由于不能进入凝胶颗粒的微孔而被排斥在外，最先流出柱子；而分子较小的物质则能进入凝胶颗粒的微孔，从而被滞留在了柱子的内部。
随着淋洗液的不断流过，小分子物质会逐渐被带出柱子，而大分子物质则被不断洗脱。
凝胶过滤的应用领域广泛，如生物制药、生物化学、分子生物学等领域。
它是一种简单、快速、有效的分离方法，尤其适用于分离大分子物质。
然而，凝胶过滤的分离效果受多种因素影响，如样品浓度、柱子的长度和直径、淋洗液的性质等。
二、分配层析分配层析是一种利用样品中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同的原理进行分离的技术。
样品溶液通过装有固定相和流动相的层析柱时，各组分在两相之间进行分配。
由于不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，因此它们在层析柱中的移动速度也不同，从而达到分离的目的。
分配层析的原理是：样品溶液中的各组分在固定相和流动相之间进行分配，根据其在两相之间的分配系数不同，其移动速度也不同。
固定相是层析柱中的固体部分，流动相则是通过层析柱的液体部分。
样品溶液通过层析柱时，组分会根据其分配系数在两相之间进行动态分配，从而实现分离。
分配层析的应用领域广泛，如化学、生物化学、药物化学等领域。
它具有分离效果好、分辨率高、操作简单等优点。
然而，分配层析的分离效果受固定相和流动相的性质、层析柱的长度和直径等因素影响。
三、固定相和流动相在凝胶过滤和分配层析中，固定相和流动相都是影响分离效果的重要因素。
固定相是层析柱中的固体部分，用于吸附样品中的组分；流动相则是通过层析柱的液体部分，用于将组分从固定相中洗脱出来。
凝胶过滤层析讲解
四、加样 加样体积越小，分辨率越高。 两种蛋白洗脱体积为VeA、VeB，两种蛋白分离体 积Vs（洗脱体积之差），Vs＝VeA-VeB,
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
3)中等大小的分子，在凝胶颗粒内外均有分布，部分进 入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。
分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子 量物质的凝胶。
2）粒度的选择
目数（反映凝胶颗粒直径的大小）。目数越 大，直径越小。 每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。 细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢， 适合小型实验。层析柱选用大直径的； 粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验， 选用小直径的柱子提高分辨率。
（2） 琼脂糖凝胶
凝胶过滤层析技术z
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
9
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构
，一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、不带电荷、色谱性能好
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼
脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物
质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱 时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
Services
凝胶过滤层析过程示意图
se)
结 构
制
备
|分类与性质
凝胶
分类性质
琼脂糖凝胶 (Sepharose)
稳定性
色谱性
|分类与性质
凝胶
分类性质
交联琼脂糖 (Sepharose)
结 构
稳定性
色谱性
|分类与性质
凝胶
分类性质
新型凝胶
superose
superdex
| 基本操作
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
我们将要分离的分子分为三类
Services
6
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体流动相的 体积。（Vo） 2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（Vi） 3、基质体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（Vg） 4、柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（Vt） 5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（Ve ）
凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种分离和纯化生物大分子的常用方法。
它基于生物大分子在凝胶柱中的分子大小和形状的不同而进行分离的原理。
凝胶过滤层析的原理和操作步骤将在下文中进行详细介绍。
首先，我们来了解一下凝胶过滤层析的原理。
凝胶过滤层析的分离原理是基于生物大分子在凝胶柱中的分子大小和形状的不同而进行分离的。
凝胶柱由一种多孔的凝胶材料构成，这种凝胶材料能够形成一个三维的网络结构，生物大分子可以在这个网络结构中进行筛选。
较小的生物大分子可以进入凝胶的孔隙中，而较大的生物大分子则无法进入孔隙，因此在流经凝胶柱时，较小的生物大分子会被凝胶柱滞留，而较大的生物大分子则会通过凝胶柱。
这样就实现了生物大分子的分离。
在实际操作中，我们首先需要准备一个装有凝胶柱的层析柱。
然后将待分离的生物大分子混合物加载到凝胶柱上，并通过向凝胶柱中注入缓冲液的方式进行层析。
在缓冲液的推动下，生物大分子混合物会逐渐在凝胶柱中进行分离，较小的生物大分子会被凝胶柱滞留，而较大的生物大分子则会通过凝胶柱。
最后，我们可以通过适当的方法将滞留在凝胶柱中的生物大分子进行洗脱，从而得到纯净的生物大分子。
凝胶过滤层析的原理简单而直观，操作也相对简便，因此在生物大分子的分离和纯化中得到了广泛的应用。
它不仅可以对蛋白质、核酸等生物大分子进行分离和纯化，还可以用于生物大分子的分子量测定和构象分析。
因此，凝胶过滤层析在生物科学研究和生物制药工业中具有重要的地位。
总之，凝胶过滤层析作为一种常用的生物大分子分离和纯化方法，其原理简单直观，操作也相对简便。
通过利用凝胶柱对生物大分子进行分子大小和形状的筛选，可以实现对生物大分子的分离和纯化。
因此，凝胶过滤层析在生物科学研究和生物制药工业中具有重要的应用价值。
《凝胶层析技术》课件
将过滤后的样品加入层析柱中，确保样品均匀分布在凝胶颗 粒表面。
洗脱与分离
01
02
03
洗脱液的选择
根据待分离组分的性质选 择合适的洗脱液，如缓冲 液、有机溶剂等。
洗脱速度的控制
根据分离效果和分离时间 的要求，调整洗脱液的流 速。
洗脱分馏
通过控制洗脱液的流速和 组分的吸附特性，使不同 组分依次从凝胶层析柱中 洗脱出来。
蛋白质分离
凝胶层析技术可用于分离和纯化 蛋白质，通过凝胶颗粒的孔径大 小和电荷性质，将不同大小的蛋
白质分子进行分离。
去除杂质
凝胶层析技术可以用于去除蛋白质 样品中的杂质，如盐、DNA、 RNA等，提高蛋白质的纯度。
蛋白质定量
凝胶层析技术还可以用于蛋白质的 定量分析，通过测量洗脱液中蛋白 质的浓度，计算蛋白质的含量。
高分辨率与高灵敏度
为了满足更精细的分离需求，凝胶层析技术将向 高分辨率和高灵敏度方向发展。这需要研发新型 凝胶介质和优化分离条件，以提高分离效果。
多功能化与集成化
随着应用领域的拓展，凝胶层析技术将向多功能 化和集成化方向发展。这包括与其他分离技术的 结合，以及在微流控芯片上的集成应用，以满足 复杂样品处理的需求。
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的进步，凝胶层析技 术的自动化和智能化将成为未来的重要发展趋势 。这不仅可以提高分离效率，减少人为误差，还 能大幅减少人力成本。
高通量与快速分离
高通量和快速分离是凝胶层析技术的另一重要发 展趋势。通过改进凝胶介质和优化分离流程，可 以实现更高流速下的高效分离，缩短分离时间。
凝胶的清洗与再生
清洗
在每次使用后，用适量的 溶剂清洗凝胶层析柱，去 除残留的杂质和洗脱液。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
《凝胶过滤层析》课件
高分子材料
随着高分子合成技术的进步，新型的高分子材料将应用于凝胶过滤层析中，以提高分离效率和分辨率。
纳米材料
纳米材料具有独特的物理和化学性质，将其应用于凝胶过滤层析中，有望实现更高效的分离和更精确的检测。
自动化和智能化发展
借助人工智能和机器学习技术，对凝胶过滤层析的数据进行深度分析，为实验结果提供更准确的解释和预测。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚合形成的网状高分子凝胶，具有良好的分子筛效应。
简介
应用
优点
缺点
常用于分离蛋白质、多肽等生物小分子，也可用于制备亲和层析介质。
分离效果好、分辨率高、操作简便。
可能产生毒性，对盐浓度和pH值敏感。
凝胶过滤层析的步骤
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葡聚糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖单元组成的线性高分子凝胶，具有良好的化学稳定性和生物相容性。 分离效果好、分辨率高、操作简便。 广泛用于分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子，也可用于制备亲和层析介质。 成本较高，对盐浓度和pH值敏感。
琼脂糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的线性高分子凝胶，具有较好的机械强度和稳定性。 常用于分离DNA、RNA和蛋白质等生物大分子，也可用于制备微孔过滤介质。 机械强度高、稳定性好、成本较低。 对盐浓度和pH值敏感，可能产生拖尾现象。
凝胶过滤层析是一种基于分子大小分离蛋白质混合物的技术。
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定义
它利用具有不同孔径的凝胶作为分离介质，根据蛋白质分子的大小和形状进行分离。
凝胶过滤层析基本原理
凝胶过滤层析基本原理
凝胶过滤层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的技术方法，其基本原理是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子大小和电荷差异，将混合物中的目标分子从其他分子中分离出来。
在凝胶过滤层析中，常用的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶材料具有多孔结构，可以形成一种网络状的三维结构。
目标分子可以通过这些孔隙进入凝胶内部，而其他分子则因孔隙的大小或电荷而无法进入，从而实现目标分子的分离。
凝胶过滤层析的基本步骤包括样品加载、洗脱和分离。
首先，将混合物样品加载到凝胶柱上，样品中的分子会根据其大小和电荷的不同，以不同的速率进入凝胶内部。
然后，通过洗涤凝胶柱，将非目标分子洗脱掉，使其通过凝胶柱。
最后，目标分子可以通过改变实验条件，例如改变缓冲液pH值、离子强度等，从凝胶中洗脱出来。
凝胶过滤层析的优势在于其操作简单、成本低廉、适用范围广，可以用于分离和纯化多种生物大分子，如蛋白质、核酸等。
同时，凝胶材料的孔隙结构可调控，可以根据实验需要选择不同的凝胶材料和孔隙大小，以实现对目标分子的高效分离。
凝胶过滤层析是一种基于凝胶材料的分离技术，通过利用凝胶的孔隙结构和分子特性的差异，实现混合物中目标分子的分离和纯化。
该技术简便易行，适用范围广泛，对于生物分子的研究和应用具有
重要意义。
第五章-凝胶过滤层析PPT优秀课件
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
（1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在
颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的
分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的
颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、
沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
药品生物技术《凝胶过滤层析层析》
实验五：凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析一般可用材料有聚丙烯（或其它可用塑料）、有机玻璃、玻璃等做成的柱或柱型、筒形物体；内径从2cm－10cm不等，柱高等于内径的10－2021下端不能有吸附剂或固定相、载体流出。
柱层析的基本步骤：1．装柱：可有湿法装柱和干法装柱等两种方法。
装柱时，干法装柱与湿法装柱大同小异：吸附剂均经漏斗进入；干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，干燥的吸附剂从上端缓缓进入，前者加入空柱底，后者进入了流动相（即课本中的溶剂或者洗脱剂）。
装柱要领：柱层析的装柱比较重要，装柱的效果直接影响层析分离效果。
因此，是制备性分离的一种基本操作技能。
但是，只要做到密实均匀无气泡就大功告成。
小技巧：万一装柱时带入气泡，可从上端压入大量溶剂将气泡从下端挤出。
2．加样:又称上样或样品上柱。
多将样品溶于少量的溶剂（注：柱层析所用的洗脱剂）中，小心的加入层析柱项端的平面内；也可将样品与易挥发溶剂混合后，再与吸附剂吸收、挥干挥发性溶剂后，撒布于柱的上端；有时也可用多层圆形滤纸吸收样品溶液，再平放到柱的上端。
柱层析加样的基本要求是均匀薄饼样层。
3．洗脱：柱层析所用的溶剂，习惯上称为洗脱剂。
洗脱操作的目的当然是要将加入的样品中各个组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成分。
洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收集是关键；经验：每30分钟－1小时内流出的洗脱剂体积等于所用吸附剂的重量为宜。
凝胶色谱柱（水性）的保养与保存：凝胶色谱柱需要注意防止微生物的生长，被微生物污染后的色谱柱将无法重现原来的分离效果与柱效，严重会使凝胶色谱柱报废。
为了抑制微生物的生长，可以使用低温保存。
值得注意的是温度不能过低，以免冻结，为了不冻结可以提高保存时介质的离子强度。
常用的保存抑菌剂有：%叠氮钠、%洗必泰（hibitane，双氯苯双胍己烷）、%%三氯丁醇、l氢氧化钠。
也可以用一定量有机溶剂来保存，如2021醇。
值得注意的是，无论何种保护方式，都必须根据色谱柱的特点来进行。
凝胶层析技术(凝胶过滤)
3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上， 不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩 展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加去离子水洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。
凝胶层析示意图
目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与 甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范 围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。
其结构如图：
由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子化合物。
实验步骤
1、凝胶的预处理 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分 地膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使 柱破裂，自然溶解需24小时以上，加热至 沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿 玻棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。 凝胶床必须装得均匀，尽量一次装完，以 免出现不均匀的凝胶带，因此，在装柱时 需打开下口，并调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能 太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺旋夹。 。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术（GFC，Gel filtration chromatography）是一种基于分子大小差异的分离技术。
该技术通过在一个多孔凝胶柱中进行分离，使分子根据其大小在凝胶柱中的迁移速率不同而得到分离。
本文将详细讲解凝胶过滤层析技术的原理。
凝胶过滤层析技术的原理基于分子在多孔凝胶柱中迁移的速率与其体积大小成反比的规律。
凝胶柱中的多孔凝胶由多聚物（如聚丙烯酰胺、海藻酸钠等）构成，呈现出一定的孔径分布。
分子小于凝胶孔径的分子可以进入孔道中，而大于凝胶孔径的分子则无法进入孔道，只能沿凝胶颗粒表面通过。
因此，相对较大的分子在凝胶柱中的迁移速率更快，相对较小的分子则迁移速率较慢。
具体而言，凝胶过滤层析技术分为两个主要步骤：样品加载和洗脱。
1.样品加载：首先将待分离的样品溶液加入到凝胶柱中，样品中的各种分子根据其体积大小进入到凝胶孔道或沿凝胶颗粒表面通过。
体积较大的分子无法进入孔道，因此会快速通过凝胶柱，迁移速率较快。
体积较小的分子则能够进入孔道，受到凝胶孔道的阻碍，迁移速率较慢。
这样，样品中的不同分子就会在凝胶柱中根据其体积大小而分离。
2.洗脱：在样品加载后，需要通过洗脱来收集分离的目标分子。
洗脱过程中使用一种洗脱缓冲液，缓冲液的成分和pH值可以调整以满足对目标分子的选择性洗脱。
这样，在洗脱过程中，不同体积大小的分子将以不同的速率从凝胶柱中洗出，实现对目标分子的分离纯化。
需要注意的是，凝胶过滤层析技术不仅仅能够根据分子的大小分离，还可以用于蛋白质的分离，通过调整凝胶柱中的凝胶孔径和选择合适的缓冲液来实现蛋白质的选择性分离。
总结而言，凝胶过滤层析技术通过利用多孔凝胶柱的孔径分布特性，实现对分子根据其体积大小的分离。
通过加载样品并使用合适的洗脱缓冲液，不同体积大小的分子可以在凝胶柱中分离纯化。
这种技术简单易行，广泛应用于分子生物学、生物医学等领域的分离纯化研究中。
凝胶过滤层析的原理和应用
凝胶过滤层析的原理和应用1. 原理凝胶过滤层析是一种基于凝胶作为固定相的层析技术，通过调节凝胶的孔隙结构和性质，实现对样品中不同分子的分离和纯化。
凝胶是一种交联聚合物，可以形成一种均匀的孔隙结构，在此基础上，根据溶质的分子量和形状，通过改变溶质在凝胶中的迁移速度和扩散系数，实现对不同分子的分离。
凝胶过滤层析主要包括两个步骤：装填凝胶柱和运行层析。
在装填凝胶柱过程中，首先选择合适的凝胶，根据样品的特性和分子量范围，调节凝胶的孔隙结构和粒径大小。
然后将凝胶柱填充到层析柱中，保持一定的填充密度和均匀性。
在运行层析过程中，将待分离样品加载到凝胶柱上，通过重力、气压或离心力等方式进行传质，使样品中的分子在凝胶柱中进行分离。
较小的分子可以穿过凝胶孔隙较大的深度，迁移较远；而较大的分子由于其体积较大，只能在凝胶柱的顶端停留。
2. 应用凝胶过滤层析广泛应用于生物化学、分子生物学和生物医学等领域中的分子分离和纯化过程。
以下是凝胶过滤层析的几个主要应用领域：2.1 蛋白质分离与纯化凝胶过滤层析在蛋白质分离和纯化中起到了重要作用。
由于不同蛋白质的分子量差异较大，可以通过选择合适的凝胶柱和适当的条件，实现对蛋白质的分离。
例如，在蛋白质纯化过程中，可以使用凝胶柱将杂质分离出去；在蛋白质富集过程中，可以使用凝胶柱将目标蛋白质捕获并纯化。
2.2 DNA和RNA的分子分离凝胶过滤层析还可以用于DNA和RNA的分子分离。
由于DNA和RNA的分子量较大，并且具有不同的结构和电荷特性，可以通过调节凝胶孔隙大小和性质，实现对DNA和RNA的分离。
例如，在DNA纯化过程中，可以使用凝胶柱将杂质和DNA分离，从而得到纯净的DNA样品。
2.3 多肽和寡核苷酸的纯化凝胶过滤层析也适用于多肽和寡核苷酸的纯化。
多肽和寡核苷酸一般具有较小的分子量，可以通过选择合适的凝胶柱和操作条件，实现对多肽和寡核苷酸的纯化。
例如，在多肽合成过程中，可以使用凝胶过滤层析将多肽产物从反应混合物中分离出来。
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-pores filled with eluent 孔内充满洗脱液
-carefully controlled size range 孔径精密控制
-chemically /physically inert (lack of adsorptive properties)
1. Spherical particles packed into a column.
2. Sample applied.
3. Buffer (mobile phase) and sample
move through column.Molecules
diffuse in and out of matrix
4. Large molecules leave the column
first followed by smaller molecules in
Molecules larger than the
pass straight through.
V = void volume V = retention volume or elution volume V = total liquid volume of the bed V = inner pore volume = V V = total geometric volume of the column V = volume of gel matrix V o
V t
V c
V R1V R2 V R3 V R4
V o
V R
volume
c o n c e n t r a t i o n
非常大的分子在外水体积洗出, V o
volume
c o n c e n t r a t i o n
V t
V c
V o
V R
V = V 0+V 柱床的几何体积K d
V t
V R
volume
c o n c e n t r a t i o n
elution volume when K = 1
elution with K Adsorption has occurred.
elution with K Serious problem!
流动相中需要加入150mM NaCl av K av versus av 1
log (M r )
Exclusion limit
All molecules bigger than this elute in the void volume.均在外水体积洗出
10
log (M r )
0.7
0.1fractionation range 填料分级范围
av av Rs Rs Rs V 2 -V 1(W 1 + W 2) / 2
=
两峰相对于其峰宽而言，分开的有多远
high efficiency low efficiency
高柱效需要良好的柱填装技术高柱效有时可弥补选择性不足
lower selectivity
high selectivity
high selectivity
low selectivity
high efficiency
low efficiency
1k 10k 100k
1000k
Sephacryl S-100
40 80 120 ml
Sephacryl S-300
Sephacryl S-200
BSA
Cyt C IgG
b-L
Cytidine
AU A gel has different
fractionation ranges for native, globular proteins and random coil.
对于形状不同的分子，某填料的分级范围不同
denatured proteins 变性蛋白
1
0.7
0.1
log (M r )
native proteins 天然蛋白
Molecules with different shapes have different selectivity curves.
对于形状不同的分子，有不同的选择性曲线。
K av 1
globular proteins 球蛋白
1
log (M r )
linear polysaccharides 线性多糖
relative viscosity: 1.0relative viscosity: 4.2relative viscosity: 11.8relative viscosity: 1.0
relative viscosity: 4.2
relative viscosity: 11.8
Principles of gel filtration Optimize : How to get the expected results Content 内容
Column:Sample:Load:Buffer:组分离: 柱高< 60cm, 进样体积较大16% -44% CV
V c
Measure elution position
计算分子量大小V
R
log (M
r
)
V
R
Log(M)
V R~ Log (M r)
Superdex™200 HR 10/30
快速脱盐，置换缓冲液，去除试剂常用于对分辨率要求比较高的精细纯化!
cross-linked agarose
dextran
cross-section from Superdex™particle
葡聚糖链Tricorn Superdex10/30GL_24ml Hiload Superdex16/26 120ml /320ml
13um 34um
Superdex 200 10/300GL
Requirement :Monomer > 95%
快速得到好的分辨率l l a
b o r a t i o n w i t h N o v a v a x I n
c .
influenza virus
裂解液
3. How much sample are they loading?
-26/60 loading capacity 13 ml。