基因工程中各种工具酶的比较
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程的工具酶
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程所需要的酶
基因工程所需要的酶引言基因工程是一项重要的生物技术，它利用酶的特殊功能来改变生物体的遗传信息。
酶在基因工程中起着关键作用，它们能够催化特定的化学反应，使得基因组中的DNA序列发生改变。
本文将介绍基因工程中常用的酶以及它们在不同的应用领域中的作用。
常用酶及其功能1. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。
它们广泛应用于基因工程中的DNA重组、克隆和测序等领域。
限制性内切酶根据其识别位点和切割模式被分类为不同类型，如EcoRI、BamHI等。
这些酶可以将DNA分子切割成片段，并产生粘性或平滑末端，为后续操作提供方便。
2. DNA连接酶DNA连接酶是一种能够将两个单链DNA或RNA分子连接成一个完整双链分子的酶。
它们在基因工程中常被用于连接DNA片段，构建重组DNA分子。
T4 DNA连接酶是常用的DNA连接酶之一，它能够将DNA片段连接成环状或线性结构。
3. 核酸聚合酶核酸聚合酶是一类能够催化DNA或RNA的合成的酶。
在基因工程中，核酸聚合酶被广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）和基因克隆等领域。
其中，Taq DNA聚合酶是PCR反应中最常用的核酸聚合酶之一，它能够耐高温，并具有高度特异性和高效率。
4. 核酸修复酶核酸修复酶是一类能够修复DNA损伤和错误的酶。
在基因工程中，核酸修复酶被用于修复突变的DNA序列，纠正基因组中的错误。
CRISPR-Cas9系统利用Cas9核酸修复酶来导向性地切割和编辑目标DNA序列。
5. 核苷三磷脂转移ase核苷三磷脂转移ase（NTPase）是一类能够催化核苷三磷酸与核苷二磷酸之间的磷酸酯键转移的酶。
在基因工程中，NTPase被广泛应用于DNA合成和修饰等领域。
DNA聚合酶的活性依赖于NTPase的催化作用。
酶在基因工程中的应用1. DNA重组和克隆在基因工程中，限制性内切酶被广泛应用于DNA重组和克隆。
通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来，构建重组DNA分子。
基因工程相关酶比较
DNA聚合酶
将单个脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链
名称
作用
作用结果
其他
限制酶
识别特定脱氧核苷酸序列，并在特定的部位切割DNA
形成黏性末端或平口末端
都能破坏磷酸二酯键
DNA水解酶
将DNA水解
得到单个脱氧核苷酸
解旋酶
断开双链互补碱基间的氢键
得到2条单链DNA
需要能量（ATP）
名称
作用
共同点
DNAห้องสมุดไป่ตู้接酶
将具有相同（互补）黏性末端或平口末端的DNA片段连接起来
(1)请画出质粒被限制酶I切割后所形成的黏性末端。
(2)请画出目的基因两侧被限制酶II切割后所形成的黏性末端。
(3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后的片段是否可以连接?为什么?
【变式题2】( )如图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生了下述变化，则X酶是
A. DNA连接酶B. RNA聚合酶C. DNA聚合酶D．限制酶
A①②B.②③C.③④D.②④
【变式题1】( )已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a,b,c,d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是
A. 3 B. 4 C. 9 D. 12
2、DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
名称
作用
共同点
DNA连接酶
将具有（互补）黏性末端或平口末端的DNA片段连接起来
各种酶比较
比较剖析：限制性核酸内切酶（简称限制酶）、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA 聚合酶、反转录酶、DNA水解酶、RNA水解酶、解旋酶1．限制性核酸内切酶（简称限制酶）（1）来源：主要从微生物中分离纯化。
限制性核酸内切酶在微生物细胞中能将外来的DNA分子切断，因而能够限制异源DNA分子的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA分子却无损害作用，这样可以保护细胞自身的遗传信息。
（2）作用：识别DNA分子中某种特定核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，使磷酸二酯键断开。
（3）结果：产生黏性末端。
同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端之间正好能够互补配对，有利于DNA片段的连接，这类限制酶最常被使用。
2．DNA连接酶DNA连接酶通过形成磷酸二酯键，从而将两条DNA片段连接起来。
DNA连接酶能够将不同的DNA分子连接起来，是由于DNA分子具有相同的双链构成的双螺旋结构。
3．DNA聚合酶DNA聚合酶主要是连接单个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。
DNA 聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸分子加到已有的DNA片段上，而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
DNA聚合酶是以DNA分子一条链为模板，将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链，而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。
4．RNA聚合酶RNA聚合酶又称RNA复制酶、RNA合成酶，转录时它是以双链DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对的原则，把一个个游离的核糖核苷酸聚合成核糖核苷酸链，形成磷酸二酯键，转录完成后仍然保持DNA双链的结构；复制时它是以单链RNA为模板，按照碱基互补配对的原则，把一个个游离的核糖核苷酸聚合成核糖核苷酸链，形成磷酸二酯键，复制完成后，两条核糖核苷酸链分离。
5．反转录酶反转录酶又称逆转录酶、依赖于RNA的DNA聚合酶，它能够以RNA为模板催化合成互补DNA。
基因工程所用到的酶
基因工程所用到的酶基因工程中所用到的酶。
一、限制性核酸内切酶。
1. 作用。
- 限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA分子。
例如，EcoRⅠ识别的序列是GAATTC，它会在G和A之间切割DNA双链。
这种酶在基因工程中的作用至关重要，它就像是一把“分子剪刀”，可以将目的基因从供体DNA中精准地切割下来。
- 原因是基因工程常常需要将特定的基因片段进行分离和操作。
如果没有这种精确切割的酶，就无法准确获取目的基因，后续的基因重组等操作也就无法进行。
2. 类型。
- 限制性核酸内切酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
其中Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的类型。
- Ⅰ型限制性核酸内切酶的切割位点不固定，离识别位点较远，并且需要ATP、Mg²⁺和S - 腺苷甲硫氨酸等多种辅助因子，这使得其在基因工程中的应用受到限制。
而Ⅱ型限制性核酸内切酶只需要Mg²⁺作为辅助因子，它的识别序列和切割序列是固定的，通常是4 - 8个碱基对的回文序列，这使得它能够非常精准地切割DNA，方便基因工程操作。
Ⅲ型限制性核酸内切酶也需要多种辅助因子，且切割位点不固定，所以应用较少。
二、DNA连接酶。
1. 作用。
- DNA连接酶能够将两个具有相同粘性末端或者平末端的DNA片段连接起来。
在基因工程中，它的作用是将切割下来的目的基因与载体（如质粒）连接在一起，形成重组DNA分子。
例如，T4 DNA连接酶可以连接粘性末端和平末端的DNA片段，在构建基因表达载体时起到关键的连接作用。
- 原因是基因工程的核心是构建重组DNA分子，而将目的基因和载体连接是构建重组DNA的关键步骤。
如果没有DNA连接酶，目的基因和载体就无法形成一个完整的重组分子，也就无法将目的基因导入受体细胞进行表达。
2. 种类。
- 常见的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。
E.coli DNA连接酶只能连接粘性末端，并且需要NAD⁺作为辅助因子；而T4 DNA连接酶既能连接粘性末端，也能连接平末端，需要ATP作为辅助因子。
基因工程常用的工具酶
基因工程常用的工具酶常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系生物制药0911 刁亚军学号:2009423134引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。
本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。
这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。
限制性内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。
根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
限制性内切酶的由来一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组限制性核酸内切酶成，第四个字母表示菌株(品系)。
例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。
它能识别外源DNA并将其降解。
单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
基因工程常用工具酶及应用
DNA 连接酶
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DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
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三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
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四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
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四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
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解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
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限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
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• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
分子生物学实验常用工具酶总结
现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III （一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
分子生物学实验常用工具酶总结
分子生物学实验常用工具酶总结————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期：现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下,将基因剪切或重新组合,再导入另一生物体内,使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心:对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组ＤNA。
工具酶:在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶(restriｃｔion endonuclease)主要功能:对外源性的双链ＤNＡ进行切割、水解，不允许外源性ＤNＡ存在于细菌自身细胞内。
(这种酶能对在自身细胞内存在的DＮA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统:合成限制性内切酶的细胞,其自身的ＤNA不受酶的切割,这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶,可以对自身DNA进行修饰，即改变ＤNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的,约6０0种，可识别108种不同的特定ＤＮA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DＮA片段的5’端为P,3’端为-ﻩＯＨ。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写)＋该菌种名的前两个字母（小写）+株系的字母（小写）或数字+罗马数字(同一株菌种不同内切酶的编号）例:细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobａcter luｔeuｓＡｌu IEｓcｈerichｉa coli RY１3Eco R ＩH Hａm H IBａｃiｌlus amyｌoｌiquｅｆaciｅnsHaemoｐｈilus influeｎzae Rd ＨinｄIII（一)三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DＮＡ的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上,若ＤNA两条链菌没有发生甲基化,则行使内切酶的功能,对ＤＮA进行切割，同时转变成ATP酶。
基因工程操作的各种酶
基因工程操作的各种酶基因工程操作中涉及一系列相互关联的酶促反应。
已经知道有许多重要的核酸酶，如限制性内切核酸酶、外切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、DNA及RNA的修饰酶等，在基因工程的操作中有着广泛的用途。
1．限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3／―OH基团和5／―P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
至今发现的限制性内切核酸酶有I型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶，它们各具特性。
基因工程中所说的限制性内切核酸酶都是指Ⅱ型酶。
限制性内切核酸酶把目的基因从只有四种碱基A、T、G、C组成的DNA长链(人类D NA长度为3X109个碱基对)中准确地剪切下来。
每一种限制性内切核酸酶的识别位点是固定的，如EcoRI的识别位点是GAATTC及其互补序列CTTAAG。
1968年，沃纳?阿尔伯博士、丹尼尔?内森斯博士和汉密尔?史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶。
该酶能够在DNA上寻找到特异的“切点”，认准后将DNA 分子的双链交错地切断。
至今人们已经分离提取出400多种限制性内切核酸酶。
目前，人们可以从复杂的生物有机体基因组中，经过限制性内切核酸酶酶切消化等步骤，分离出目的基因。
因其能够特异地切割DNA分子，人们常形象的将其比作“分子剪刀”。
2．DNA连接酶DNA连接酶能够催化具有3／―OH基团和5／―P基团的DNA片段之间形成磷酸二酯键。
在基因克隆中用来连接目的基因与载体。
3．DNA聚合酶DNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3／―OH端，在基因克隆中用来补平缺口。
尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等DNA片段的体外合成与扩增技术的发展。
4．反转录酶反转录酶以RNA为模板合成DNA，即cDNA (complementaryDNA，互补DNA)。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
基因工程的工具酶
基因工程的工具酶⏹限制性核酸内切酶⏹DNA连接酶⏹DNA聚合酶⏹碱性磷酸酶⏹末端脱氧核苷酸转移酶限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。
是体外剪切基因片段的重要工具限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定防御机制:⏹任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制⏹人：免疫系统⏹细菌：限制与修饰系统寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响,因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用.这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制酶(restriction enzyme)修饰酶（modifying enzyme）核酸酶切位点：既可以在3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A)，也可以在5ˊ酯键处(B)切断磷酸二酯键1）核酸限制性内切酶的类型2）核酸限制性内切酶的基本特性3）同裂酶和同尾酶4）核酸限制性内切酶的命名法5）影响核酸限制性内切酶活性的因素限制性核酸内切酶的类型及特性按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同,分为三类:Ⅰ型Ⅱ型＊Ⅲ型第一类（I型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因如：Eco B、Eco K等第二类（II型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序）并在该顺序内的固定位置上切割双链是DNA重组技术中最常用的工具酶之一这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同⏹切割后形成具有粘性末端(cohesive end)的DNA片段⏹切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链第三类( III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
基因工程中各种工具酶的比较
单链内切核酸酶
S1核酸酶
①催化反应需Zn2+和酸性条件;②可高特异性地降解单链DNA和RNA,反应产物为5'单核苷酸;③可用于切割双链DNA的单链缺刻,但不能识别单个碱基对的错配
用于切除DNA片段的单链突出末端以产生平末端,切除发夹结构;在DNA上定位
Bal31核酸酶
对单链DNA具有特异的内切酶活性,对双链DNA表现为两种外切酶活性;降解DNA需Ca2+存在
T4多核苷酸激酶
不论5’-OH端突出与否,均能重新磷酸化
DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端
碱性磷酸酶
DNA5’端去磷酸化
防止线性化的载体分子自我连接
外切核酸酶
作用于单链
大肠杆菌外切核酸酶Ⅶ
能从单链DNA的3'末端和5'末端同时消化DNA,产生寡核苷酸片段
从PCR终末产物中去掉引物;用于测定基因组DNA中内含子和外显子的位置;回收按dA-dT加尾法插入到质粒载体上的cDNA片段
性;③5'→3'聚合酶活性(需Mg2+)
制备带放射性标记的DNA探针;合成cDNA第二链;标记DNA分子3'突出末端
Klenow片段
①3'→5'外切酶活性;②5'→3'聚合酶活性
3'→5'外切酶活性低
补平或标记3'凹陷末端;合成cDNA第二链;DNA序列分析;合成杂交探针
T4 DNA聚合酶
3'→5'外切酶活性强
作用于双链
大肠杆菌外切核酸酶Ⅲ
切割位点为3'-OH末端;反应需Mg2+或Mn2+
制备特异性的放射性探针;制备单链DNA模板;构建单向缺失
基因工程常见几种酶比较
几种酶的比较DNA聚合酶：在DNA复制时起作用，将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链（也就是DNA单链），此时形成的化学键是磷酸二酯键。
DNA解旋酶：在DNA复制或转录时起作用，将DNA的双链解开，作用对象是氢键，使氢键断裂DNA水解酶：在消化道或细胞内起作用，将DNA水解为脱氧核苷酸，作用对象是磷酸二酯键DNA连接酶：在DNA修饰过程或基因工程中起作用，将两个DNA片段连接起来，此时形成的化学键是磷酸二酯键。
下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是复习资料：几种酶的比较限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。
发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。
是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。
例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。
目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。
苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。
在基因工程中起作用。
DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。
DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。
因此DNA连接酶不需要模板。
基因工程的酶
基因工程的酶介绍基因工程是一种通过改变生物体基因组来获得特定性状的技术。
其中，酶在基因工程中发挥着重要的作用。
本文将探讨基因工程中常用的酶及其应用。
基因工程中常用酶的分类1. 切割酶切割酶，又称限制性核酸内切酶，能够识别DNA中特定的核酸序列，并在该序列的特定位置切割DNA链。
常用的切割酶包括EcoRI、BamHI等。
切割酶在基因工程中主要用于构建重组DNA。
2. 连接酶连接酶用于将不同来源的DNA片段连接在一起。
其中，最常用的连接酶是DNA连接酶，如T4 DNA连接酶，它能够在两条DNA末端之间形成磷酸二酯键，将DNA片段连接成一个整体。
3. 反转录酶反转录酶能够将RNA转录为相应的DNA，这一过程称为反转录。
在基因工程中，反转录酶常用于制备cDNA，即将RNA转录为相应的DNA模板，用于进一步的分析研究。
4. 聚合酶聚合酶是一类能够在DNA模板上合成新的DNA链的酶。
其中，最常用的聚合酶是DNA聚合酶，如Taq聚合酶。
DNA聚合酶在PCR（聚合酶链式反应）中起到至关重要的作用，实现了DNA的大规模扩增。
基因工程中酶的应用1. 重组DNA构建基因工程中的一个重要应用是构建重组DNA。
通过使用切割酶将目标基因从一种生物体中切割出来，再利用连接酶将其连接到载体DNA上，构建重组DNA。
重组DNA 可以用于基因克隆、基因转导等研究。
2. 基因突变酶在基因工程中也可以用于基因突变。
通过使用切割酶切割目标基因的特定位点，再利用连接酶连接具有不同序列的DNA片段，可以实现DNA序列的改变。
这一技术常用于研究基因功能、构建突变蛋白等。
3. 基因表达调控酶在基因工程中还可以用于基因表达调控。
例如，通过引入特定的启动子和调控元件，或利用反转录酶合成cDNA，可以实现对基因的调控。
这一技术在基因治疗、基因工程育种等领域有着广泛的应用。
4. 基因扩增聚合酶链式反应（PCR）是基因工程中的常用技术，它能够在短时间内扩增出目标基因的大量拷贝。
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分类
常用酶
作用特点
主要用途
限制性内切酶
Ⅱ型
能识别特定的序列,且切割位点特定
产生黏性末端
DNA连接酶
T4 DNA连接酶
末端必须带有3'-OH和5'-P;只能连接双链DNA分子;只能连接双螺旋DNA上的缺口,不能连接单链上的裂口
可连接DNA-RNA和RNA-RNA杂合体；反应需ATP
具强RNase H活性
①合成cDNA;②合成DNA探针;③合成cDNA第一链
鼠源
具弱RNase H活性
DNA修饰酶
末端脱氧核苷酸转移酶
需3’-OH、二甲胂酸缓冲液;不需模板;底物可为单链DNA、3’-OH突出的双链DNA或平末端（Co2+）
同聚物加尾;再生酶切位点,便于回收克隆片断;非/放射性标记DNA片断的3’端
RNA酶
核糖核酸酶A
①可特异性攻击RNA上嘧啶残基的3'端;②在无辅助因子及二价阳离子存在时,其活性可被特异性酶抑制剂Rnasin或氧钒核糖核苷复合物所抑制;③不易失活
①去除DNA:RNA或RNA:RNA杂合体中未杂合的RNA区域;②降解DNA制备物中的RNA分子;③确定DNA或RNA中单碱基突变的位置;④对RNA进行定量分析和作图
T4多核苷酸激酶
不论’-OH端突出与否,均能重新磷酸化
DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端
碱性磷酸酶
DNA5’端去磷酸化
防止线性化的载体分子自我连接
外切核酸酶
作用于单链
大肠杆菌外切核酸酶Ⅶ
能从单链DNA的3'末端和5'末端同时消化DNA,产生寡核苷酸片段
从PCR终末产物中去掉引物;用于测定基因组DNA中内含子和外显子的位置;回收按dA-dT加尾法插入到质粒载体上的cDNA片段
诱发DNA缺失突变
脱氧核糖核酸酶Ⅰ
能从嘧啶核苷酸5'端磷酸基处随机降解单链或双链DNA;当有Mg2+存在时,能在双链DNA上随机独立地产生切口;当有Mn2+存在时,可产生平末端DNA片段
切口平移位点;去除转录产物中的模板DNA
用于匀速控制DNA双链降解
单链内切核酸酶
S1核酸酶
①催化反应需Zn2+和酸性条件;②可高特异性地降解单链DNA和RNA,反应产物为5'单核苷酸;③可用于切割双链DNA的单链缺刻,但不能识别单个碱基对的错配
用于切除DNA片段的单链突出末端以产生平末端,切除发夹结构;在DNA上定位
Bal31核酸酶
对单链DNA具有特异的内切酶活性,对双链DNA表现为两种外切酶活性;降解DNA需Ca2+存在
作用于双链
大肠杆菌外切核酸酶Ⅲ
切割位点为3'-OH末端;反应需Mg2+或Mn2+
制备特异性的放射性探针;制备单链DNA模板;构建单向缺失
λ噬菌体外切核酸酶
切割位点为5’-P末端
将双链DNA转变成单链的DNA，进行DNA序列分析；移去5’突出末端，便于加尾
T7噬菌体基因6外切核酸酶
切割位点为5’-P和5’-OH末端，活性低于λ噬菌体外切核酸酶
核糖核酸酶H
可特异性地降解DNA:RNA杂合链中RNA部分,但不能降解单链或双链的DNA(或RNA)
参与合成cDNA的第二条互补链;对特定基因的表达进行调控
核糖核酸酶T1
能特异性地作用于鸟嘌呤3'-P
对RNA进行定量和作图;用于除去DNA:RNA杂合体中未杂交RNA区域
性;③5'→3'聚合酶活性(需Mg2+)
制备带放射性标记的DNA探针;合成cDNA第二链;标记DNA分子3'突出末端
Klenow片段
①3'→5'外切酶活性;②5'→3'聚合酶活性
3'→5'外切酶活性低
补平或标记3'凹陷末端;合成cDNA第二链;DNA序列分析;合成杂交探针
T4 DNA聚合酶
3'→5'外切酶活性强
反应需DTT
通过形成磷酸二酯键，将两条DNA片段连接起来
大肠杆菌DNA连接酶
不能连接DNA-RNA和RNA-RNA杂合体;反应需NAD+
反应不需巯基试剂；可被胰蛋白酶水解
热稳定DNA连接酶
反应需巯基试剂
DNA聚合酶
依赖于DNA
大肠杆菌聚合酶Ⅰ
①5'→3'外切酶活性(具有5'-P);②3'→5'外切酶活
补平隐蔽末端;DNA3’末端标记;转化为平末端
T7聚合酶
3'→5'外切酶活性最强；持续结合能力最强,且不受DNA二级结构影响
①催化大分子量DNA合成;②进行末端标记;③补平隐蔽末端
Taq DNA聚合酶
无3'→5'外切酶活性;反应需Mg2+
将PCR产物与载体相连
依赖于RNA
反转录酶
禽源
5'→3'和3'→5'外切酶活性均无