荧光光谱法

）用移液管准确移取5 mL的上层清液并定容成50 mL，贮
于棕色试剂瓶中，臵阴凉处保存。
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2、激发光和荧光波长的选择 准确移取10.0 mg·L-1VB2 标准溶液2.5 mL于25 mL容
量瓶中定容。转移部分溶液至石英比色皿中，将荧光分光
光度计的荧光波长暂定在525 nm处，在200－500 nm波长范 围内对激发波长进行扫描，记录激发光谱曲线，约在263、
3.00 mL，4.00 mL和5.00 mL．定容至50 mL。 4、标准溶液的测定 设臵适当的仪器参数, 在最佳激发波长和发射波长处从稀 到浓测量系列标准溶液的荧光强度。
5、未知试样的测定
取待测液5.0 mL臵于50 mL容量瓶中，用5% HAc溶液稀释至 刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光 强度。
荧光强度即可绘制荧光发射光谱曲线。
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A.发射光谱的波长比激发光谱的长 ， 振动弛豫消耗了能量。 B.发射光谱的形状与激发波长无关
萘的激发光谱、荧光光谱、磷光光谱
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4、荧光的影响因素
1）分子产生荧光必须具备两个条件：
① 分子必须具有与所照射的辐射频率(紫外-可见光）相适应 的结构（共轭π键），才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定 的荧光量子产率。
实验：荧光法测定维生素B2
片剂中核黄素含量
主讲教师：许 兢
一、背景知识
原子吸收
原子光谱
原子发射
原子荧光
光谱分析 分子吸收 分子光谱 分子发光
紫外-可见光谱
红外光谱
2
红外 红外
紫蓝緑 蓝 緑 黄 黄 橙 红 蓝緑 緑
波長
200nm
400nm
800nm
1、分子发光分析
分子wenku.baidu.com
吸收能量
激发为激发态
释放出能量
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五、数据处理：
1．用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作 曲线。 2．根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准 工作曲线上求得其浓度。
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问题与思考
• 激发波长与荧光波长有何关系？为什么？ • 测定过程中应注意哪些问题？
磷光是由激发三重态最低振动能层至基态得到
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3、荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱:(Ex)
以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧光最强的波长处 测量荧光强度即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为纵坐 标绘制曲线即可得到激发光谱曲线。 发射光谱：(Em)
固定激发光波长（最大）然后测定不同的波长时所发射的
对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，
使荧光强度和浓度不呈线性关系。
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6、荧光分光光度计
波长范围：200~800nm
扫描激发光谱，选择激发波长
激发单色器
最广泛应用的连续光源
光源 氙 灯
样品池
光电倍增管
问题：荧光分光光度 计与紫外-可见分光光 度计有何异同点？
光源
数据处理 仪器控制
激发 单色器
370、441 nm有三个峰。然后将激发波长设定在370 nm处，
在400－700 nm波长范围内对荧光波长扫描，记录荧光光谱 曲线，约在525 nm处荧光强度最大。从激发和发射光谱上
确定最佳的激发和发射波长。
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3、标准系列溶液的配制
在五个干净的50 mL容量瓶中，分别加入1.00 mL，2.00 mL，

f

发荧光的分子数 激发分子的总数

与化学结构有关
f

Kf Kf
Ki
与化学环境（如： 溶剂、酸度、温 度）及结构有关
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11
12
荧光量 子产率
5、溶液的荧光（或磷光）强度
If =2.3 I0 kbc
当入射光强度I0 和b一定时，上式为： If = K c
摩尔吸 光系数
吸收 光程
即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系 只有在极稀的溶液中，当 kbc0.05时才成立。
样品池 发射 单色器 检测器 数据处理 仪器控制
扫描发射光谱
发射单色器
消除干扰
7、分子荧光分析法
1） 荧光分析方法的特点 灵敏度高；选择性强；试样量少和方法简单 2）荧光定量分析的方法 标准曲线法：荧光强度与荧光物质浓度成正比关 系
方法
比较法：同样条件下，测定试样溶液和一标准溶 液的荧光强度，直接通过比例计算
基态
辐射跃迁 电能 化学能 光能
光的形式释放
非辐射跃迁
以热的形式释放
称为“发光” 光致发光 分子发光 荧光
磷光
4
化学发光
2、荧光和磷光的产生
振动能级 电子所处的能级 分子中电子 的能量状态 电子的多重态 转动能级
S=0, J=1
单重态S表示
三重态 T表示
J=2S+1
S=1, J=3
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态得到
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吸光谱图
激发光谱图
荧光
（a）吸光法
（b）荧光法
二、实验目的：
1．加深对荧光光度法原理的理解; 2．巩固荧光光度计的基本操作; 3．掌握用荧光光度法测定维生素B2的原理。
三、实验原理：
维生素B2,即核黄素
荧光性质： 水溶液在430-440 nm蓝光或 紫外光照射下会发生绿色荧光， 荧光峰在535 nm, 在pH=6-7溶液 中荧光强度最大，在pH=11的碱 溶液中荧光消失 化学性质： 对酸稳定，碱性条件下易于 分解，光敏感
四、实验步骤：
1、试剂溶液的配制
1）10.0 mg·L-1VB2标准溶液：准确称取10.0 mgVB2将其 溶解于少量的5%HAc中，转移至1L容量瓶中用5%HAc稀释 至刻度，该溶液应装于棕色试剂瓶中，臵阴凉处保存。 2）待测液：取市售VB2一片，臵于50 mL烧杯中，加入约 12mL 5%HAc溶液，用玻璃棒捣碎药片，（水浴加热使样 品由混浊变为基本透明后取下冷却，）转移并加入5%HAc 溶液定容至100 mL。（取数毫升于离心管中进行离心，