第十八章经典液相色谱法2-平面色谱分析
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仪器分析--平面色谱法
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50-17
氧化铝吸附活性：与含水量有关，水分增加， 等级增大，活性降低。
硅胶 含水量%
0 5 15
25 38
活性 等级
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅳ Ⅴ
氧化铝
含水量% 活化温度
0 3
300－400℃
6
150－300℃
10
15
100－150℃
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国药典》2010版中许多药物采用此法。
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50-12
一、薄层色谱的固定相
吸附剂，adsorbent 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
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50-13
1. 硅胶（SiO2·H2O，silica gel）
结构：内部— 硅氧交联结构→多孔结构 表面— 硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
适用范围：硅胶具有微酸性，适于分析酸性或中 性物质
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50-14
基本特性：
① 易形成氢键：与极性物质或不饱和化合物。物质 极性↑，吸附能力↑，不易洗脱。
② 吸附活性次序：活泼型>束缚型>游离型 ③ 吸附活性等级：与含水量有关，含水高，活性级
数高，吸附能力弱。
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50-2
二、平面色谱法参数
1、定性参数 ① 比移值（retardation foctor）
Rf = L / L0
可用范围：0.2～0.8 最佳范围：0.3～0.5
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50-3
② 相对比移值(relative Rf )： Rr＝Rf（i）/Rf（s）＝Li /Ls
第十八章 平面色谱法-分析化学
d
28
5、显色
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
日光下观察有色物质的色斑 紫外灯下观察荧光或无荧光色斑 通用显色剂：碘、硫酸、荧光黄
专用显色剂：茚三酮、三氯化铁
显色方法：直接喷雾法、浸渍法
d
29
四、定性与定量分析方法
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
一般在105℃～110℃加热30分钟。但加热 温度不可太高，否则易使硅胶失活：
O H + Si O H Si O 5000C Si Si + H2O
d
硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中 性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等
18
2、氧化铝
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
目视法：直接比较样品斑点与对照 品斑点的颜色深度或面积大小； 薄层扫描法
d
32
五、高效薄层色谱法(HPTLC)
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
1、高效薄层板
由较小颗粒的吸附剂(或其他固定相) 用喷雾法制备而成的均匀薄层。
2、点样 要求：原点直径小；铂-铱合金点 样毛细管、专用点样器
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
被分离物质的结构和性质 薄层板的性质，固定相的粒度， 薄层的厚度，吸附剂的活度 温度（主要对分配层析）
d
展开室内的展开剂蒸气饱和程度
7
3、分离参数
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
分离度
2d R W1 W2 R
d
12
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
2010-12-2
（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
2010-12-2
2010-12-2
3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
2010-12-2
一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
色谱分析ppt课件
➢ 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称 为分配色谱法。
➢ 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分 离的方法，称为离子交换色谱法。
➢ 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方 法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。
最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子） 的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白 质的分离。
色谱过程
吸附→解吸→再吸附→再解吸
两种组分的理化性质原本存在着微小 的差异，经过反复多次地吸附→解吸→再 吸附→再解吸的过程使微小差异累积起来， 结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱， 吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使 各个组分得到了分离。
检
测
1
2
3
器
色 谱 柱 （ 固 定 相 ）
样品组分 1＋2＋3
➢ 液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。 ➢ 超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。
随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这 种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。
2.按分离机理分类
➢ 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离 的方法，称为吸附色谱法。
在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或 液体）称为固定相 ； 自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相 ； 装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱 。
• 色谱分离中的两相是指系统具有一个有大比表面积 的固定相（stationary phase）（可以是固体或以某种 方式固定了的液体）和一个能携带待分离混合物流 过固定相的所谓流动相（mobile phase）（可以是气 体或液体）。
➢ 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分 离的方法，称为离子交换色谱法。
➢ 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方 法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。
最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子） 的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白 质的分离。
色谱过程
吸附→解吸→再吸附→再解吸
两种组分的理化性质原本存在着微小 的差异，经过反复多次地吸附→解吸→再 吸附→再解吸的过程使微小差异累积起来， 结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱， 吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使 各个组分得到了分离。
检
测
1
2
3
器
色 谱 柱 （ 固 定 相 ）
样品组分 1＋2＋3
➢ 液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。 ➢ 超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。
随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这 种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。
2.按分离机理分类
➢ 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离 的方法，称为吸附色谱法。
在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或 液体）称为固定相 ； 自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相 ； 装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱 。
• 色谱分离中的两相是指系统具有一个有大比表面积 的固定相（stationary phase）（可以是固体或以某种 方式固定了的液体）和一个能携带待分离混合物流 过固定相的所谓流动相（mobile phase）（可以是气 体或液体）。
色谱分析 平面色谱法
• • • • 1. 目视比较半定量 2. 测量斑点面积 3. 洗脱法 4. 薄层扫描法
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五、高效薄层色谱法
• 高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography； HPTLC) 所用的吸附剂颗粒很小 （5μm或10μm），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧 化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。
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Rapid determination of thermo-stability of phospholipids by TLC
Description: The thermo-stability of phospholipids and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography (TLC). A chloroformmethanol-28% aqueous ammonia solvent system (65:35:8, v/v) provided clear separation of major phospholipids (PL) and their lyso forms. The 5% (w/v) dodecamolybdophosphoric acid solution in ethanol was used as spray reagent. The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment.
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五、高效薄层色谱法
• 高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography； HPTLC) 所用的吸附剂颗粒很小 （5μm或10μm），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧 化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。
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Rapid determination of thermo-stability of phospholipids by TLC
Description: The thermo-stability of phospholipids and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography (TLC). A chloroformmethanol-28% aqueous ammonia solvent system (65:35:8, v/v) provided clear separation of major phospholipids (PL) and their lyso forms. The 5% (w/v) dodecamolybdophosphoric acid solution in ethanol was used as spray reagent. The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment.
仪器分析9-经典液相色谱法概要
2.液相色谱的固定相和流淌相
3〕常用有机吸附剂
① 聚酰胺 为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙
醇等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸稳定 性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。
2.液相色谱的固定相和流淌相
聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附，通 过分子中的酰胺羰基与酚类，或酰胺键上的游 离氨基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔 合而产生吸附。吸附的强弱则取决与各种化合 物与之形成氢键缔合的力量。
2.液相色谱的固定相和流淌相
2〕常用无机吸附剂
① 硅胶〔SiO2·H2O〕
硅胶为极性吸附剂，外表主要存在着硅羟基〔硅 醇基〕和暴露于外表的Si-O-Si键，另外还有一些硅 醇基可能与水以氢键键合。硅羟基的外表浓度在吸 附色谱中很重要，由于人们通常认为硅羟基是强吸 附位点，而Si-O-Si则是疏水性的。
氧化铝的活性与其含水量相关。
2.液相色谱的固定相和流淌相
氧化铝适宜分别溶于有机溶剂的极性、弱极 性的非强离解型的化合物，尤其适合于分别芳 香族化合物。当样品为碱性化合物时，用硅胶 分别会造成严峻吸附，此时可选用氧化铝进展 分别，但酸性易离解的化合物简洁在氧化铝上 形成死吸附。
氧化铝分别几何异构体力量优于硅胶。
2.液相色谱的固定相和流淌相
(3) 离子交换树脂的性质 1) 离子交换树脂的特性
二乙烯苯
重量交联度：树脂中所合交联剂的百分率。
树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大 的离子进入树脂便受到限制。但提高了交换的选择 性；另外，交联度大时，形成的树脂构造严密，机 械强度高。但是假设交联度过大则对水的膨胀性能 差，交换反响的速度慢，因此要求树脂的交联度一 般为8-12％。
2.液相色谱的固定相和流淌相
14经典液相色谱法2-平面色谱分析(1)全解
18.5.3 定性和定量分析
• 定性分析
依据：Rf值。
用已知标准物质作对照，在多种展开系
统中比较Rf值的大小。
或与其它分析方法联用。
• 定量分析 洗脱法 用溶剂将斑点中的组分洗脱下来，再用
适当的方法进行定量测定。
斑点需预先定位。
直接定量法：
目视比较法：
将一系列已知浓度的对照品与试样溶液 点在同一薄层板上，展开并显色后，…
讨论 可消除系统误差，提高重现性和可靠性； 相对比移值范围可以大于或小于1。
• 相平衡参数 推导比移值与分配系数的关系 已知色谱过程方程：
Vs t R t 0 (1 K ) Vm
假设溶剂流动的速度为 u 0，溶质流动的速 度为u，则对于一根长度为 L的色谱柱，溶剂 流出的时间为 L / u 0，溶质流出的时间为 L / u，
• 薄层色谱法的特点： 分离能力强，斑点集中。 灵敏度高，几微克，甚至几十纳克的物 质也能检出。 展开时间短，一般只需十至几十分钟。 一次可以同时展开多个试样
试样预处理简单，对被分离物质性质没
有限制。
点样量较大，可点成点或条状。
所用仪器简单，操作方便。
18.4.2 平面色谱法参数
• 定性参数
比移值
常见溶剂的极性由强到弱的顺序：
水>酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮> 乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯> 三氯乙烷>四氯化碳>环己烷>石油醚
如何选择吸附剂和展开剂？
用“竞争吸附”解 释
防止吸附太牢，Rf太小 被分离物质 的极性 大 小 吸附剂 的活度 小 大
展开剂极性
第十八章 高效液相色谱法 - 章节小结
一、主要内容1．基本概念（1）化学键合相：利用化学反应将有机基团键合在载体表面形成的固定相。
（2）化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。
（3）正（反）相色谱法：流动相极性小（大）于固定相极性的液相色谱法。
（4）抑制型（双柱）离子色谱法：用抑制柱消除流动相的高电导本底，以电导为检测器的离子交换色谱法。
（5）手性色谱法：利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。
（6）亲合色谱法：利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的色谱方法，是基于组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的色谱法。
（7）梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。
（8）静态流动相传质阻抗Csm：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，因而相对晚回到流路中，引起的峰展宽。
（9）键合相的含碳量：键合相碳的百分数，可通过对键合硅胶进行元素分析测定。
（10）键合相的覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
（11）封尾：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等对键合相进行钝化处理，减少残余硅醇基，即封尾。
（12）溶剂的极性参数P'：表示溶剂与三种极性物质乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子受体P'）和硝基甲烷（强偶极体）相互作用的强度。
用于度量分配色谱的溶剂强度。
P'越大，溶剂的极性越强，在正相分配色谱中的洗脱能力越强。
（13）溶剂的强度因子S：常为反相键合相色谱的溶剂洗脱能力的度量。
（14）三维光谱－色谱图：用DAD检测器检测，经过计算机处理，将每个组分的吸收光谱和试样的色谱图结合在一张三维坐标图上，即获得三维光谱-色谱图。
2．基本理论（1）速率理论在HPLC中表达式为：H=A+C m u+C s m u 用于指导实验条件的选择。
A、Cm和Csm均随固定相粒度dp变小而变小，因此保证HPLC高柱效的主要措施是使用小粒度的固定相。
第十八章 高效液相色谱法
5 10 72.1
( P2' 8.7 ) / 2
P2' 8.7 1.16 2
6.38 5.1 (1 ) 10.2
= 0.75
即调整溶剂比例为 75%甲醇和25%水可使该组分的 k 值为5。
四、正相键合相色谱法
固定相：极性键合相
如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
）。
A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响
2．用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为 流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好 的办法是（ ）。 A 增加流动相中甲醇的比例 C 流动相中加人少量HAc B 增加流动相中的水的比例 D 流动相中加人少量的氨水
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶
流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等
应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
2. 保留机制：疏溶剂理论
溶质的保留主要是溶质分子与
极性溶剂分子间的排斥力，促
P
' mix
i Pi
i 1
n
'
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。 二元混合溶剂的则为
P P B P
' AB ' A A
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。 I 组的 xe值较大， 属质子受体溶剂； VII 组的 xd 值较大，属质子给于体溶剂； V 组
仪器分析课件第十八章色谱法导论
色谱分离过程的两大特点： 第一、不同组分在通过色谱柱时移动的速度不等（差速迁 移），它提供了实现分离的可能性。 第二、各组分分子沿柱子进行扩散分布，即分子分布离散。 色谱基本理论是从微观分子运动和宏观分布平衡探讨提高分 离迁移和降低离散迁移。 色谱基本理论是从热力学和动力学两方面讨论色谱分离问题。
9
伸舌峰： 当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，
后半部分信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给 溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过 了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
17
色谱流出曲线的意义
色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
★应用范围广
(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物 等方面得到了广泛的应用。 (3)色谱分离是一种有效的提纯物质技术，用于制备分离，得到高纯样品。 (4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。
8
色谱分离原理
色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异。
（一）保留值的定义
1、保留时间 t R（retention time）
2、死时间 tM（dead time）
3、调整保留时间 t R（adjusted retention time）
4、保留体积 VR
5、死体积 VM
6、调整保留体积 VR
19
1、保留时间 t R 2、死时间 t M
从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间，称为保留时间。
9
伸舌峰： 当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，
后半部分信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给 溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过 了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
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色谱流出曲线的意义
色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
★应用范围广
(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物 等方面得到了广泛的应用。 (3)色谱分离是一种有效的提纯物质技术，用于制备分离，得到高纯样品。 (4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。
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色谱分离原理
色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异。
（一）保留值的定义
1、保留时间 t R（retention time）
2、死时间 tM（dead time）
3、调整保留时间 t R（adjusted retention time）
4、保留体积 VR
5、死体积 VM
6、调整保留体积 VR
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1、保留时间 t R 2、死时间 t M
从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间，称为保留时间。
18章高效液相色谱法
六、反相离子对色谱法
把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分离 子在流动相中与离子对试剂的反离子（或是称对离子） 生成不带电荷的中性离子对，从而增加溶质与非极性固 定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果， 适用于分离可离子化或离子型的化合物。 1、离子对模型
试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子 生成不荷电的中性离子对，然后在非极性固定相上产生 保留。
第四节 高效液相色谱分析方法
一、定性和定量分析方法
1、定性方法分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法。 2、定量方法常用外标法和内标法进行。 3、主成分自身对照法：
不加校正因子主成分自身对照法： 加校正因子主成分自身对照法： 二、高效液相色谱分离方法的选择 分离模式选择主要依据试样的性质和各种模式的分离 机制。试样的性质包括相对分子量、化学结构、极性和溶 解度等。
（1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长;
（2）均一性和重现性好;
（3）柱效高,分离选择性好;
（4）适于梯度洗脱;
（5）载样量大. 3、使用注意事项： （1）使用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化 硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）；
（2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同 的色谱特性。
（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别 将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用 作正相色谱固定相。 氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好 的分离能力。 氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性 介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分 离带羰基的物质
2、键合相的特点
高效液相色谱法的检测器要求：灵敏度高、噪声 低、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1、紫外检测器简介： 灵敏度较高、噪声低、线性范围宽，对流速 和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。 工作原理：是朗伯比尔定律，即组分的浓度与吸 光度成正比。 2、紫外检测器分类：
仪器分析平面色谱法2-精选文档
5
20世纪80年代
出现了仪器化薄层色谱法，薄层色谱的 每一步均用仪器来代替以往的手工操作， 再配以薄层扫描仪，这样就使薄层色谱 法的定量结果的重现性和准确性大大提 高。
6
平面色谱参数
定性参数 相平衡参数 面效参数 分离参数
7
（一）定性参数
比移值（Rf） Rf = L/ L0
最佳范围 0.3~ 0.5 可用范围 0.2~ 0.8
17
二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 （一）吸附剂 硅胶 氧化铝
硅胶具微酸性适于分离酸性和中性物质 氧化铝具微碱性适于分离碱性和中性物质
18
硅胶
表面带有硅醇基呈弱酸性，硅醇基与极性基 团形成氢键而表现其吸附性能，不同组分的 极性基团因与硅醇基形成氢键的能力不同而 被分离。 硅胶吸水形成水合硅醇基而失去吸附能力， 加热（105～110℃）可失去水而提高活度， 增加吸附能力，这一过程称为“活化” 。 含水量越多，级数越高，吸附能力越弱，同 一组分在此硅胶上的Rf值越大。
42
薄层色谱扫描法的定量分析
外标法 内标法 归一化法
43
外标两点法定量
m a bA 样 样
m1 m2 b A1 A2
am bA 1 1
44
七、薄层色谱的应用及实例
广泛应用于各种天然和合成有机物的分离和鉴 定，有时也可用于小量物质的精制。 药品质量监控，可用于测定药物的纯度和检查 降解产物。 在生产上可用于判断反应终点，监视反应过程。 对中药和中成药，薄层色谱鉴别应用广泛，可 鉴别有效成分，进一步进行含量测定。
平面色谱法
plane chromatography
20世纪80年代
出现了仪器化薄层色谱法，薄层色谱的 每一步均用仪器来代替以往的手工操作， 再配以薄层扫描仪，这样就使薄层色谱 法的定量结果的重现性和准确性大大提 高。
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平面色谱参数
定性参数 相平衡参数 面效参数 分离参数
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（一）定性参数
比移值（Rf） Rf = L/ L0
最佳范围 0.3~ 0.5 可用范围 0.2~ 0.8
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二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 （一）吸附剂 硅胶 氧化铝
硅胶具微酸性适于分离酸性和中性物质 氧化铝具微碱性适于分离碱性和中性物质
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硅胶
表面带有硅醇基呈弱酸性，硅醇基与极性基 团形成氢键而表现其吸附性能，不同组分的 极性基团因与硅醇基形成氢键的能力不同而 被分离。 硅胶吸水形成水合硅醇基而失去吸附能力， 加热（105～110℃）可失去水而提高活度， 增加吸附能力，这一过程称为“活化” 。 含水量越多，级数越高，吸附能力越弱，同 一组分在此硅胶上的Rf值越大。
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薄层色谱扫描法的定量分析
外标法 内标法 归一化法
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外标两点法定量
m a bA 样 样
m1 m2 b A1 A2
am bA 1 1
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七、薄层色谱的应用及实例
广泛应用于各种天然和合成有机物的分离和鉴 定，有时也可用于小量物质的精制。 药品质量监控，可用于测定药物的纯度和检查 降解产物。 在生产上可用于判断反应终点，监视反应过程。 对中药和中成药，薄层色谱鉴别应用广泛，可 鉴别有效成分，进一步进行含量测定。
平面色谱法
plane chromatography
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b.点样量和点样工具 点样毛细管，微量注射器 点样量一般以几微升为宜，毛细管大约
1cm左右。点样斑点直径以2~4mm为宜。
c.点样方法 吸取一定量的样液，轻轻接触于薄层的 点样线上，点样线一般距薄层底边 1.5~2cm， 点间距约0.8~1.5cm(新药典规定为1.5~2.0
cm)。点样后形成的原点面积越小越好，一
SN越大，说明板的容量越大。
18.5 薄层色谱法
• 主要类型
吸附薄层色谱法 正相色谱法 分配薄层色谱法 反相色谱法 分子排阻色谱法
18.5.1 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂
• 吸附剂 最常用的是硅胶、氧化铝、聚酰胺、纤维素、 葡聚糖、磷酸钙、磷酸镁、硅酸钙镁等。 硅胶： SiO2· 2O H 结构： 内部——硅氧交联结构→多孔结构 表面——有硅醇基→吸附活性中心→ 氢键作用
次加入硅胶约33g,调成糊状。去除气泡后，
将糊状的吸附剂倒在清洁的玻璃板上，使均
匀涂布于整块玻璃板上，平放自然晾干，
105℃活化1h，置干燥器中保存备用。
点样 a.样品溶液的制备 一般选用易挥发，与展开剂极性相似的 有机溶剂，如甲醇、丙酮、乙醇等。配制样 品液浓度为0.01% ~ 0.1%。 目的：使点样后溶剂能迅速挥发，减少色 斑的扩散。
实际情况比上面分析的要复杂的多。总之， 薄层色谱过程中展开剂的流速是空间、时
间的复杂函数。
显色
显色方法：
a.在日光下观察，划出有色物质的斑点
位置。
b.在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点，
并记 录颜色、位置、强弱。能发荧光的物质
或少数有紫外吸收的物质可用此法检出。
c.荧光薄层板检测。 d.显色剂显色。适用于无色，又无紫外吸 收的物质。薄层色谱常用的通用型显色剂 有碘、硫酸溶液、荧光黄溶液等。除此之 外还有专用显色剂。
锰激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫
外光下呈强烈黄绿色荧光背景。
购买时注意：
规格（主要是种类、活度级别和粒度） 常规：10～40μm 高效：5μm或10μm
氧化铝
碱性氧化铝、 中性氧化铝、酸性氧化铝
使用时可不加黏合剂，也可加煅石膏或 CMC等黏合剂； 通常使用活性级别Ⅱ～Ⅲ级。
• 展开剂
• 薄层色谱法的特点： 分离能力强，斑点集中。 灵敏度高，几微克，甚至几十纳克的物 质也能检出。 展开时间短，一般只需十至几十分钟。 一次可以同时展开多个试样
试样预处理简单，对被分离物质性质没
有限制。
点样量较大，可点成点或条状。
所用仪器简单，操作方便。
18.4.2 平面色谱法参数 播放动画
• 定性参数 比移值
吸附薄层色谱法
分配薄层色谱法
分子排阻色谱法
纸色谱法：
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、 展开、定性、和定量的液-液分配色谱法。 20世纪40年代 产生
应用于生化医药学方面的微量分析。
20世纪60年代后，
应用减少。
薄层电泳法 带电荷的被分离物在纸、醋酸纤维素、 琼脂糖凝胶及聚丙稀酰胺凝胶等惰性介质 上，向与其相反的电极方向，以不同的速 度迁移而实现分离。
常见溶剂的极性由强到弱的顺序：
水>酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮> 乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯> 三氯乙烷>四氯化碳>环己烷>石油醚
如何选择吸附剂和展开剂？
用“竞争吸附”解 释
防止吸附太牢，Rf太小 被分离物质 的极性 大 小 吸附剂 的活度 小 大
展开剂极性
大 小 防止Rf太大
1.正丁醇－水
2 0.17 0.42 0.66
3 0.10 0.44 0.88
3.乙酸乙酯－吡 2.正丁醇－乙酸 啶－水（25：10： －水（4：1：5） 35）
18.6.2 纸色谱法的实验条件 色谱纸的选择 a.要求滤纸质地均匀，应有一定的机械强度。 b.纸纤维的松紧适宜。 c.纸质应纯，杂质量要小，无明显的荧光斑点。 薄纸定性，厚纸制备或定量。 Rf值相差小 大 慢速滤纸 快速滤纸
化合物的极性应根据整个分子及组成分子
的各个基团来考虑。
CHO HC OH
CHO HO CH HO CH HC OH
HC OH CH3
CHO
CH2 HC OH
HO CH
HC OH HC OH CH2OH 葡萄糖
HC OH
HC OH CH3 洋地黄毒糖
鼠李糖
表： 三种六碳糖的Rf值 溶剂系统
糖
1 葡萄糖 鼠李糖 洋地黄毒糖 溶剂系统 0.03 0.27 0.58
K趋近0，Rf 趋近1，组分不被固定相 保留。 K趋近∞，Rf趋近0，组分停留在原点，
完全被固定相保留。
讨论 Rf 与K有关，即与组分性质（溶解度） 以及薄层板和展开剂的性质有关。 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关， 是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色
谱保留行为。
• 分离参数 分离度
R 2l2 l1 / W1 W2 2d / W1 W2
18.5.3 定性和定量分析
• 定性分析
依据：Rf值。
用已知标准物质作对照，在多种展开系
统中比较Rf值的大小。
或与其它分析方法联用。
• 定量分析 洗脱法 用溶剂将斑点中的组分洗脱下来，再用
适当的方法进行定量测定。
斑点需预先定位。
直接定量法：
目视比较法：
将一系列已知浓度的对照品与试样溶液 点在同一薄层板上，展开并显色后，…
流动相：不： 纸纤维吸附的水
滤纸纤维有较强的吸湿性，通常含 20%~25%的水。其中有6%~7%的水是以氢键 缔合的形式与纤维素上的羟基结合在一起。 一般条件下较难脱去。所以为固定相。纸纤
维是一个惰性载体。
在分离一些极性较小的物质，为了增加 其在固定相中的溶解度，常用甲酰胺或二 甲基甲酰胺、丙二醇等作为固定相。分离 酸、碱性物质，常将纸条浸过缓冲溶液。
展开剂的流速Uf
设展开剂前沿移动的距离为L 0，所用时间为t， 据测有： L 0 kt 或 L20 kt
对L 0求导： dL0 1 1/ 2 1/ 2 k Uf k t dt 2 2L 0
可见，U f 随L 0变长而变慢，并与k有关。 k 2k 0 d p cos k 0为渗透常数，d p为平均颗粒直径，为 展开剂表面张力，为展开剂粘度，为展开 剂与固定相两相间的接触角。
Rf 原点到组分斑点质量中 心的距离 原点到溶剂前沿的距离 l l0
l1 如图： A物质的 R f l0 l2 B物质的 R f l0
R f 值的范围为 0 R f 1 ， 常用范围0.2～0.8，最佳范 围0.3～0.5。
相对比移值Rr
Rr R f（被测） R f（参）
tR L / u u0 Vs 1 K t0 L / u0 u Vm
（等距展开）
l ut u 在薄层色谱中R f （定时展开) l0 u 0 t u 0
可知 1 Rf Vs 1 k 1 K Vm 1
1 Rf Vs 1 k 1 K Vm
1
K 或k R f
平面色谱法
18.4.1 平面色谱法的分类 • 定义和分类 平面色谱法(plane chromatography)是在平 面上进行分离的一种色谱方法，主要包括
薄层色谱法、纸色谱法和薄层电泳法。
薄层色谱法：
将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法。 按分离原理又可分为：
常用展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、
酚等，即含水的有机溶剂。
为了防止弱酸、弱碱的离解，加入少量 的酸或碱。如甲酸、醋酸、吡啶等。 纸色谱的操作步骤有点样、展开、显色、 定性定量分析几个步骤。
Rf值与化学结构的关系
化合物极性大或亲水性强 分配系数大 R f 值小（水为固定相）
化合物极性小或亲水脂强 分配系数小 R f 值大（水为固定相）
开展实验时，可以选用单一溶剂展开，再
根据Rf的大小，进一步调整展开剂的种类或
选用二元、三元展开剂。
分离酸性物质，可在展开剂中加入少量酸
性溶剂，如甲酸、乙酸、磷酸、草酸等 分离碱性物质，可在展开剂中加入少量碱 性溶剂，如氨水、乙二胺、二乙胺、吡啶等。
例如：用氯仿展开时，如果Rf值太小，则 大 乙醇 可加入极性___的展开剂，如_____。如 小 果Rf值太大，可加入极性____的展开剂， 环己烷、石油醚 如_______________。
薄层扫描法： 用一定波长、一定强度的光束照射薄层 上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度 的变化，从而求得物质含量的方法。精密 度为±5%。 双波长型薄层扫描仪 测定方法：透射法和反射法。 扫描方法：线形扫描和曲折形扫描
L λ1 CH PM λ2
P PM
双波长薄层扫描光学线路示意图
18.5.4 高效薄层色谱法 (high performance thin layer chromatography；HPTLC) 高效薄层色谱的分离效率比经典薄层色谱提 高三倍，每分钟可分离5个以上组分，最多可分 离40种组分。检出灵敏度提高，分析时间缩短。 高效薄层色谱法与经典薄层色谱法在吸附剂 粒度等方面不同。
表：TLC与HPTLC的比较 参数 TLC HPTLC
板尺寸(cm)
颗粒直径(μm)
颗粒分布
点样量(μl)
有效塔板数
展开距离(cm) 展开时间(min) 最小检测量：吸收(ng) 荧光(pg)
20×20 10 ~ 40 宽 1~5 >600 10 ~ 15 30 ~ 200 1~5 50 ~ 100
分离原理：
纸色谱法可以看成是溶质在固定相和流