SrRNA扩增常用引物
香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选
Ｙ ｈ ｎ ・ｕ Ｈ Ｎ Ｇ ｎ ‘ Ｈ Ｎ ｕ Ｉ ｉ －ｅ，Ｚ ＮＧ Ｙ ｎｒ Ｅ Ｓ ｅ ｇｙ ｅ，Ｃ Ｅ ａ ｇ，Ｚ Ａ Ｇ Ｈ ｉ ，ＬＵ Ｊａ ｊ Ｅ ａ— ，ＷＵ Ｈｕ— ｎ ｎｉ ｕ ｉ 。 ｍｉ
浙 江 林 学 院 学 报
２ １ ，２ （ ） ７—９ ０ ０ ７ １ ：８ ２
Ｊｕｎ ｌｆＺ ｅ ａ ｇＦ ｒｓ ｙＣ ｌ ｇ ｏ ｒａ ｈｊ ｎ ｏｅｔ ｏｌ ｅ ｏ ｉ ｒ ｅ
香 榧 Ｉ Ｓ ． Ｃ 扩 增 条 件 的优 化 和 引物 筛 选 Ｓ ＲＰ Ｒ
叶 生月 ， 陈 钢 ，张 慧 ，刘 建 杰 曾燕 如 ， ，吴 慧敏
７ ７个 Ｉ Ｓ 引 物 中 筛 选 出 ３ ＳＲ ４个适 合 香 榧 ＩＳ Ｓ Ｒ分 析 的 引物 ．且 通 过 梯 度 Ｐ Ｒ 确 定 了各 自最适 的退 火 温度 。研 究 结 果 为 Ｃ
香榧 遗 传 图谱 构建 打 下 了基 础 图 ４表 １ １ 参 ２
关键 词 ：经 济林 学 ；香 榧 ；ＩＳ Ｐ Ｓ Ｒ—ＣＲ；引 物 筛选
（． 江 林 学 院 浙 江省 现 代 森林 培 育 技 术 重点 实验 室 ，浙 江 临安 ３ １０ ；２ 浙 江 省 临 安市 林 业 局 ，浙 江 １浙 １３ ０ ．
临安 ３ １ ０ １ ３ ０）
摘 要 ： 以香 榧 Ｔ ｒ ｙ ｒｎ ｉ ‘ ｒ ｌｉ ｏｒ ａｇａ ｄｓ Ｍｅｒｌ ’基 因 组 Ｄ Ａ 为 材 料 ， 对 影 响 简单 序 列 重 复 区 间扩 增 一 合 酶 链 式 反 应 （Ｓ Ｒ ｅ ｉｉ Ｎ 聚 ＩＳ — Ｐ Ｒ） Ｃ 的 酶 用量 、Ｍ 浓度 、模板 Ｄ Ａ 用 量 、磷 酸 碱 基 脱 氧 核 苷 酸 （ Ｎ Ｐ ） 度 和 引物 浓 度 等进 行 了优 化 试 验 。优 Ｎ ｄ Ｔ ｓ浓
引物相关知识点总结大全
引物相关知识点总结大全一、引物的概念引物是指用于核酸杂交、PCR、定量PCR、DNA测序以及RNA分子的反向转录（RT）等实验技术中的一种短链DNA或RNA，通常是15-30个核苷酸的长度。
引物的主要作用是与目标序列中的互补序列形成双链结构，从而引发特定的生物学反应。
在实验室中，引物通常由合成核酸技术制备而成。
二、引物的分类根据引物作用的目标序列不同，引物可分为DNA引物和RNA引物两种。
DNA引物主要用于PCR、序列特异性分析等实验中，而RNA引物则主要用于RT-PCR等实验技术中。
根据引物的长度和作用位置不同，引物可以分为引导引物和扩增引物。
引导引物通常用于核酸杂交、PCR等实验中，用于可选择的结合目标序列，一般长度为15-30个碱基。
扩增引物则主要用于PCR实验中，其长度和序列将直接影响到PCR扩增的结果。
三、引物的设计原则1. 引物的互补性：DNA引物或RNA引物与待扩增的目标序列的互补性是引物设计的基本原则，引物与目标序列要求完全互补，并且在同一温度下具有相似的Tm值。
2. 避免引物二聚体和含量：引物的设计应避免引物自身的二聚体和寡聚体的产生，并且要避免引物的富含量，以提高PCR扩增的效率和特异性。
3. 引物的特异性：引物的设计要求尽量确保引物特异性，即引物只与目标序列特异性结合，不与其他非靶标序列结合。
4. 引物长度和GC含量：引物的长度和GC含量对PCR扩增的特异性和效率有一定的影响，一般长度在18-25个碱基，GC含量在40-60%之间。
5. 引物的5’端末修饰：引物的5’端末修饰，如磷酸化和生物素化等，可以增强引物与酶和材料的连接性和稳定性。
四、引物的应用引物作为实验室技术中的重要工具，在许多生物学实验中都扮演着重要的角色。
其主要应用包括：1. PCR扩增：PCR扩增是引物最常见的应用之一，引物特异性与目标序列的互补性可以实现PCR扩增特定基因或序列。
2. DNA测序：引物也常用于DNA测序技术中，引物和DNA降解酶一起作用可以在酶刻蚀DNA链的末端，并且通过引物的特异性与酶反应的DNA片段在随后的扩增和测序中得到全面和特异性的测序结果。
常用引物序列
常用引物序列引言引物序列是指在分子生物学实验中用来特异性引导DNA或RNA复制和扩增的短链核酸序列。
常用的引物序列在科研和实验室工作中起着重要作用。
本文将介绍几种常用引物序列及其在实验中的应用。
1. 通用引物序列通用引物序列是指适用于多种物种的引物序列。
常见的通用引物序列包括16S rRNA引物序列用于细菌和古细菌的分析，18S rRNA引物序列用于真核生物的分析，以及ITS引物序列用于真菌的分析。
这些通用引物序列具有高度保守性，可以用于不同物种的物种鉴定和进化分析。
2. 物种特异引物序列物种特异引物序列是指只在特定物种中存在的引物序列。
这些引物序列通常用于物种鉴定和种群遗传分析。
例如，人类特异引物序列可以用于人类DNA的特异扩增，从而进行人类个体的鉴定。
物种特异引物序列的选择和设计需要根据目标物种的基因组序列进行。
3. 定量引物序列定量引物序列是指用于定量PCR实验的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以通过PCR扩增目标基因的特定片段，并通过实时荧光定量PCR技术进行定量分析。
定量引物序列的设计需要考虑引物的特异性和扩增效率，以确保准确的定量结果。
4. 荧光标记引物序列荧光标记引物序列是指在引物序列上加入荧光标记分子，用于检测和定量特定基因的表达水平。
常用的荧光标记引物序列包括荧光探针和荧光引物。
荧光标记引物序列可以通过荧光定量PCR或原位杂交等技术进行检测。
5. 反向引物序列反向引物序列是指用于反转录PCR实验的引物序列。
反转录PCR是一种将RNA转录成cDNA的技术，常用于研究基因的表达调控和mRNA的定量分析。
反向引物序列通常与反向转录酶结合，将RNA逆转录成cDNA，并通过PCR扩增特定基因的cDNA片段。
6. 基因特异引物序列基因特异引物序列是指用于特定基因扩增的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以选择性地扩增目标基因，从而进行基因型鉴定和基因表达分析。
rna恒温扩增法
rna恒温扩增法
RNA恒温扩增法是一种用于扩增RNA的恒温核酸扩增技术。
相较于传统的PCR扩增技术，RNA恒温扩增无需进行多步温度循环，避免了非特异性产物的产生，提高了扩增的特异性和效率。
RNA恒温扩增法的原理是在恒温条件下，利用特定引物对RNA 进行快速、特异的扩增。
这个过程可以在42℃左右的恒温条件下进行，大大简化了实验设备的需求。
同时，该技术利用M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA
多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100~1000个）RNA拷贝。
每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。
此外，RNA恒温扩增技术具有灵敏度高、检测时间短、产物不易发生污染等优点，在临床上已经得到广泛应用。
例如，该技术可用于建立7种常见致病NTM的RNA恒温扩增实时快速检测方法（SAT），通过对临床分离株和痰标本的检测，评估其临床应用价值。
PCR扩增16SrDNA实验原理、材料和操作步骤以及常见问题分析
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•浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩
增产物太少
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三、反应体系对PCR扩增的影响
反应Buffer
Mg 2＋浓度
dNTP Mixture
•••••过过稳浓p易H高低定度值生非无剂适w,特扩盐物,当增w异增离强w性产子.剂e严物浓b重度
¾ 现象：空白对照出现目的扩增产物
1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列 吸入加样枪内或溅出离心管外；
对 策
2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有 试剂或器材均应高压消毒。所用离 心管及加样枪头等均应一次性使用。
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低 温贮存。
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问题二：非特异性扩增
1. 2. 3. 4. 5.
原
om 因
e.c 引物特异性差
物 bio 模板或引物浓度过高
生 w.e 酶量过多
对
易 w Mg2+浓度偏高
策
w 退火温度偏低
1. 重新设计引物或者使用巢 式PCR
2. 适当降低模板或引物浓度 3. 适当减少酶量 4. 降低镁离子浓度 5. 适当提高退火温度或使用
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量
2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚
4. 反应条件：退火温度太高，延 策
体和链内二级结构）或者换一
伸时间太短
管新引物
4. 降低退火温度、延长延伸时间
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•避免反复冻融
ddH2O
qPCR引物篇（5）BioTNTmRNA引物筛选，引物定制或specificprimer..
版本号：20100001BioTNTqPCR Primer Assay for specific mRNA genes目录号：SER-PCR –编号（500T）;说明书Part A一、产品简介：本试剂盒是基于最可靠的SYBR® Green-based定量real-time PCR试剂盒并应用基因表达分析。
我们的实验为基因特异性定量PCR验证具有统一、高效和标准化特点的扩增反应条件。
每一对引物都是经过严格的实验验证的。
已经使用适当的real time PCR Mix的时候，合适的片段大小和高的扩增效率成为保证。
qRT-PCR Primer pair kits统一的扩增效率和条件为荧光定量pcr实验中多基因表达的检测提供了准确而灵活的解决方案。
完整的试剂盒说明书由part A 和Part B构成。
Part A 主要描述了本试剂盒的使用方法和注意事项，Part B主要注明了assay 的特异情况。
二、产品特点：本产品适用于有一定q PCR实验经验的客户或者无经验的客户在公司的技术指导下进行。
三、保存条件：可在常温下运输。
常期保存请在-20℃保存，效期12个月。
警告：本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等其他用途。
安全提示：本产品中部分试剂有腐蚀性或毒性，请勿直接接触皮肤或吞咽；操作时请穿戴实验服、防护镜和手套；如果接触皮肤，应立即用洗涤剂和大量清水冲洗；误食或其他危急情况，请及时到医院就治；部分试剂易燃，请注意消防安全。
四、注意事项：请在收到此试剂盒后立刻检查试剂盒组成，BioTNT公司只负责受理在试剂盒签收后三个工作日内的试剂缺失报告；五、试剂盒组成：其他特点请参照Part B。
六、保证结果可使用的qPCR试剂：BioTNT real time PCR Premix 货号：A2010A0112七、其他需要自己准备的：1、耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（无菌、无酶、RNase-free；货号Axygen-MCT-150-C），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的枪头；）；2、检测的样本CDNA；3、无菌无酶的 PCR 水（货号：A2010B0X03）；4、离心机；移液器（10μL，200μL，1000μL）；5、手套，口罩。
逆转录PCR实验重要要素详解
逆转录PCR试验紧要要素详解RT—PCR 就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录 PCR（reverse transcription—PCR, RT—PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。
在 RT—PCR 中，一条RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA扩增。
逆转录（reverse transcription）是以 RNA为模板合成DNA的过程，即 RNA引导下的 DNA 合成，逆转录试验包含3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：1.引物：逆转录引物紧要有3种，包含 Oligo（dT）、Random Primers和基因特异性引物（GSP）。
其中 Oligo（dT）具有12—20个 T 碱基，而且与真核生物 mRNA的 3Poly A 尾配对，可合成全长的 cDNA，但仅扩增有 polyA尾的 mRNA，对模板质量要求高，较适合克隆试验。
而 Random Primers具有6—9个碱基，可随机识别模板并结合，适合多而杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续 qPCR试验。
基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。
所以依据不同试验需求可进行相应引物的选择。
2.逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链构成，具有聚合酶活性和很强的 RNaseH活性，它最适温度是42℃，最适 pH8.3，在高反应温度时可除掉 mRNA的二级结构对逆转录的阻拦，然而高水平的 RNaseH的活性既抑制 cDNA产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒（M—MLV），是单肽链的，有 RNA 聚合酶活性和相对较弱的 RNaseH活性，最适温度37℃，最适 pH7.6，较弱的 RNaseH活性对获得2—3kb的 mRNA的全长 cDNA 有很大好处。
狗牙根SRAP_PCR反应体系优化及引物筛选_王志勇
狗牙根SRAP -PCR 反应体系优化及引物筛选王志勇1,2,袁学军2,刘建秀2＊,郭海林2(1.南京农业大学园艺学院,江苏南京210095;2.江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京210014)摘要:利用正交设计,从M g 2+、dN T P 、引物浓度和D NA 聚合酶4种因素3个水平以及不同的模板D NA 浓度来优化狗牙根S RAP -PCR 反应体系,并对引物进行了全面筛选。
狗牙根S RAP -PC R 优化反应体系结果为:2μL 10×buffe r 、40ng 模板DN A 、M g 2+1.25mmol /L 、dN T P 260μmol /L 、引物0.2μmol /L 、T aq D NA 聚合酶1.0U ,总体积20μL 。
运用该结果从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRA P 引物34对。
优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用S RA P 标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础。
关键词:狗牙根;SRA P 标记;正交试验;体系优化;引物中图分类号:S543+.902 文献标识码:A 文章编号:1004-5759(2008)03-0079-07 目前,常用的DNA 分子标记有RFLP 、RAPD 、AFLP 和SSR 等,它们各有优缺点[1,2]。
美国加州大学蔬菜作物系Li 和Ouiros[3]于2001年在研究芸薹属(B rassica )作物中开发的一种基于PCR 的新型标记SRAP (se -quence -related amplified polym orphism ),该标记具备RFLP 、RAPD 、SSR 和AFLP 等分子的优点,克服了它们的缺点,并已经在许多植物研究中得到应用,如在构建图谱[4,5]、遗传多样性[6～8]、Q TL 定位[9]、杂种优势的预测[6]以及其他方面[10]的研究。
狗牙根属(Cynodon spp .)属禾本科(G ramineae )画眉草亚科(Eragaostoidee )虎尾草族(Chlo ridoieae )多年生草本植物[11]。
PCR扩增时引物有几种
PCR扩增时引物有几种PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在生物分子研究领域广泛应用的技术，用于扩增DNA序列。
在PCR反应中，引物起着至关重要的作用，引物的选择直接影响到反应的效果和结果。
引物是在PCR反应中与待扩增DNA序列的两端互补配对的短链寡核苷酸分子。
PCR 反应通常需要两个引物，一个是前向引物（Forward Primer），另一个是反向引物（Reverse Primer）。
引物的选择应满足几个基本原则：与目标序列互补，引物长度适中，引物的Tm值相似且合适，引物之间不得有自身互补。
在PCR扩增中，引物的设计对扩增结果至关重要。
引物的选择根据实验需要而定，常见的引物包括：1. 特异性引物特异性引物是指与目标序列完全互补的引物，它们在PCR反应中与待扩增的目标序列的两端发生互补配对，从而引发扩增反应。
特异性引物的设计需要对目标序列进行详细的生物信息学分析，确保引物与其他非目标序列不发生非特异性扩增。
2. 基因组引物基因组引物是针对整个基因组范围的引物，用于对基因组DNA进行扩增。
基因组引物可以用于扩增未知序列或进行全基因组扩增。
基因组引物的设计需要充分考虑基因组的复杂性和多样性，平衡引物长度和特异性。
3. 编码区引物编码区引物用于扩增特定基因编码区域的DNA序列。
编码区引物的设计需要结合已知的基因编码区域序列进行，通常包括该基因的外显子或启动子等区域。
编码区引物用于检测和分析特定基因的表达或突变情况。
4. 母源引物母源引物是一种针对外源DNA序列的引物，常用于检测和分析DNA样本中存在的外源物质。
母源引物的设计需要与目标外源DNA序列进行互补配对，能够鉴别和区分样本中存在的外源物质。
在PCR反应中，引物的设计和选择是非常关键的。
合理选择引物可以确保PCR反应的特异性、敏感性和效果，从而获得准确和可靠的扩增结果。
同时，引物的设计需要充分考虑引物特性、目标序列特点和预期实验结果，以确保反应的成功和有效。
PCR扩增使用的引物可以是RNA
PCR扩增使用的引物可以是RNAPCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于高效地扩增DNA分子。
在PCR反应中，引物是起到识别和扩增目标序列的关键部分。
通常情况下，PCR扩增使用的引物是DNA引物，其具有一定的长度和配对碱基序列。
然而，近年来的研究表明，PCR扩增也可以使用RNA引物，这为PCR技术的发展带来了新的可能性。
RNA引物的使用可以用于特定的实验目的，如对RNA分子的定量或特定RNA序列的扩增。
下面将详细介绍PCR扩增使用RNA引物的原理和应用。
1. RNA引物的设计和合成与DNA引物相比，RNA引物的设计和合成需要考虑更多的因素。
由于RNA的化学性质和稳定性相对较差，设计合成RNA引物需要特别谨慎。
为了确保引物的特异性和稳定性，可以通过以下几个步骤来设计和合成RNA引物：1.1 引物序列的选择选择引物序列时，需要考虑目标RNA序列的长度、碱基组成和二级结构。
在设计引物序列时，可以借助计算机软件进行模拟和分析，预测引物的特异性和二级结构。
1.2 引物的合成合成RNA引物的方法与合成DNA引物的方法类似，但需要采用RNA特有的合成试剂和技术。
例如，可以使用化学合成或酶法合成RNA引物。
1.3 引物的纯化和质检合成RNA引物后，需要经过纯化和质检的步骤。
纯化可以采用凝胶电泳或柱层析等方法，以除去杂质。
质检则可以利用质谱或其他分析技术来检测引物的纯度和化学性质。
2. RNA引物在PCR扩增中的应用PCR扩增使用RNA引物可以应用于多个研究领域和实验目的。
2.1 RNA序列的扩增在某些情况下，需要扩增特定的RNA序列。
以往的方法主要依赖于逆转录酶和PCR 扩增的组合，但这种方法效率较低且容易引入杂质。
使用RNA引物可以直接扩增目标RNA序列，提高扩增效率和特异性。
2.2 RNA分子的定量在定量RNA分子的研究中，常常需要使用引物对目标RNA进行扩增。
传统的方法主要利用反转录酶合成cDNA，然后再进行PCR扩增。
表4 主要使用的引物及序列
表4 主要使用的引物及序列序列技术在现代生物学研究中发挥着越来越重要的作用。
在进行序列分析之前，需要先选择合适的引物，以确保检测到所需的目标序列，并避免检测到不必要的杂交或引物间的相互杂交。
本文将介绍主要使用的引物及其序列。
1. 基因测序引物基因测序引物是用于测序DNA或RNA的引物。
这些引物通常包括一个DNA或RNA序列和一个与之匹配的引物序列。
常用的基因测序引物包括以下几种：- M13引物M13引物是一种通用的测序引物，用于测序单链DNA。
其序列为：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'。
- T7和SP6引物T7和SP6引物用于测序DNA文库中的克隆DNA。
其中T7引物的序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，SP6引物的序列为：5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3'。
- M13F和M13R引物M13F和M13R引物也用于测序单链DNA。
M13F引物的序列为：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'，M13R引物的序列为：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。
- T3和T7引物T3和T7引物与RNA兼容，并用于测序RNA和RNA-DNA杂交分子。
T3引物的序列为：5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGA-3'，T7引物的序列为：5'-TAATACGACTCACTATAG-3'。
2. PCR引物PCR引物是用于荧光定量PCR、数字PCR、标准PCR等技术的引物。
以下是几种常用的PCR引物：- GAPDH引物GAPDH引物用于检测人体组织中的GAPDH基因表达水平。
其序列为：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'（前引物）、5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（后引物）。
PCR引物设计汇总
PCR引物设计汇总PCR（聚合酶链反应）引物是PCR反应中的两个核酸序列，它们分别位于待扩增的DNA片段的两端。
合理设计的PCR引物是PCR反应成功的关键，它们决定了PCR扩增的特异性和效率。
1.引物长度：一般选择18-25个碱基的引物长度。
引物过短可能导致非特异性扩增，引物过长则降低扩增效率。
2.引物碱基组成：引物中尽量避免使用连续的同类碱基，如连续的A、T、C或G。
同时，引物设计中应尽量均衡使用四种碱基，避免GC含量过高或过低。
3.引物Tm值：引物的Tm值（解链温度）是很重要的参数，它决定了PCR反应的温度条件。
一般，引物的Tm应在50-60摄氏度之间，且相互之间的Tm值差别不应超过两度。
4.引物特异性：引物应具有足够的特异性，以确保只扩增目标DNA片段，避免扩增到非特异性产物。
5.引物末端：引物的3'末端不应含有碱基修饰物，以免影响引物的扩增效率。
下面是几种常见的PCR引物设计方法：1.传统引物设计方法：传统引物设计方法主要是基于DNA序列的特点进行设计。
根据待扩增DNA片段的序列信息，可以选择合适的引物位置，并确保引物的长度、碱基组成和Tm值满足设计原则。
2.引物设计软件：引物设计软件是根据一系列预先设定的算法和规则，自动设计合适的引物。
常用的引物设计软件有Primer3、Primer-BLAST等。
这些软件可以根据用户输入的目标序列信息，自动生成合适的引物序列，并提供引物的Tm值、特异性等信息。
3.引物库：引物库是包含大量已设计好的引物序列的数据库。
研究人员可以直接从引物库中选择合适的引物序列，以节省时间和精力。
常用的引物库有NCBI的PrimerBank和UCSC的Primer Database。
4.引物修饰：5.引物交互作用：引物交互作用是指多对引物之间的交叉杂交，形成二聚体或多聚体结构。
通过设计引物之间的相互作用，可以提高PCR的特异性和扩增效率。
常用的引物交互作用方法有引物交叉互补法、引物竞争法等。
16sRNA PCR 扩增及凝胶电泳分析实验报告
16sRNA PCR 扩增及凝胶电泳分析微生物学 20092474 王紫枫1、实验目的1．熟悉细菌活化及培养过程2．掌握PCR扩增技术及方法3．掌握凝胶电泳分析技术2、实验原理rRNA进化缓慢，具有高度保守性。
不同微生物的rRNA的基因序列在某些位点以不同的几率发生突变。
同时，小核糖体亚基16sRNA分子量大，携带信息量大，可作为属种鉴定的基础。
通过筛选的细菌，做活化培养后，细菌在缓冲液酶解，通过细胞破壁、裂解、离心得到RNA相关序列，在经过设定PCR相关条件。
温度、循环次数，将裂解液加入到体系中进行扩增。
在完成循环后进行凝胶电泳、拍照、序列分析。
3、实验用品供试菌种53种、编号试管每株两个LB固体和液体培养基、Mg2+、无菌水、EB Buffer、TE离心管、移液枪4、实验步骤1．将供试菌株编号，没人分得3个菌株。
2．将菌株接入固体培养基进行活化，培养24小时。
3．将活化后的菌株挑一环，接入5ml液体培养基内振荡培养16小时得到菌悬液。
4．取1.5ml菌悬液于离心管，10000转5分钟弃上清。
5．用无菌水洗涤一次，沉淀悬浮于150ul TE Bufler。
6． 将上述悬液在沸水上煮10分钟，水浴10分钟，10000转5分钟离心后，上清液于-20℃保存。
7． 取上述上清液1ul于PCR中。
8． 3小时PCR扩增。
9． 将扩增后的序列取1ul于EB，并注入电泳槽中。
10．经过电泳后的凝胶，取出于紫外荧光灯中显色，拍照并分析。
5、实验结果经过拍照，仅有2、3、6、9、22、38、39、40号扩增出了新的序列显色明显。
其他没有扩增出来的原因可能是提取过程中丢失。
另外第三块胶板没有明显变化的主要原因可能是电泳时入缓冲液使用了旧的缓冲液，并未出现预期的结果。
6、注意事项1．预制固体培养基琼脂要加够量，否则很难凝固。
2．在转接时，挑取的一环尽量多一些，肉眼可看见的状态为宜，生长期长一些。
3．缓冲液先用现配。
引物的种类及应用
引物的种类及应用引物是一种用于检测和扩增DNA序列的短链核酸序列。
其作用是在PCR（聚合酶链式反应）和其他DNA分析技术中诱导一段特定的DNA序列的复制。
引物能够与目标DNA序列的两个端点配对，并通过DNA聚合酶的催化作用引导DNA链的合成，从而扩增目标序列。
根据其长度和功能，引物可以分为以下几种类型，并在不同的应用中发挥着重要的作用：1. 寡核苷酸引物（Primer）：最常见和基础的引物类型。
它们是短序列（一般为18-25个碱基），通过与目标序列的互补配对来引导DNA合成。
一般情况下，PCR反应需要一对引物，包括一个向前扩增目标序列的“前向引物”和一个向后扩增目标序列的“反向引物”。
这些引物在PCR分析、基因克隆、DNA测序等研究中广泛应用。
2. 温度递减引物（Hot-start primers）：这种引物是一种改良型的应用于PCR 反应中的引物。
它们含有一个附加的特殊序列，该序列与引物相耐。
通过设计这样一个序列，引物在低温条件下保持折叠状态，从而防止在PCR反应混合液室温下的无特异性扩增。
温度递减引物在底物富含的PCR反应中能够提高选择性和特异性。
3. 探针（Probe）：与引物相比，探针是具有荧光标记、化学修饰等特殊功能的人工合成DNA或RNA序列。
探针能够与目标序列的特定区域发生互补配对，并用来检测特定的突变、基因表达水平、DNA甲基化等。
根据不同的检测技术和应用，探针包括荧光共振能量转移探针（FRET）、荧光素酶探针、MGB探针和Scorpion探针等。
探针广泛应用于定量PCR、FISH（荧光原位杂交）技术、癌症相关基因检测等领域。
4. MGB（Minor Groove Binding）引物：这是一种特殊的寡核苷酸引物，由寡核苷酸序列和溴分子内的小沟结合区构成。
MGB引物能够增强引物-目标DNA 间的互补性，从而提高PCR反应的特异性。
由于MGB引物具有更强的结合能力，所以在设计引物时可以使用较短的引物序列，从而降低引物间的杂交和非特异性扩增。
pcr的引物是A一段rna序列
pcr的引物是A一段rna序列PCR，即聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学实验中常用的技术，用于扩增DNA序列。
而PCR扩增的关键步骤之一就是引物的设计和选择。
引物是PCR反应中的两个短片段，它们与待扩增的DNA序列的两端互补，并作为DNA的起始点。
对于PCR扩增RNA序列的目的，我们需要使用一种特殊的引物，即A一段RNA序列。
A一段RNA序列是一种带有特定化学修饰的引物，用于在反转录反应中合成cDNA。
cDNA即互补DNA （complementary DNA），是mRNA通过反转录反应合成的DNA序列，与原始mRNA序列完全互补。
在PCR反应中使用A一段RNA序列作为引物，需要以下几个步骤：1. 引物设计：根据目标RNA序列，选择具有高互补性的区域，设计出适当长度的引物。
在引物的5'端，添加A一段RNA序列，以确保引物与RNA序列的互补性。
2. 引物合成：使用化学合成的方法合成引物序列。
确保引物的纯度和浓度，以获得可靠的PCR扩增结果。
3. PCR反应：设置PCR反应体系，包括引物、模板RNA、DNA聚合酶等。
通过一系列的温度循环，使引物与RNA序列相互结合，并逐渐扩增目标序列。
需要注意的是，PCR反应中引物的选择和设计对扩增结果具有重要影响。
合理设计的引物能够提高PCR扩增的特异性和效率，而不合适的引物可能导致扩增产物的非特异性和低产量。
总结起来，PCR的引物A一段RNA序列是一种在PCR反应中用于扩增RNA序列的特殊引物。
它的设计和选择对PCR扩增结果至关重要，需要合理设计并确保其纯度和浓度。
通过PCR技术的应用，我们可以高效地扩增RNA序列，并在相关领域的研究中取得重要的进展。
SrDNA基因的PCR扩增精讲
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶 3’
5‘
DNA 聚合酶 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
3’ 5‘
合成引物
子链延长
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
16S rDNA基因的PCR 扩增
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
3’
合成引物
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
解旋酶解链酶
5’
子链延长
PCR技术简史
生物样品
DNA片段
PCR反应中基本成分引物dNTP等的作用
P C R反应中基本成分引物d N T P等的作用TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】P C R反应中基本成分（引物、d N T P、模板等）的作用PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。
PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。
PCR()反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。
PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。
1、引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。