第八章 植物细胞培养

Production of anthocyanin
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连续培养图示：
加入培养基
排出培养基及其培养物
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3、细胞悬浮培养主要应用 1、 植物有用物质的生产 2、诱发和筛选突变体 3、原生质体培养和细胞分离 4、食品生产。
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（云杉） （海藻酸钙凝胶）
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Synthetic seeds of Mulberry and banana
含义:将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合 后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。 用途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、 遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广 泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。
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固体平板培养图示：
B 特点
优点： （1）可以定点观察； （2）分离单细胞系容易；
缺点： 培养细胞气体交换不畅。
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C、看护培养特点：
优点： （1）简便易行。 （2）效果好，易于成功。
缺点： 不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
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（2）、微室培养法（Microculture）
A 微室培养的含义及用途 含义:将单细胞培养在少量的培养基中。 用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形 成细胞团的过程。
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微室培养图示：
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本章小结：
1、单细胞的分离方法:1)愈伤组织诱导;2)单细胞悬浮 液的制备 2、单细胞培养的方法:（1）、看护培养法;(2)微室培 养法;(3)平板培养法 3、平板培养的基本技术 （1）单细胞悬浮液的制备 (2)悬浮细胞密度的调制 （3）琼脂培养基配制:0.7 % 琼脂条件培养基。 （4）平板制作 （5) 培养

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1、单细胞的分离
机械法
酶解法
愈伤组织分离单细胞
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机械法：将外植体捣碎，通过过
滤和离心分离得到活的细胞。
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第一种方法
研究材料：成熟花生叶片 方法：A
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、撕去表皮 B 、叶肉细胞暴露 C、 小刀刮 D、离体培养
第二种方法
A、表面消毒
B、叶片1cm方块
含义及特点 A、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养
基中进行的无菌培养
B、特点
1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体， 适于大规模培养； 2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细 胞的生长、分化创造方法和条件。
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C、悬浮培养类型和方法
成批培养 连续培养
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成批培养/分批培养（Batch culture）
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第8章 细胞培养
观点：
高等植物的组织和器官可以 分割成单个细胞
小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞 和虎眼万年青属表皮细胞
Haberlandt：
首次进行离体细胞培养
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概念：

细胞培养：在离体条件下对单个细胞或 小的细胞团进行培养，使其增殖的技术。
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细胞培养的优点：
操作简单 重复性好 群体大 能产生单细胞系
含义：将愈伤组织培养在一定容积的密
闭容器中进行培养。它是进行细胞生 长 和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方 法。
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A、成批培养特点
（1）培养基体积固定； （2）必须适当搅拌； （3）培养过程中，细胞生长，其数目 不 断发生变化，呈S增长； （4）但要进行下一批培养，则生长一 定时间后，需要继代转移。

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细胞生长曲线
培 养 细 胞 数 目
5
4 3 1 2
培养时间
1 2 3 4 5
延迟期 对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期
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B、成批培养的方法
(1)旋转培养 (2)往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 (4)搅动培养
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（2）、连续培养（Continuous culture） 含义：指在培养过程中，以不断抽取悬
条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或
细胞的液体培养基。
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（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ） 条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。 (4) 培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微镜 观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率 （也称植板率）。
植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百
浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培 养物不断得到养分补充，保持其恒定体 积的培养。
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A、连续培养的特点：
（1）新鲜培养基的不断加入,保证了 养分的充分供应； （2）可使细胞保持在增殖旺盛的对 数生长期中； （3）适于大规模工业化生产
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B、连续培养的种类：
(1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的 悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液 (2)连续培养： 封闭式和开放式
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2、单细胞培养
2.1单细胞的分离
分离的单细胞
看护培养 微室培养 平板培养
单细胞无性系
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制备单细胞:
愈伤组织或悬浮培养物(常); 用纤维素酶和果胶酸酶从组织分离
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由组织器官经愈伤组织分离单细胞
步骤： 茎段
1） 诱导产生愈伤组织； 2） 愈伤组织反复继代，使组 织不断增殖，提高愈伤组织松 散性；
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本章小结：

4、影响单细胞培养的因子:1)条件培养基;2)初始细胞植 板密度(>临界密度);3)生长物质;4)pH;5)CO2 5、细胞悬浮培养方法：成批培养；连续培养。 6、成批培养的方法。 7、连续培养的种类：(1)半连续培养；(2)连续培养。 8、连续培养的方法:（1）浊度恒定法;（2）化学恒定法 9、细胞悬浮培养的应用：（1）植物有用物质的生产； （2）诱发和筛选突变体；（3）用于原生质体培养和细 胞器分离；（4）食品生产
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3）将愈伤组织在液体培养基中培养， 建立悬浮培养物
优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基 中均匀分布；有空气交流。
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2.2单细胞培养方法（Single cell culture）
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单细胞培养常用的方法：
单细胞培养方法
看护来自百度文库养法 微室培养法
固体平板培养法
液体浅层培养法
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（1）、看护培养法（Nurse culture）
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植物组织培养
第八章 植物细胞培养
大 家 好 ！
第8章 细胞培养
本章主要内容(2学时)
单细胞培养
细胞悬浮培养
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第8章 细胞培养
本章教学目的与要求
1、掌握得到单细胞无性系的技术 2、掌握细胞培养的方法，其含义及特点 3、学会小细胞团的计数方法 4、了解影响单细胞培养的因子 5、掌握细胞悬浮培养的方法：成批培养；连 续培养。 6、理解细胞悬浮培养的应用
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C 平板培养的基本技术
(1)、悬浮细胞密度的调制
平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密 度）为1×10 ³-100×10 ³个/ml 。 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞 悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度
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（2）培养基配制
1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液 =0.7 % 琼脂条件培养基。
C、均浆
D、过滤
E、离心
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F、培养
酶解法：利用果胶酶、纤维
素酶等处理外植体材料，分 离具有代谢活性的细胞。
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酶分解方法
叶片消毒 B 撕去表皮 C 4cm方块 D 加入酶 E 真空抽气 F 多次加入酶液 G 收集细胞
A
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愈伤组织分离单细胞
方法： A 将愈伤组织放入液体培养，震荡。 B 过滤 C 离心 D 过滤 E 获得细胞
凹穴载玻片
1滴含单细胞培养液
周围加石蜡油
旁边各加石蜡油
盖盖玻片 置培养皿中26~28 ℃恒 温培养
盖盖玻片
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平视图
B 微室培养特点：
优点： 在培养过程中，可以连续进行显微 观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞 团的全部过程
缺点： 培养时间较短
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第一节 单细胞培养
（3）、平板培养法（Plante Culture） A 含义及用途：
A 看护培养的含义及用途 含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途：诱导形成单细胞系。
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看护培养图示：
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织
恒温培养1个月
Single cell
Filter paper
2~3月
分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少 个能长出细胞团）。
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小细胞团计数方法：
1）低倍显微镜直 接计算； 2）细胞团显影法
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2.3、影响单细胞培养的因子
1、条件培养基 2、细胞密度(>临界密度) 3、生长激素 4、pH 5、CO2
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3、细胞悬浮培养 Suspension culture
Nurse callus
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单细胞无性系
B 看护培养基本技术
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基， 灭菌后备用。 （2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生 长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块 上放一片（1cm² ）已灭菌的滤纸，放置一晚上。 （3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。