免疫组化原理和流程介绍培训课件

免疫组化原理和流程介绍
3
免疫组化原理及流程介绍
二 免疫组化的原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是 指带显色剂标记的特异性抗体在组织 细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项新技术。
免疫组化原理和流程介绍
4
免疫组化原理及流程介绍
它把免疫反应的特异性、组织化学的可 见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括 荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大 作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原 物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原 体以及受体等)。
免疫组化原理和流程介绍
2
Baidu Nhomakorabea
80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素 （ABC）法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免 疫细胞化学分类方法迅速发展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学工作 者应该掌握的基本技术之一。
免疫组化原理和流程介绍
17
免疫组化原理及流程介绍
• 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要， 包括孵育时间和抗体浓度。
• 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度， 其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗 体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜 和 还要从摸冰索箱。拿出后1抗3.防体7止度结脱合复片更温；稳42定5.使m。抗in原。具体条件
(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内进 行结合反应。一般用Triton X-100、蛋 白酶k等通透液。
免疫组化原理和流程介绍
9
免疫组化原理及流程介绍
(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化 物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反应结果容易受到 内源性过氧化物酶的干扰，必须用 过氧化氢等进行灭活。
免疫组化原理和流程介绍
5
免疫组化原理及流程介绍
三 免疫组化的基本流程
1.脱蜡与水化
22..细细胞胞通通透透、、封封 闭闭内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原决定簇
4.封闭非特异性 蛋白
5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应
8.显色
9.复染、脱水、 透明、封片
免疫组化原理和流程介绍
6
1.脱蜡与水化
免疫组化原理及流程介绍
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他 试剂能够充分与组织中抗原等结合发生 反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性 反应和浸洗不全，而产生非特异性背景 着色。
免疫组化原理和流程介绍
7
1)60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes；
2)100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes；
15
免疫组化原理及流程介绍
具体操作：
将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在 组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清 （与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 (约 30℃)下10～30min。
大一点
免疫组化原理和流程介绍
16
免疫组化原理及流程介绍
5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。
免疫组化原理和流程介绍
一.发展简史
免疫组化原理及流程介绍
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣 根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技 术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
免疫组化原理和流程介绍
10
免疫组化原理及流程介绍
具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避 光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
免疫组化原理和流程介绍
酶消化方法 一般用于细 胞内抗原
应用高频电磁波 打开蛋白质间的 交联键
免疫组化原理和流程介绍
13
免疫组化原理及流程介绍
具体操作（微波修复）：
1) 将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温， 再加热，约4次，每次间隔补足液体， 防止干片。
6.二抗孵育
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标记(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团），作用是检测一抗。
免疫组化原理和流程介绍
20
免疫组化原理及流程介绍
11
免疫组化原理及流程介绍
3. 抗原修复 暴露抗原决定簇
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚 甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交 联及醛基的封闭作用，从而失去抗原 性；通过抗原修复，使得细胞内抗原 决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
免疫组化原理和流程介绍
12
免疫组化原理及流程介绍
抗原修复的主要方法:
常用的修复方法从强到弱一般分 为三种，高压修复、微波修复、胰 酶修复。
3)95% ethanol 2 minutes；
4)80% ethanol 2 minutes；
具
5)70% ethanol 2 minutes；
体 操
6)distilled water:5 min；
作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
免疫组化原理和流程介绍
8
免疫组化原理及流程介绍
2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
免疫组化原理和流程介绍
14
免疫组化原理及流程介绍
4.封闭特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，造成后续结果的假 阳性。 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物自身的抗体，预先能和 组织中有交叉反应的位点发生结合。
免疫组化原理和流程介绍
免疫组化原理和流程介绍
18
免疫组化原理及流程介绍
具体做法：
甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围 残留血清，直接加入已稀释的一抗（1： 250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
免疫组化原理和流程介绍
19
免疫组化原理及流程介绍