免疫组化原理和流程介绍培训课件
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免疫组化 ppt课件
荧光显微镜或电子显微镜观察。
抗体的标记
为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记， 利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大， 并转换成可见的荧光或呈现出颜色。
免疫组化常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（FITC）呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200） -橙红色荧光。
1.取材：从动物或者患者取下组织材料。 2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝 固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。 3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用 梯度酒精进行脱水。（自动脱水机） 4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋， 将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之 凝固成蜡块。（包埋机） 5.切片与贴片：（ 组织切片机） （1）切片 （2）展片 （3）贴片
② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。 ③ 生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
染色方法
1.直接法
用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原 结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；
2.间接法
免疫组化染色（石蜡切片）
1.烤片 65℃ 1-2h 2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化 3.灭活内源性过氧化物酶 4.抗原修复 5.封闭 6.一抗过夜 7.加入有标记的二抗 8.显色 9.苏木素复染 10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。
免疫组化应用
➢在临床上的应用 ➢在科研中的应用
在临床上的应用：
荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
3.非标记Ab桥法
免疫组化ppt课件
来自胶体金 与胶体金结合的蛋白
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(5).透明化：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒 浸液，替换出组织内的酒精，这种媒浸液称为透明剂。组织先经纯酒精 和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。目的： 石蜡易于浸入组织； (6).浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小 时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡 熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。通常石蜡采用熔点为 56～58℃或60～62℃两种。 (7).切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，切片机切片，切片厚 度为4～7um。 (8).贴片与烤片:用粘附剂-蛋白甘油将展平的蜡片牢附于载玻片。首先 在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片） 或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺 正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使 蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥， 也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(5).透明化：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒 浸液，替换出组织内的酒精，这种媒浸液称为透明剂。组织先经纯酒精 和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。目的： 石蜡易于浸入组织； (6).浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小 时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡 熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。通常石蜡采用熔点为 56～58℃或60～62℃两种。 (7).切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，切片机切片，切片厚 度为4～7um。 (8).贴片与烤片:用粘附剂-蛋白甘油将展平的蜡片牢附于载玻片。首先 在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片） 或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺 正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使 蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥， 也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
免疫组化技术培训课件
免疫组化技术
58
免疫组化技术
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一部分荧光经过物镜，长通分色反射 镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦 点外，经过焦点处的针孔，由检测器 接收并转变成电信号。
免疫组化技术
60
3.光信号接收和成像方式 (1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常 有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT） 把光信号转变成电信号；②利用电荷耦合 器（CCD）把光信号转变成电信号。
10
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。
(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。
(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
免疫组化技术
11
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其
他物质发生化学反应。
(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜
色对比鲜明，能清晰判断结果。
免疫组化技术
12
免疫组化技术
主要内容
一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法 八、激光扫描共聚焦显微镜
免疫组化技术
2
思考题：
1.什么叫荧光？
2.常用荧光素有哪些特征？
3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备
方法？
芥子喹吖因；染色体
BP420-440
硫磺素S：淋巴细胞
吖淀黄素：核酸
B
DM500 BP450-480 BA515
异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察
BP470-490
吖啶橙：DNA，RNA
BP420-480
金胺结核杆菌
IB
DM505 PB460-490 BA515IF
BP470-490
免疫组化基本技术培训课件
免疫组化基本技术
16
三、组织脱水、浸蜡及包埋 1.目的 组织经固定和水洗后含大量水分,需
用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大 量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换, 最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组 织能用于石蜡切片。
免疫组化基本技术
17
2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和 脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。
十种固定液，目的就是为了对一定抗原起
到保护作用，同时还能获得良好的组织形
态结构。
免疫组化基本技术
34
目前无一种固定液适用于所有的抗原，从 组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价 综合评估上，甲醛最优。
免疫组化基本技术
35
甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之 间会发生交联，交联时会使蛋白质的四 级和三级结构的折叠方向发生改变，使 蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改 变，而影响检测。 (2)抗体制备的影响
免疫组化基本技术
13
（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。
（6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。
免疫组化基本技术
14
2.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm×2cm×0.3cm (2)及时固定
免疫组化基本技术
15
(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚 薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原 则上，组织块大小与固定时间成正比，固 定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 (4)组织固定后必须彻底冲洗。
免疫组化基本技术
51
2.购置抗体的注意事项
(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体
(2)能否用于石蜡切片
(3)稀释度
(4)特异性，交叉反应
免疫组化技术讲义培训课件
形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的“金标准”。 ②免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。 ③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。 ④免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学 为准。
免疫组化技术讲义
28
电子显微镜技术：透射电镜
免疫组化技术讲义
29
电子显微镜技术透射电镜
蛋白表达=>
分布，定位，定量；
蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
免疫组化技术讲义
3
材料：
•抗体：
✓多 克 隆抗 体 ：为 针 对多 个 抗原 决 定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
✓单 克 隆 抗 体 ： 为 一 个 B 淋 巴 细 胞 分 化 增 殖 产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
2）热诱导的抗原修复：
方法：微波960C, 10min；
直接加温方法 1000C, 10min；
高压锅 1200C, 10min；
热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
免疫组化技术讲义
17
✓合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
免疫组化技术讲义
18
HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕 色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
免疫组化技术讲义
5
➢荧光标记：荧光素标记抗体
•异硫氰酸荧光素（Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm
•四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm
免疫组化技术讲义
免疫组化技术讲义
28
电子显微镜技术：透射电镜
免疫组化技术讲义
29
电子显微镜技术透射电镜
蛋白表达=>
分布，定位，定量；
蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
免疫组化技术讲义
3
材料：
•抗体：
✓多 克 隆抗 体 ：为 针 对多 个 抗原 决 定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
✓单 克 隆 抗 体 ： 为 一 个 B 淋 巴 细 胞 分 化 增 殖 产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
2）热诱导的抗原修复：
方法：微波960C, 10min；
直接加温方法 1000C, 10min；
高压锅 1200C, 10min；
热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
免疫组化技术讲义
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✓合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
免疫组化技术讲义
18
HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕 色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
免疫组化技术讲义
5
➢荧光标记：荧光素标记抗体
•异硫氰酸荧光素（Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm
•四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm
免疫组化技术讲义
《免疫组化技术》课件
特点
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化PPT课件
1.细胞膜阳性
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
18
免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
19
免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
14
。
15
16
免疫组化阳性结果色度
弱阳性： 淡黄色 中等阳性： 棕黄色 强阳性： 棕黑色 取决于：抗原量 分布密度 方法灵敏度
17
免疫细胞化学阳性结果定位分布
肌上皮瘤。
⑴ 结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记； ⑵ 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同
的肌细胞、肌上皮细胞 ⑶ 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型
（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白 和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 ⑷ 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白， 存在于分化成熟的横纹肌中。
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
18
免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
19
免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
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。
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免疫组化阳性结果色度
弱阳性： 淡黄色 中等阳性： 棕黄色 强阳性： 棕黑色 取决于：抗原量 分布密度 方法灵敏度
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免疫细胞化学阳性结果定位分布
肌上皮瘤。
⑴ 结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记； ⑵ 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同
的肌细胞、肌上皮细胞 ⑶ 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型
（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白 和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 ⑷ 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白， 存在于分化成熟的横纹肌中。
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
免疫组化课件PPT课件
李
三 华
特点
优点
特异性强，定位准；
结果直观；
形态学改变与功能和代谢相结合；
组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。
缺点
步骤多，影响实验成败的因素多；
以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量
分析尚需标准化。
第四页，共28页。
中
心
实
验
室 李 三 华
二 免疫组化技术的基本步骤
1.制片
组织切片(石蜡切片、冰冻切片)
IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr),
甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位
亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。
第十七页，共28页。
中
心
实
验 室 李 三
国外主要抗体试剂公司
华
用途
公司
用途
最全 离子通道
李
三
华
常用酶
辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP)
底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。
碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP）
底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD）
底物：葡萄糖，产物为蓝色。
第二页，共28页。
中
心 实 验 室
李
应用
三
华
凡是组织细胞内具有抗原性的物质
（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素
、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均
可用免疫组织化学方法显示而进行定性、
定位分析或定量研究，进而深入研究其
免疫组化的原理与操作 共40页PPT资料
特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高； （2）可定性、定位、定量观察； （3）将形态学改变与功能和代谢变化结 合起来；
IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。
1、固定的含义
固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性 ）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免 Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结 构。
——1974年Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧 化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用；
——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色
法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 ——90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细
胞化学分类方法迅速发展； ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组
化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。
IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。
1、固定的含义
固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性 ）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免 Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结 构。
——1974年Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧 化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用；
——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色
法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 ——90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细
胞化学分类方法迅速发展； ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组
化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。
免疫组化实验课培训课件
免疫组化实验课
4
动物的致死法
动物处死方法： 1.麻醉法 乙醚或4％戊巴比妥静注 2.空气栓塞法 3.断头法 4.断颈法 5. 二氧化碳窒息法
免疫组化实验课
5
尸检组织的取材
病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检， 因此，及时取材，尽早固定是开展IHC 检测 的关键。
免疫组化实验课
6
免疫组化实验课
实验室规章制度及实验室安全
⑴ 熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在危害。 ⑵ 检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。 ⑶ 工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，不得盲目操作。 ⑷ 不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、 亲友带进化学实验室。 ⑸ 必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。 ⑹ 熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位 置、急救电话。 ⑺ 保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。 ⑻ 实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。 ⑼ 离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和休息室等。 ⑽ 遇试剂溢出，应当立即清除。如溢出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员 并封闭现场，立即报告室主任和安全部门。 ⑾ 保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实 验后进行。 ⑿ 做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所“过夜实验管理办法”执行。 ⒀ 及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、生物废弃物。每周在指定时间送 往指定地点。 ⒁ 实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使用明火。 ⒂ 工作时间之外，任何人都不允许在实验室单独操作大型仪器和危险化学品，或单独处于具潜在 危险的场所。
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6.二抗孵育
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标记(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团），作用是检测一抗。
免疫组化原理和流程介绍
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免疫组化原理及流程介绍
具体操作：
将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在 组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清 （与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 (约 30℃)下10～30min。
大一点
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5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。
(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内进 行结合反应。一般用Triton X-100、蛋 白酶k等通透液。
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(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化 物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反应结果容易受到 内源性过氧化物酶的干扰，必须用 过氧化氢等进行灭活。
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三 免疫组化的基本流程
1.脱蜡与水化
22..细细胞胞通通透透、、封封 闭闭内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原决定簇
4.封闭非特异性 蛋白
5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应
8.显色
9.复染、脱水、 透明、封片
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3)95% ethanol 2 minutes；
4)80% ethanol 2 minutes；
具
5)70% ethanol 2 minutes；
体 操
6)distilled water:5 min；
作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
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2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
免疫组化原理和流程介绍
一.发展简史
免疫组化原理及流程介绍
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣 根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技 术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
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具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避 光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
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酶消化方法 一般用于细 胞内抗原
应用高频电磁波 打开蛋白质间的 交联键
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具体操作（微波修复）：
1) 将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温， 再加热，约4次，每次间隔补足液体， 防止干片。
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2
80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素 （ABC）法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免 疫细胞化学分类方法迅速发展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学工作 者应该掌握的基本技术之一。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
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4.封闭特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，造成后续结果的假 阳性。 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物自身的抗体，预先能和 组织中有交叉反应的位点发生结合。
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具体做法：
甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围 残留血清，直接加入已稀释的一抗（1： 250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
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1.脱蜡与水化
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脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他 试剂能够充分与组织中抗原等结合发生 反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性 反应和浸洗不全，而产生非特异性背景 着色。
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1)60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes；
2)100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes；
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二 免疫组化的原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是 指带显色剂标记的特异性抗体在组织 细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项新技术。
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4
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它把免疫反应的特异性、组织化学的可 见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括 荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大 作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原 物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原 体以及受体等)。
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3. 抗原修复 暴露抗原决定簇
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚 甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交 联及醛基的封闭作用，从而失去抗原 性；通过抗原修复，使得细胞内抗原 决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
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抗原修复的主要方法:
常用的修复方法从强到弱一般分 为三种，高压修复、微波修复、胰 酶修复。
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• 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要， 包括孵育时间和抗体浓度。
• 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度， 其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗 体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜 和 还要从摸冰索箱。拿出后1抗3.防体7止度结脱合复片更温；稳42定5.使m。抗in原。具体条件
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标记(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团），作用是检测一抗。
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具体操作：
将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在 组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清 （与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 (约 30℃)下10～30min。
大一点
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5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。
(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内进 行结合反应。一般用Triton X-100、蛋 白酶k等通透液。
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(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化 物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反应结果容易受到 内源性过氧化物酶的干扰，必须用 过氧化氢等进行灭活。
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三 免疫组化的基本流程
1.脱蜡与水化
22..细细胞胞通通透透、、封封 闭闭内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原决定簇
4.封闭非特异性 蛋白
5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应
8.显色
9.复染、脱水、 透明、封片
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3)95% ethanol 2 minutes；
4)80% ethanol 2 minutes；
具
5)70% ethanol 2 minutes；
体 操
6)distilled water:5 min；
作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
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2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
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一.发展简史
免疫组化原理及流程介绍
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣 根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技 术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
免疫组化原理和流程介绍
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免疫组化原理及流程介绍
具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避 光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
免疫组化原理和流程介绍
酶消化方法 一般用于细 胞内抗原
应用高频电磁波 打开蛋白质间的 交联键
免疫组化原理和流程介绍
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免疫组化原理及流程介绍
具体操作（微波修复）：
1) 将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温， 再加热，约4次，每次间隔补足液体， 防止干片。
免疫组化原理和流程介绍
2
80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素 （ABC）法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免 疫细胞化学分类方法迅速发展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学工作 者应该掌握的基本技术之一。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
免疫组化原理和流程介绍
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免疫组化原理及流程介绍
4.封闭特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，造成后续结果的假 阳性。 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物自身的抗体，预先能和 组织中有交叉反应的位点发生结合。
免疫组化原理和流程介绍
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免疫组化原理及流程介绍
具体做法：
甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围 残留血清，直接加入已稀释的一抗（1： 250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
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免疫组化原理及流程介绍
6
1.脱蜡与水化
免疫组化原理及流程介绍
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他 试剂能够充分与组织中抗原等结合发生 反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性 反应和浸洗不全，而产生非特异性背景 着色。
免疫组化原理和流程介绍
7
1)60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes；
2)100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes；
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二 免疫组化的原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是 指带显色剂标记的特异性抗体在组织 细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项新技术。
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免疫组化原理及流程介绍
它把免疫反应的特异性、组织化学的可 见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括 荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大 作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原 物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原 体以及受体等)。
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3. 抗原修复 暴露抗原决定簇
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚 甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交 联及醛基的封闭作用，从而失去抗原 性；通过抗原修复，使得细胞内抗原 决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
免疫组化原理和流程介绍
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抗原修复的主要方法:
常用的修复方法从强到弱一般分 为三种，高压修复、微波修复、胰 酶修复。
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免疫组化原理及流程介绍
• 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要， 包括孵育时间和抗体浓度。
• 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度， 其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗 体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜 和 还要从摸冰索箱。拿出后1抗3.防体7止度结脱合复片更温；稳42定5.使m。抗in原。具体条件