细胞培养中常见的问题

细胞培养中常见的问题2006-11-23 15:53细胞中的颗粒到底是怎么回事？我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。

好像是细胞碎片一样。

是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么是黑色的小碎片。

我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。

我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。

但是，是什么东西不清楚。

的确很常见在以前帖子见到说是“黑焦虫”。

长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。

而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。

不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。

以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。

那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。

我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。

国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长我培养的细胞也有出现这中情况。

但是并不影响细胞生长。

应该不是支原体污染最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了细胞培养的细菌污染我们新建的细胞室。

每周都会做清洁，用0。

2%新洁尔灭消毒，照紫外。

实验前也会照至少30分钟。

培养基中加青霉素，链霉素。

可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。

用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。

我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！很可能是超净台无效了，，或者培养基？其实严格操作箱污染都难我们是新的超净台，不可能失效。

而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一瓶污染，新传的很好。

所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶换新瓶养可以么？都污染了，我仍还来不及，那还敢换新瓶染菌有很多原因，因为整个细胞操作过程均要求无菌，所以看看操作是否规范，例如戴手套等。

多半是环境因素，做点平板，操作时放在几个地方，培养后看看长菌情况。

消毒用新洁尔灭好象不是太有用。

人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩没有，其实，只要你操作的好，严格在靠近火的附近操作，污染的几率是很小的。

从你的描述中可以看出培养基应该没有问题，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不当引起的，还需要加强练手。

求助！关于细胞培养中的真菌污染！感激！先谢谢大家的帮助！现在细胞培养基里出现了很多白色和黑色的小点，有好长的时间了！细胞的形态看起来不太好，但是有些细胞也长的很好，如成纤维细胞，但是内皮细胞就差很多！加大量的抗生素没有效果！不知道是不是真菌污染，怎么鉴别！因为培养了很长时间都没有出现真菌的菌丝，所以不能肯定是真菌！那些白色的小圆点有点象白色链球菌或链珠菌，但是不能确定！怎么样才能判断确定，改用什么办法解决！谢谢大家的帮助！杀灭真菌听说用两性霉素，但从没试过。

真菌污染是件很麻烦的事，可能重新复苏细胞是最好的办法。

同时该注意如何防止污染。

我觉得如果是真菌污染，培养基会浑浊，是肉眼可见的浑浊。

在这种情况下最好赶紧将该瓶细胞扔掉，免得引起培养箱中的大规摸污染。

在显微镜下，真菌是成念珠状的，这时细胞界限不清。

这可能是不规范操作引起的，安全起见还是将细胞室全面打扫一下，用新洁尔灭擦，紫外照！谢谢大家的帮助，因为实验室以前从来就没有这样的污染，所以大家也没有经验！现在就是不能确定是不是污染。

我不可能把实验室所有的细胞都扔掉，因为有好多人都在一起养不同类型的细胞！现在确实是问题，培养基也没有浑浊，操作的时候已经十二分的小心了！我想问一下，你看到的那些白色或黑色的圆点是在低倍还是高倍显微镜下？若培养基不混浊，可能真的是细胞状态太差，没有贴壁还缩成球状。

难道你们实验室所有细胞都用一瓶培养基？只要将污染的扔掉就行，没必要都扔掉！两性霉素！sigma在华美有分装！但是浓度很小，关键还是环境问题！黑白圆点在100倍显微镜下有多大，是不是酵母菌小黑点和小白点是在200倍的显微镜下观察所见，大小可能是细胞核的1/5到1/4左右！细胞状态不好是因为跟以前培养的细胞来比较所得，细胞能贴壁，能生长，但是没有以前的那么快，而且形态看的也不好！另外问一下sleevexz，酵母菌是什么样的，怎么鉴别！还有一个问题就是，实验室用的双抗是从Gibco公司买过来的直接使用的液体，具体规格是100ml一瓶，Pelicillin-Streptomycin 一起，50倍的，要求储存在－20 C，但是有效期只到2002年9月，现在都已经差不多过期半年了，但是实验室的老师都说没有问题，可以用，现在大家就都是一直用这样的抗生素在！你们说会不会是抗生素的问题的！养细胞经常无缘无辜的染菌？烦烦烦！！！！我是一个新手，但已养细胞近半年，最近一段时间经常染菌，有时是培养基，有时连原因都找不到，在实验中我也非常小心，但结果总让我伤心。

现在都有点神经质了，请各位指点你这个问题说大不大，说小也不小。

说不大呢，七个字就可以回答你：严格按照无菌要求。

说不小呢，这无菌要求的话匣子一打开太大。

还是简要吧：1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5％的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。

4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。

一下也想不了那么多，具体的你再问吧。

最好把你怎么操作的过程描述一遍，我们就好针对性的指出错误了。

建议你把细胞室，好好清理一下，污染是这样的，出现一次就比较麻烦，千万别急。

还有，你们的紫外灯没有问题吧？非常感谢楼上的回信，在操作中我也严格按照无菌要求去做，因为操作台是公用的，而其它同学很少染菌，我想主要问题应在我身上，但是又找不到主要原因。

我一般是这样操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部开始操作，基本步骤是吸培养液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例传代，有时吸管头部碰在培养瓶口，有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用，有时原因都找不到，请各位指点。

戴手套试试巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰别处立即更换。

污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟能生巧。

你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下，滴管不要反复用。

其实无菌操作第一重要的就是你的超净台是不是还能用，滤网要及时清洗的。

其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是否正确。

还有一点很重要，手一定不能在任何瓶口上方经过！从你操作的步骤来看，你的细胞应该是很好操作的。

没看到你要用消化液，这就减少了污染的机会。

你用的吸管是自己做的吗？经常练练，熟能生巧，时间长了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。

（用牙签或12号针头等工具来塞比较方便，塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌，这样就不会在上吸耳球的过程中，出现将棉花弄掉的情况），另外，你要勤剪指甲，不要戴首饰，吸管一周灭一次菌，不要没用完老用。

操作是导致污染的最主要原因根据本人的经验，操作是导致细菌污染的最主要原因。

本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过，那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的，更衣，换鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培养液中加双抗，所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40分钟后才允许进入。

但是，就是这样的条件，操作不好，一样要污染。

现在本人工作的实验室要求比那个实验室差的天远地远，但是只要操作仔细了，一样可以把最难养的细胞养好。

本人曾经参观过一些名人进行细胞操作，也就是换上拖鞋，连工作服都不换就进细胞室，细胞一样没有问题。

所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情况如何，袖口是否能够扎紧。

如果不能保证，不如索性把袖口挽起来，把手臂用酒精擦一遍（其实我本人连擦都懒得擦，一样没事）。

操作时，滴管两头都要烧。

还有一点很重要，就是滴管头在加液体的时候，不要深入瓶口太多。

在倒培养液的时候，可以拿起培养瓶直接倒，但是注意要倒干净，瓶口沾的最后一滴液体千万不可回流倒瓶内。

还有一些基本的问题，比如瓶口要多烧一会，怀疑滴管有污染就一定要换。

一旦细胞出现污染的迹象了，就一定要扔掉。

如果实在想挽救，可以用一些高档抗生素（医院里给病人加药后的药瓶，用无菌盐水涮涮就能用，浓度足够），但要小心浓度太高细胞也会死亡。

对付霉菌通常用饱和的硫酸铜溶液，放在培养箱的装水盘中，细胞房的空调要用除湿的功能。

如果不幸染上，要用84液擦培养箱，再用75%酒精擦。

灭菌操作：在无菌箱内每立方米用甲醛8—10毫升，高锰酸钾5克，熏蒸45分钟后接种在无菌箱中每立方米用甲醛8－10毫升、高锰酸钾0.25千克，熏蒸45分钟后接种，栽培种接种量按每瓶二级种接30－40袋为宜。

（一）常用消毒剂现将常用的消毒药品及其配制、使用方法，介绍如下：1． 35％甲醛水溶液（HCHO）：又名福尔马林，使蛋白质变性。

用于培养室、无菌室的灭菌。

2．0.1％的升汞水（HgCL3）：能使蛋白质变性，抑制酶类。

0.1％升汞配制方法是称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水至100毫升即成。

用于无菌箱、培养箱、培养皿四周表面以及手指的灭菌。

3．石炭酸（C6H5OH），5％浓度喷雾后，能使蛋白变性沉淀。

石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。

用于工作服、实验桌的灭菌。

杀菌效果同升汞。

4．高锰酸钾（KMnO4）：氧化剂。

0.1％浓度能使蛋白质与氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或杀死杂菌。

5．乙醇（CH3CH3OH）：又称酒精。

消毒以75％浓度的效果最好。

它能使蛋白质脱水变性。

高浓度酒精会使蛋白质很快脱水凝固，消毒作用反而减弱。

6．新洁尔灭：0.25％新洁尔灭用于无菌箱、无菌室的灭菌。

一般新洁尔灭5％原液50毫升；加水950毫升配成。

7．漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。

通常在使用前临时配制，静置1～2小时，取上清液喷射，进行室内消毒，每平方米用1升。

8．药皂：煤酚皂、硼酸皂等各种药皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。

9．2％硫酸铜溶液：用硫酸铜（胆矾）2克，加水至 100毫升加热溶解配成。