第四章 核酸操作技术

离心分离法——超速离心
最大转速 r/m 普通离心机 高速冷冻离心机 超速离心机 6000 25,000 25,000-75,000 温度
RT -10-4℃ -10-4℃
超速离心机是1940年瑞典物理学家Svedberg （斯韦德伯格）制造。
从原理上，超离心分三种类型： ⅰ差速离心 对一个混合物组份通过改变离心速度（差速） 使各组份分开的技术。
-20 ℃ -40 ℃ -70～-80 ℃
第三节
核 酸 电 泳
电泳：
带电物质在电场中向相反电极移动的现象。
核酸凝胶电泳的原理： 各种生物大分子在一定pH条件下，可 以解离成带电荷的离子，在电场作用下向 相反的电极移动；在生理条件下，核酸分 子（DNA和RNA）的多核苷酸链呈现多聚阴 离子的特性。当核酸分子被放在电场中时， 它们就会向正极方向移动。
特点是技术简单、速度快、样品悬浮不受用量的 影响，但缺点是很难得到完全纯化样品。
ⅱ沉降平衡法又称密度梯度离心法 （CsCl密度梯度离心） 在离心时混合物各组份不沉至管底而是停留 在事先制好的或在离心中型成的不同密度的介质 中，使之处于平衡状态（此时样品的流动速度为 零）从而使物质分开，比如把样品加在相当稠密 的小分子溶液(CsCl)中，在离心时形成梯度并使大 分子进入与它的力的总和为零的区域（即离心力 和浮力相等）这个区域的密度等于大分子的密度 也称该分子的浮力密度(ρ)此法称浮力密度梯度离 心(BGC)。
植物组织 细胞器缓冲液匀浆 离心(100g, 10’,4℃)除去细胞 核 离心(1800g, 10’,4℃)分离叶绿体 离心(10,000g, 10’,4℃) 分离线粒体 DNase除去细胞器外DNA 加入EDTA使 DNase失活 纯化细胞器 细胞器裂解 提取DNA
2. 载体DNA的分离与纯化
1) 质粒载体DNA的分离
线粒体 藻类 线状 15kb 酵母 环状 19~78 kb 植物 环状 100~150 kb 动物(扁虫到人)环状 15~18 kb 锥虫 网状 6000 kb(幼体) 短膜虫 网状 30,000 kb(幼体) (Kinetoplast）
叶绿体 双子叶植物 121（菠菜）~154kb（豌豆） 单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
2) 染色体DNA分离纯化技术
CTAB，SDS
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 20’ 冰浴冷却 离心去细胞碎片
65℃温育
苯酚抽提法① CsCl密度梯度离心②
⑴苯酚抽提法 上清液 缓冲液用笨酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽 至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉 淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理 除去RNA 苯酚氯仿异戊醇抽提 沉淀干燥
2. 总RNA的制备 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下 三种制备方法： 1）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法
其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的 组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性， 制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎 与蛋白质变性是同步进行的。
在具体工作中介质的选择、浮力密度确定等改 进有很多（例如加EB，线性结合强，可区分线性 和环形。 根据文献在相似的条件比较核酸浮力密度：
ssRNA(单链RNA) ＞dsRNA(双链) ＞ssDNA＞dsDNA＞tRNA.蛋白
ⅲ沉降速度又称速度区带离心法
在超离心时样品以不同的速度沉至管底，若两 种或多种界面，从界面的移动（产生）可以测不 同溶质的分子量并把混合物分开称沉降速度法。
1) 分子量大小分级分离
i. 蔗糖密度梯度离心 ii. 凝胶电泳
2) 核酸序列分级分离
i. 分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离 DNA分子变性 结合到NCF RNA· DNA杂交 洗涤 洗膜 乙醇沉淀
ii. 亲和层析法： 低聚dT纤维素: 用于poly(A)较长的mRNA； 多聚U琼脂糖: 用于poly(A)较短的mRNA（<20A） RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 iii. 无poly(A) mRNA的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基+mRNP 离心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚（dT）纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀（无多 聚A mRNA）
异硫氰酸胍
蛋白质的强变性剂。 氯仿（三氯甲烷） 加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中 的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 异戊醇 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶 剂相维持稳定。 单价的阳离子（Na+） 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入 单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和 DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同 性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
分离细胞器DNA
RNA poly(A)RNA 特异性RNA
染色体DNA(组建基因组文库)
2、载体DNA分离
载体DNA
感染或转染细胞（病毒型）
分离病毒颗粒 病毒载体DNA分离与纯化
转化细菌细胞（质粒型）
培养转化细胞、收集菌体 破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
3、DNA片段的分离
DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定DNA片段的胶回收
关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开； 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过 程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持 超螺旋构型。
方法：
ⅰ. 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而 质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时， 前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法 上述方法亦可用于ss环状病毒DNA RF型的分离, 质粒 DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）
第三章
核 酸 操 作技 术
DNA
核酸
RNA
1. 核酸的分离和纯化 2. 核酸的检测与保存
↓
Байду номын сангаас
紫外光谱分析法 荧光分析法 凝胶电泳法（常用、重要）
3. 核酸的凝胶电泳 4. 核酸分子杂交
第一节
核酸的分离和纯化
一、一般程序
1、供体的核酸分离
供体细胞培养 收集(菌体)细胞（离心） 细胞破碎（细胞裂解） 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA
三、DNA的分离与纯化
1、供体DNA的分离与纯化
要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1) 基因组大小：
染色体 细菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蝇 1.28x105 kb 人 3x106 kb 植物 2x105~1x108 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb 质体 几~100以上kb
2. 机械法
1) 压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢 和G+球菌除外） 2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合 器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm） 同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法
2.荧光分析法 荧光的强度与溶液中DNA的含量成正比，如 DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚），利用标 准DNA的浓度可以计算出未知浓度的DNA 含量。 需特殊仪器：荧光分光计。
3.凝胶电泳法
使用EB染色的注意事项
二、核酸的保存
1.保存液 常用：TE和ddH2O 2.保存温度 4 ℃
a. b. c. d.
上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤 可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片， 保留上清液。 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心 使RNA分离：RNase处理或超速离心 使DNA与其它可溶物分离
基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
（3）细胞器DNA的分离(叶绿体、线粒体DNA)
4、质量评估
1） 凝胶电泳
2）光密度值测定（紫外分光光度计） 3）限制酶切分析
二、细胞裂解
1. 酶法：
利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂 使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶（lysozyme ） 2) 酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3) 丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 4) 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满 足酶的最佳反应条件。
第二节
核 酸 的 检 测 与 保 存
一、核酸的检测
1.紫外光谱分析法 远紫外（10-200nm）：实验中难以实现； 近紫外（200-400nm)：通常意义上。
纯DNA：A260/A280＞1.8 纯RNA:A280/A260≈2.0 A=1，含50μg/ml的双螺旋DNA或40μg/ml单链DNA或 RNA，或20μg/ml寡核苷酸。
5. RNA的质量评估方法
1) 光密度值测定法 A260/A280=2.0 2) 凝胶电泳 3) 体外蛋白质翻译
蔗糖密度 梯度离心
大小分级分离 热苯酚法 凝胶电泳
一定 大小范 围RNA
细胞裂解物 胍盐法
离心 LiCl/ 尿素法
总RNA
分子杂交法— 特异RNA分子
核酸序列 分级分离 亲和层析法— poly（A）RNA分子
***免疫亲和层析法 新生肽链-抗体复合物 不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附 洗脱 免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，但必须使用 高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶 2) 多聚核糖体RNA的分离 纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提
4. RNA的分级分离
2) 噬菌体载体DNA的分离
纯净病毒颗粒 病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法
四、RNA的分离与纯化
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的 作用
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗 高温严寒(0~65℃均具活性）；抗变性剂 2) 解决办法： 外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所 有溶液（Tris· HCl除外）和器皿，操作者带手套并 经常换，手是RNase的主要来源 ； 内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase 抑制剂，蛋白酶K等。
Trizol（invitrogen）
3. 多聚核糖体RNA的制备
1) 多聚核糖体的分离 ① 超速离心法（30-40万g，离心2-3 h） ② 镁盐沉淀法（0.1 M Mg++） ③ 分级分离法—分离特异性多聚核糖体
i. 结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。 ii. 核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的 多聚核糖体 iii.核糖体免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法 新生肽链+抗体 蔗糖密度梯度离心 **间接免疫沉淀法 新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗） 不可 溶复合物 离心分离
高速离心法 全部多聚核糖体 上清液 镁盐沉淀法 蔗糖密度梯度离心—结合与 游离多聚核糖体 蔗糖连续密度— 一定范围大小核糖体 免疫沉淀法—— 特异性多聚核糖体
分级分离法
多聚核糖体RNA
CTAB
去污剂，溶解细胞膜，高盐溶液中与核酸共溶。 β-巯基乙醇 抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌，避免褐 变，使酚容易去除基因组DNA。 SDS 裂解细胞，释放核酸。 苯酚 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。 （1）水饱和酚又叫水平衡酚；PH小于7，通 常与异硫氢酸胍一起使用，用于RNA的提取； （2）Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA 的提取。
(2) CsCl密度梯度离心 上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心 (45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提 溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀 DNA 离心、洗涤、干燥
*两种方法比较： CsCl法操作步骤少，分 离DNA分子量大，耗财多，且 需超速离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵 仪器，但操作步骤多，易使 DNA分子断裂。 若 小心操作， 所获DNA亦符合要求。