蛋白质测定PPT课件
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卫生检验蛋白质ppt课件
③酚试剂法：灵敏度高达双缩脲法的100倍，有利于检出微量蛋白质， 较合适于单一蛋白质检测。
④紫外分光光度法：利用蛋白质在280nm处有吸收峰的特点，常用 于测定较纯的酶和免疫球蛋白。
⑤染料结合法：常用氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼 等，前三者主要用于蛋白电泳，邻苯三酚红钼可用于尿液和脑脊 液中蛋白质的测定，简便快速、灵敏，但不同蛋白质结合力不一 样，且试剂对比色杯有吸附作用。
(3).A/G比值 正常为1.5-2.5/1,ALB减少和/或球蛋白升高， A/G降低,严 重者A/G﹤1.0，称为A/G比值 倒置。
(4).先天性ALB缺乏症：ALB合成障碍，极少见。
13
4.溴甲酚绿法测定ALB 注意事项
(1).BCG是一种PH指示剂,变色域PH3.8(黄色)-5.4(蓝绿色),控制反应液 PH是本方法的关键。
1
一 .蛋白质代谢检查 二 .糖代谢检查 三 .离子测定
2
(一)TP测定:方法、原理、操作、临床意义及注意义、注意 事项
3
1. TP测定方法简介: TP测定时常利用蛋白质的一些特性,如重复的肽键结构;酪氨 酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收;与色素结合 的能力;沉淀后的浊度;电泳的迁移率大小等来设计蛋白质 的测定方法。经典和常见的方法分述如下：
9
2.双缩脲法测定TP 方法特点
(1).双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比,与蛋白质种类,分子量及 氨基酸组成无明显关系,各种蛋白质显色程度基本相同,显色稳定性好,试剂 单一。
(2).双缩脲法重复性好,RCV4%,CCV3.9%;线性范围0-140g/L,干扰少,使用
单一的稳定试剂,操作简单、快速,适于手工操作及自动化分析,为TP测定的 参考方法。 (3).唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍,但能满足临床生化 检验需要,对血清总蛋白定量较为适用;对蛋白质含量很低的其他体液如脑 脊液、胸腹水和尿液等，不是合适的定量方法。
④紫外分光光度法：利用蛋白质在280nm处有吸收峰的特点，常用 于测定较纯的酶和免疫球蛋白。
⑤染料结合法：常用氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼 等，前三者主要用于蛋白电泳，邻苯三酚红钼可用于尿液和脑脊 液中蛋白质的测定，简便快速、灵敏，但不同蛋白质结合力不一 样，且试剂对比色杯有吸附作用。
(3).A/G比值 正常为1.5-2.5/1,ALB减少和/或球蛋白升高， A/G降低,严 重者A/G﹤1.0，称为A/G比值 倒置。
(4).先天性ALB缺乏症：ALB合成障碍，极少见。
13
4.溴甲酚绿法测定ALB 注意事项
(1).BCG是一种PH指示剂,变色域PH3.8(黄色)-5.4(蓝绿色),控制反应液 PH是本方法的关键。
1
一 .蛋白质代谢检查 二 .糖代谢检查 三 .离子测定
2
(一)TP测定:方法、原理、操作、临床意义及注意义、注意 事项
3
1. TP测定方法简介: TP测定时常利用蛋白质的一些特性,如重复的肽键结构;酪氨 酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收;与色素结合 的能力;沉淀后的浊度;电泳的迁移率大小等来设计蛋白质 的测定方法。经典和常见的方法分述如下：
9
2.双缩脲法测定TP 方法特点
(1).双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比,与蛋白质种类,分子量及 氨基酸组成无明显关系,各种蛋白质显色程度基本相同,显色稳定性好,试剂 单一。
(2).双缩脲法重复性好,RCV4%,CCV3.9%;线性范围0-140g/L,干扰少,使用
单一的稳定试剂,操作简单、快速,适于手工操作及自动化分析,为TP测定的 参考方法。 (3).唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍,但能满足临床生化 检验需要,对血清总蛋白定量较为适用;对蛋白质含量很低的其他体液如脑 脊液、胸腹水和尿液等，不是合适的定量方法。
实验一血清蛋白质测定(共51张PPT)
【注意事项】
1.测定的血清以新鲜为宜，但在冰箱保存而不混 浊的标本也可应用，高脂血症混浊血清会干扰比 色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离 心管，各加待测血清，再加蒸馏水和丙酮10ml， 塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试 管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加 入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述 相同的其他操作和计算。
-----------------
-----------------
标准
A 血红蛋白和BCG产生与白蛋白相等的颜色强度，血红蛋白在1g/L以下无明显干扰，2g/L使吸光度增高3.
2．10mmol/L BCG贮存液
标准
3．叠氮钠贮存液
4．聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)贮存液
5．BCG试剂
实验一 血清蛋白质测定
但本法的检出限为～，这相当于70g/L的血清3～24μl，已能满足临床生化检验的需要，成为临床实验室血清TP首选的最方便，实用的常规方法。 酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响测定结果，右旋糖酐可使测定管混浊亦影响结果，理论上这些干扰均可用相应的标本空白管来消除。 ３．在波长630nm处用空白管调零，用定量加液器加BCG试剂，与测定管血清混合后，立即在30±3s内，读取吸光度。 4%，4g/L使吸光度增高7. 2 桌面，边台，水池，窗台，仪器要一尘不染，请值日生用抹布擦干净。 4(显蓝绿色)，受酸、碱影响较大，故所用的器材必须无酸、碱污染，BCG工作液的pH必须精确度监测，务必使其保持在限度内。 手工操作参数：波长540nm，光径1cm； 用双缩脲法测定血清标本中总蛋白浓度，用溴甲酚绿法测定血清白蛋白浓度, 蛋白质测定方法很多，常用的有： 丽春红蛋白结合法测得的结果与凯氏定氮法相符，并且显色后在室温可稳定24小时； 1．黄疸血清，溶血，高糖，酚酞等干扰用样本空白来消除。 由于血红蛋白本身能与双缩脲试剂反应，产生与血清白蛋白和球蛋白相近的显色效价，故应注意高血红蛋白的影响。 取试管4支，标明测定管（U）、标准管（S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB）。 双缩脲法测定血清总蛋白
蛋白质的测定课件参考.ppt
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
《蛋白质性质试验》PPT课件
实验 蛋白质的部分性质
第一部分、蛋白质的颜色反应
一、试验原理
❖ 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。 不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全 相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产 生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物 是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测 定的依据。
精选PPT
9
（二）有机溶剂沉淀蛋白质
原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引 起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质 点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。
操作：取一试管加蛋白液1ml，，加入晶体氯化钠少许， 待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。
精选PPT
10
（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质
原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。 能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如 鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易 与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。
操作：
1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化
成液体， 此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至
液体重新结晶出现白色固体时， 停止加热，冷却。然后
加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 液，混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶
2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加24滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
精选PPT
7
二、实验仪器
1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉
三、实验试剂
1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液 放在冰箱里冷藏备用。
第一部分、蛋白质的颜色反应
一、试验原理
❖ 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。 不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全 相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产 生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物 是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测 定的依据。
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9
（二）有机溶剂沉淀蛋白质
原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引 起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质 点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。
操作：取一试管加蛋白液1ml，，加入晶体氯化钠少许， 待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。
精选PPT
10
（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质
原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。 能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如 鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易 与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。
操作：
1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化
成液体， 此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至
液体重新结晶出现白色固体时， 停止加热，冷却。然后
加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 液，混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶
2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加24滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
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7
二、实验仪器
1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉
三、实验试剂
1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液 放在冰箱里冷藏备用。
蛋白质的研究方法优秀课件.ppt
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白 完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
蛋白质的研究方法优秀课件
18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
蛋白质的研究方法优秀课件
22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
蛋白质的研究方法优秀课件
25
#
蛋白质的研究方法优秀课件
26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
蛋白质的研究方法优秀课件
5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
蛋白质的研究方法优秀课件
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
蛋白质的研究方法优秀课件
25
#
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26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
蛋白质的研究方法优秀课件
5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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蛋白质测序PPT课件
+
NH CH C NH CH C
H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下， 能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成黄色 二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸）。
弱碱
（黄色）
② Edman 降解法(I)
PITC
（pH8.3）
CH3NO2 三氟乙酸
Edman 降解法(II)
② Edman 降解法(I)
PITC法可用来连续测定出60个以上的氨 基酸顺序。
多肽链的选择性降解
化学法：溴化氰(CNBr)水解法，它能
选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成 的肽键。
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
多肽链的选择性降解
酶解法:
胰蛋白酶：得到以Arg和Lys为C-末端的肽段，
产生的肽段数一般等于Arg和Lys总数加1
多肽链的选择性降解 酶解法:糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）
专一性水解芳香族氨基酸羧基端形成的肽 键，若羧基端与Pro相连，则不被水解
多肽链的选择性降解 酶解法:酸性磷酸酶
多肽链的选择性降解 酶解法: 弹性蛋白酶
链 的
的氨
分 子
基 酸
比组
成
，
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端。
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的 是N-端氨基酸分析法。
最新实验一蛋白质含量测定ppt课件
生物化学与分子生物学基础实验
TU1800 紫外可见分光光度计
波长范围：200－1100nm 钨灯：340－1100nm
测光系统：单光束
氘灯：200－340nm
功能指标：光度测量 光谱扫描 定量测量
生物化学与分子生物学基础实验
注意事项
1 测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2 定量实验取液要准确。 3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润 洗。 因此3ml溶液足够测定。 4 测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5 每次实验时提交上一次的实验报告。
生物化学与分子生物学基础实验
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
实验步骤
0 1234567
标准蛋白（1mg/ml）ul 0 20 40 80 120 160 200 0
待测样品 ul
-
- - - - - - 200
蒸馏水 ul
1000 980 960 920 880 840 800 800
Folin-酚试剂甲 ml
3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间 内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出 的样品浓度与实际的浓度不符。
生物化学与分子生物学基础实验
722型光栅分光光度计
光 源
单 色
样
光
读
品
电
数
器
池
源
单
件元
测量完毕，请把光度计的盖打开 ！
讲解完毕后，每个组出一个同学去 127听老师讲解仪器使用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
《血清蛋白质测定》PPT课件
• ⑹血浆蛋白质广泛应用于组织和细胞的培养，血浆中含有各总细胞刺激因子 和抑制因子，它们对稀薄啊的活力、增殖、分化、胞内酶的合成及细胞特殊 功能起者特殊的作用。
• ⑺在人类不少疾病，包括两种常见的疾病——动脉粥样硬化及肿瘤的发病学 研究，以及最常见的糖尿病及其并发症的发病机制中，血浆蛋白质均有广泛 涉及。
• 补体蛋白类 • 补体蛋白C • B因子 • D因子 • 备解素
• P因子又称备解素（properdin），是替代途径中除C3以外最 先发现的一种血浆蛋白。现已探明，P因子以聚合体形式而 存在：即三聚体（54%）、二聚体（26%）和四聚体（20%） 都有，但特异活性的顺序依次为：四聚体>三聚体>二聚体。 P因子为由4条相同的肽链（分子量各55kDa）组成的四聚体 分子，链间以非共价键相连接，分子量为220kDa。P因子的 生物学活性是以高亲和力与c 3bBb和C 3bnBb相结合，结合 后通过发生构象改变而加固C3b与Bb间的结合力，从而可使 其半衰期由2分钟延长至26分钟。另外，P因子还可封闭H因 子的抑制作用，更增加了上述两种酶的稳定性及活性，有利 于促进替代途径级联反应的继续进行。因此，P因子实际上 是替代途径中的一个重要的正调节分子。因其常成为c 3bBb 和C3bnBb复合物中的组成成分之一，故将其作为补体系统的 固有成分在此一并描述。此外，在膜增生性肾小球肾炎病人 血清中发现有一种C3肾炎因子（C3nephritic factor,C3NeF） 实际为C 3bBb的自身抗体，也可与C3bBb结合而增加c 3bnBb 的稳定性，使其半衰期处长10-30倍。
• ⑵生理学家与病理生理学家；注重蛋白质的生理 功能，研究其胶体性质、缓冲性质和生理作用， 运输、结合功能等。
• ⑶血浆蛋白质 具有遗传的变异：如Hp、TFP等在不 同的人群中常见有结构上的差异，以及某些蛋白质 的缺乏表现出一定的临床症状，具有临床意义；遗 传学家利用蛋白质结构上的差异作为研究人群与家 族遗传特征的标志。
蛋白质检测方法ppt课件
移 (photo-induced electron transfer PET）, 分子内电荷转移
( Intramolecular charge transfer , ICT)等效应对蛋白质进行选
择性识别
26
精品课件
✓ 基于自组装机理检测蛋白质
超分子化学：分子聚集体结构和功能为研究对象, 旨在 研究分子基于弱相互作用的组装、自组装和自组织行为,并 研究这些行为可能带来的结构和功能的改变,以期建立结构 和功能之间的关系。超分子的组装的实现依赖于分子间键. 它包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位 键、π-π堆积作用等
曙红Y
23
铬天青S
精品课件
溴酚蓝
Evans blue
24
四羧基苯基卟啉
精品课件
偶氮染料
方酸菁染料
酞菁染料
25
精品课件
✓ 基于AIE机理检测蛋白质
✓ 此外，小分子荧光探针还可基于荧光能量共振转移
(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光诱导电子转
17
精品课件
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。
12
精品课件
比色法-BCA法
蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝染色法(共20张PPT)
光源
0.575
单色器
吸收池
检测器 显示器
第6页，共20页。
➢ 光源
不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的320～1100nm波长的光谱，光通过三棱镜折射
后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为 可见光分光光度计的光源
吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质 Ø当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射，一 部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液，则：
入射光=反射光+吸收光+透过光
Ø如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射等因素造成的入射光 的损失，则：
入射光=吸收光+透过光
第4页，共20页。
Ø朗伯-比尔（Lambert-Beer）光吸收定律
u设 I0为经过空白校正后入射光的强度，I t为透过光的强度 u根据实验得知：It= I0 ·10－εbc，式中：c 表示吸收物质的摩尔浓度；b表示吸收物质的光径， 用cm表示；ε表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物 质的ε数值不同，所以 It/ I0= 10－εbc u令 T（透射比）= It/ I 0 ， 则T=10－εbc ，lg（1 / T）=εbc ulg（l / T）为物质的吸光度（A），则A = 1g（1 / T）＝εbc，此式说明了物质的吸光度 与吸收物质的浓度和光程成正比，这就是Lambert-Beer光吸收定律
蛋白质含量的测定 考马斯亮光光度技术的一般原理
ü学习722型可见光分光光度计的操作 ü熟悉考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法
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历来采用6.25，这个数值是以pro平均含氮而
导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食品
种类不同，差别是很大的，我们在测定pro时，
应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般
手册上列出了一部分换称等数，用时可查，蛋
=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，
大麦=5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮
（4）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为 了防止污染通常采用硫酸铜
(5)50%NaOH的作用
影响氨化完全和速度的因素: （1）K氏烧瓶和取样量 1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，
800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨 化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。
（2）分解剂 A H2SO4和K2SO4的添加量 K2SO4和H2SO4的添加比例是： 1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml 这种比例在国内外都使用，是公认的
但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特 别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干 扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的凯氏定 氮法
蛋白质的定量测定
一、凯氏定氮法
一些蛋白质的含氮量 一般为 15%~ 17.6%，
有的上下浮动
可以测出总氮 N
N 16%
= N×6.25 = 蛋白质含量
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不 同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%， 即一 份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为 蛋白质系数。
元素
C HO N S
P
百分比% 50 7 23 16 0—3 0—3
关于氮-pro换算等数
对于氮含量换算成pro含量的等数，
由pro组成 2 .pro维持体内酸碱平衡 3 .pro 是食品的重要组织部分之一，也是重要的营 养物质 4 .pro 是评价食品质量高低的指标，还关系到人体 健康。
5.对合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食 品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要 的意义。
（2）蛋白质系数
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要化学元素 为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、 Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的 主要标志。对于不同的pro，它的组成和结构不同，但从 分析数据可以得到近似的pro的元素组成百分比。
由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、 微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏 法。
（一）常量凯氏定氮法 1. 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧 化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为 氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与 滴定
这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够
就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。
吸收液有：
1.标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲基红指 示剂
2 .硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂
目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替 H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是 强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定 时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为 吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为 保险期间一般用4%。
（1） 消化 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
①加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯 硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高至 400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高 沸点，但效果不如硫酸钾。
C： pro与浓H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2， H2O↑ D： NH3与H2SO4生成硫酸铵
（2）CuSO4的作用（催化剂）
Cu2SO4为红色沉淀，当C完全消化后，反应停 止，红色消失，变为兰色，即消化完全，兰色为 CuSO4的颜色
（3）K2SO4的作用（提高沸点）
沸点由330℃提高到400℃加速了反应过程。
=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样
品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用
的换算等数以何物代替。
（３）蛋白质的测定方法
一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折 射率测定pro含量，如凯氏定氮法、双缩脲法。
另一类是利用团测定pro含量。紫外分光光度法 考马斯亮兰法、福临－酚试剂法
还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml
B 催化剂
用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合 物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结 果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2 的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时
间不同， HgO消化麦子为38min，Se与 CuSO4消化麦子55min，TiO2消化麦子 70min，所以在给出测定结果时要注明催化 剂的类型。
（3）热源的强度
消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大， 即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的， 热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低
（4）氨的蒸馏和吸收及滴定
水蒸汽蒸馏
蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，
硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于
第六节 蛋白质和氨基酸的测 1概述 2 凯氏定氮法
3氨基酸氮的测定
1 概述
（1）食品中的蛋白质含量及测定意义
（2）蛋白质系数
（3）蛋白质测定方法
食品中的蛋白质含量
牛肉 猪肉 兔肉 鸡肉
20 9.5 21 20
大豆 米 面粉 菠菜 苹果
40 8.5 10 2.4 0.4
(1)蛋白质的测定意义 1. pro是组成人体的重要成分之一，人体的一切细胞都
②加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终 点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可 以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒 粉、二氧化钛。
③加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有 机 物氧化速度。
仪器：要 防止爆沸。
各种试剂的作用
（1）浓H2SO4： A：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生 成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2 B： 氧化