绿脓杆菌检验技术

硝酸产气（+） 42 ℃生长（+）
革兰氏染色（Gram staining）:革兰氏染色法是由丹麦医生Gram
于1884年创立，其简要操作分初染→媒染→脱色→复染。如果染色得当， 镜检发现G+菌体呈蓝紫色，G-菌体呈浅红色。通过革兰氏染色法可把所 有细菌分两在类。因此它是分类鉴定菌种的重要指标。其染色机制：通 过初染和媒染操作后，在细菌细胞的膜或原生质体上染上了不溶于水的 结 晶紫与碘的大分子复合物。 革兰氏染色阳性（Gram Positive）:革兰氏阳性菌由于细胞壁厚、 肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧 密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网 孔会因脱水而明显收缩，再加上它基本不含类脂，故用乙醇处理不能在 壁上溶出缝隙，因此结晶紫与 碘复合物仍牢牢阻留下其细胞壁内，使其呈现蓝紫色。 肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它 的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的 缝隙，这样，结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁，因此通过乙醇 脱色后，细胞又呈无色。这时，再经番红等红色染料进行复染，就使革 兰氏阴性获得了浅红色。
操作步骤
检样前化妆品的处理
接样于营养肉汤增菌，37℃， 12h，140rpm培养
分离培养，挑取培养物接于十 六烷基三甲基溴化铵平 板， 37℃，18-24h
配十六烷基三甲基溴化铵培 养基（选择性培养基，大肠杆菌
不能生长，革兰氏阳性菌生长完 全受到抑制）
染色镜检
配绿脓菌素测定用培养基， 明胶培养基，硝酸盐蛋白胨 水培养基，普通琼脂斜面培 养基

革兰氏染色方法操 作步骤
盐 生 水 理 接 种 环 结草 晶酸 紫铵
涂片
自然干燥
固定
干燥 镜检
复染 1min
复 红
脱色 0.5min
95% 乙醇
碘
初 染 1mi n
媒染 1min
液
铜绿假单胞菌镜下形态图示：
氧化酶试验

原理：有氧呼吸过程中，氧化酵素（oxidase）于电子传送系 统扮演一重要角色，其可藉氧分子将已还原之细胞色素 （reduced cytochrome）氧化，产生水或过氧化氢。好氧 菌与部份兼性厌氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本实 验有助于区分奈瑟氏菌属（Neisseria）、假单胞杆菌属 （Pseudomonas）此二属为氧化酵素阳性 (oxidase positive)，与肠道杆菌科（Enterobacteriaceae） 此科之细菌为氧化酵素阴性（oxidase negative）。
成的营养基质。
除营养条件以外，微生物必须在最适酸碱度范围内才表 现出最大生命力，因此，应针对不同的微生物将培养基的pH 值调节到适当范围。
操作步骤
按培养基 配方称量
加水加 热熔化
→
调节 pH值
分装 包装
灭菌 备用
操作步骤
1.绿脓菌素测定用培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面 2.明胶培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 直立制成高层 3.硝酸盐蛋白胨水培养基300ml 加热溶解 调pH 分装有小倒管的试管 高压 直立 制成高层 4.普通琼脂斜面培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面
革兰氏染色阴性（Gram Negative）:革兰氏阴性细菌因其壁薄、
注意事项：

酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度， 则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色 不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌， 所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片 厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为 好。 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因 会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有 出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好 在18~24h之内。

(2)分区划线法。此法适用于含菌多的检测标本，如 粪便，喀痰、细菌固体培养物等。 ①划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标 本涂开并在平板的1/5～1/4面积上划密集的平行线， 接种环火焰灭菌。 ②将平板转约70°角，待接种环冷却后，使接种环 通过已划线的1区5～7次，以后即不与1区接触作 连续密集划线，约占平板面积的1/4，接种环再通 过火焰灭菌。 ③再转平板约70°，如上法在第3区划线，此后接种 环不再灭菌。 ④重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表 面。将平板底放入盖内，接种环灭菌后放下，置 37℃培养。
溶解成液状（+） 生长（+） 未溶解（-） 不生长（-）
实验一 培养基的制备及细菌的 分离培养
实验目的
掌握培养基制备的原理和方法 掌握细菌的分离培养 了解灭菌方法
实验原理
不同的微生物生长繁殖都需要提供一定的营养条件， 在实验室中，微生物的营养是由培养基来提供的。培养基是 按照微生物生长繁殖所需要的营养物质，用人工方法配制而
实验二 染色镜检及五项指标试 验
革兰氏染色方法 涂片→干燥→固定→染色→镜检 1．涂片：取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片做好标记， 并在载玻片中间滴一小滴生理..盐水，以无菌接种环挑取 少量菌体涂片，玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环 靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀 死残留的细菌。 2．干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于 火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。 3．固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通 过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定 于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。
明胶液化实验：可疑菌落→穿刺接种于
明胶培养基→ 37℃ 24h →取出放冰箱 10~30min 呈溶解状为阳性，不溶解则为阴性。 42℃生长实验 ：可疑菌落→普通琼脂 斜面→42℃ 24h→铜绿假单胞菌生长， 而近似的荧光假单胞菌不能生长 。
结果判断
氧化酶（+）绿脓菌素（+） 典型或 可疑菌落 氧化酶（+）绿脓菌素（-） 明胶液化（+） 可报告检出 可报告检出
注意事项1. 2. Fra bibliotek.培养基溶解时，加有琼脂的培养基易 沸，应注意看守。 注意调节培养基的pH。 称牛肉膏用玻片，称甘油用小烧杯。
4.
5.
加热后应补足液量。
注意做好标记。
细菌的分离培养

原理： 通过划线，将混杂的细菌在平板表面逐一分散，经培养 后，各自形成菌落(colony)。根据菌落形态、特征挑选 单个菌落，移种培养后，即得到纯种细菌。
方法： 白色滤纸片 取菌+1滴1% 二甲基对苯二胺 ↓15~30s 变红色（+） 不变色（-）

实验三 结果观察及报告
绿脓菌素实验：2~3个可疑菌落→绿脓
菌素培养基→37℃ 24h →3~5mL氯仿 →振荡 提取液呈蓝色→取液体于一新 试管+1mL1mol/L盐酸 上层盐酸内变为红色为阳性，不变色则 为阴性。 硝酸盐还原产气实验：可疑菌落→硝酸 盐蛋白胨水→ 37℃ 24h →小倒管内有 气体产生为阳性，否则阴性。
化妆品中铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 的检测

目的：
1.了解化妆品中铜绿假单胞菌检测的基本过程。
2.掌握几种培养基的配置方法。 3.掌握铜绿假单胞菌的鉴定及生化特征。

原理：
铜绿假单胞菌为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌， 有鞭毛，在普通培养基上生长良好，菌落大小不一， 平均直径2mm～3mm，扁平，边缘不整齐，且常 呈相互融合状态。氧化酶阳性，能产生绿脓菌素， 此外还能液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，在42℃ 条件下可以生长，可与类似菌区别。
4．染色：
①初染:将结晶紫染液加于涂膜上，1min。 ②媒染:水洗后加芦戈氏碘液处理，1min。
③脱色：水洗后用95％乙醇脱色，并摇动玻片，直至流下的 液体无色为止，约需0.5min。
④复染：水洗后加石炭酸复红稀释液染色，1min。 ⑤水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。 5．镜检： 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染 成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏 阴性菌（G-）。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过 于密集的细菌，常常呈假阳性。 。
方法： 平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。 (1)平行划线法 此法适用于含菌不多的液体标本， 如脑脊液(CSF)、腹水、分泌物、脓汁以及稀薄 的菌液等。 ①左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰 上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本，先在平板 的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线， 约占平板面积的一半。 ②将平板转180°角，从平板另一端开始也划密集 的平行线，直到划满平板的剩余部分。 将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平 板倒置，37℃培养。
操作步骤
特征性检验
氧化酶 试验 绿脓菌素 试验 硝酸盐还原 产气试验 明胶液化 试验 42 ℃生长 试验
取菌+ 1滴 二甲基对 苯二胺
接菌，37 ℃ 24h +氯仿 移出+盐酸
接菌 37 ℃ 24h
接菌 37 ℃ 24h
接菌 42 ℃ 24h
紫红色（+） 不变色（-）
紫红色（+） 不变色（-）
有气体（+） 无气体（-）