高级生物化学研究技术

生化分离方法：离心、层析、电泳和膜分离等

生化分析方法：重量法、化学法、分光光度法、酶法、色谱法

生化制备方法：生物大分子制备的前处理、分离纯化、浓缩与干燥、超临界流体提取法、萃取与相分离、结晶、样品的保存

生化分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。

1 离心技术

1.1 基本原理

离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。

应用：各种生物样品的分离和制备。如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。

生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。

相对离心力

离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。

1.2 离心分类

根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类：差速离心法(differential velocity centrifugation)速率区带离心法（rate zonal centrifugation）等密度离心法（isopycnic centrifugation）

1.2.1 差速离心法

利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。

操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。

差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

关键是选择适合于各分离物的离心力。例如差速离心分离细胞组分

1.2.2 速率区带离心法

速率区带离心法是在离心前于离心管内先预装密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl等），将待分离的样品铺一薄层在梯度液的顶部进行离心。

离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大；

但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。

根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。

梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。

由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制。

如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有有足够的时间使在介质中分离形成区带。

由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。

常用的梯度液有聚蔗糖（Ficoll）、硅溶胶（例如，Percoll）及蔗糖。

离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率向管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列界面清楚的不连续区带。

沉降系数越大，沉降越快。离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时

结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。

离心过程中区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。

离心时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。较长的离心管有助于提高分辨率。

1.2.3 等密度离心法

等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。

等密度离心可在离心前预先配制介质的密度梯度，也可依靠离心力来形成梯度（自形成梯度），此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至可与梯度液混在一起。

在离心过程中由于样品各单一成份向自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。

当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。

沉降与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。

体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转速也不能改变粒子的成带位置。

但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。

此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。

1.2.4 梯度溶液的制备

⑪梯度材料的选择原则

理想梯度材料具备的特点：

①化学稳定性好，与被分离的生物材料不发生反应，对被分离样品渗透很少，且易与所分离的生物粒子分开②溶解度高，可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。

③不会对离心设备发生腐蚀作用。

④容易纯化，价格便宜或容易回收。

⑤较低的光吸收特性，有光折射率的对照资料，浓度便于测定。

⑥物理性质、热力学性质应该是已知的。

但很难找到一种适合于各种密度梯度离心的完美梯度液。

基本符合原则的梯度材料：

①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原

②无机盐类：CsCl、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等

③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等

④硅溶胶：如Percoll

⑤蛋白质：如牛血清白蛋白

⑥重水

⑦非水溶性有机物：如氟代碳等

⑫梯度材料的应用范围

①蔗糖：水溶性大，性质稳定，其最高密度 1.33g/ml，价格低易制备。但渗透压较高，高浓度时粘度较大。线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V。

用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，以及较高的渗透性，不宜用于细胞的分离。

②聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400（相对分子重量400000），Ficoll渗透压低，而粘度特别高，与泛影葡胺混合可降低粘度。用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、