关于免疫细胞的分离与检验课件
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免疫细胞的分离及检测技术课件
Ficoll分离液---聚蔗糖-泛影葡胺溶液
➢2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1 份34%泛影葡胺生理盐水溶液， 比重为1.077± 0.002
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
二 、淋巴细胞分离
（去单核细胞）
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ 磁铁吸引法 ➢ Percoll 分离液法
二、B细胞表面标志
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活 细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死 亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细 胞而使细胞着色（蓝色）。
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。
➢ 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分 子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细 胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B 细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标， 以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1 和B2两个亚群；目前多以CD3-、 CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标 志。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定，临床上将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为 NK细胞。
T细胞及NK细胞
第三节 其他的免疫细胞
抗原提呈类细胞表面标志
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090 ➢Ficoll分离液的密度为1.077±0.001
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
临床免疫学检验 课件 第15章 免疫细胞标志和功能检测技术
PMBC
Ficoll 分离液
(聚蔗糖-泛影葡胺）
２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液 １份34%泛影葡胺生理盐水溶液
纯度达 95%
上层：血浆
外周血
Ficoll
白膜层 中层：分离液
底层：红细胞和多核细胞
二 、淋巴细胞分离
?贴壁粘附法 ?吸附柱过滤法 ?Percoll 分离液法
1.贴壁黏附法
PBMC
37℃ 1 hour
? 外周血单个核细胞分离 ? 淋巴细胞的分离 ? T、B细胞和 T细胞亚群的分离
一、外周血单个核细胞分离
?外周血单个核细胞（ peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和
单核细胞（monocyte ）。
?分离原理 ：根据比重不同进行分离
血小板
PBMC
多核白细胞
红细胞
? 对分离介质的要求：
– 对细胞无毒； – 基本等渗；
分离介质 是关键
– 与血浆和分离细胞不相溶；
– 有特定的比重。
? 不同动物的PBMC 比重有差异：
– 小鼠：1.085
– 大鼠：1.087
– 人：1.075～1.090
? 常用Ficoll分离液(1.077±0.001)分离人的
1. E花环沉淀法
成熟T细胞具有CD2分子 能结合绵羊红细胞
方法：淋巴细胞 +SRBC 悬液→加入分层液
→T细胞形成 E花环而沉于管底 →悬液
中为B细胞。
缺点：分离效率低，易受多种因素影响
2. 尼龙毛分离法(吸附能力差异)
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞
3. 亲合板结合分离法—分离亚群
免疫细胞的分离及检测课件
5
免疫磁珠分离法
6
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
37
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
1
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
免疫磁珠分离法
6
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
37
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
1
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
免疫细胞分离技术
流程长, 步骤繁, 成本高
上海交通大学医学院
人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
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人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
免疫细胞的分离与检测解析80页PPT
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
免疫细胞的分离与检测解析
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
免疫细胞的分离与检测解析
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
15-免疫细胞的分离和保存技术
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、
巴
CD25等。
细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22、 CD29等。
1、E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+ SRBC悬液→加入 分层液→T细胞形成E花环而沉于管→ 悬液中为B细胞。
2、尼龙毛分离法
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管 →洗脱下来的是T细胞。
（二）斑螯敷法
•此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细胞。 •方法：
用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液 → 贴敷在臂内侧皮肤表面 → 4~5小时后皮肤局部充血 → 48小时后局部形成水泡 → 吸取水泡中的组织液，内 含大量巨噬细胞。 •但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感 染。
• 中性粒细胞的分离
→与磁珠结合的细胞运动将受限， 未与磁珠结合的细胞将先被洗脱
→再将该柱移出磁场
→与磁珠结合的细胞将被洗脱。
5、磁性激活细胞 分离器分离法
6、淘选法 (利用 表面标志分离淋 巴细胞亚群）
五、单核巨噬细胞的分离
（一）Percoll分离法 •此法从外周血中分离出单核-巨噬细 胞，但由于此类细胞在外周血中的含 量较低，分离时所需的血量较多。
人：静脉采血，抗凝剂抗凝。 动物：颈静脉采血法、尾部采血法、
眼眶采血法、心脏采血法等。
二、外周血中白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600:1~1000:1， ➢ 两者的比重不同，其沉降速度也不同，通常
用两种方法加以分离。 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉淀法 ➢ 或采用0.83%氯化铵分离法使红细胞破裂后， 洗涤得到白细胞。
2、吸附柱过滤法 •将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下 来的主要是淋巴细胞。
免疫细胞的分离技术
CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、
CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)
髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、
CD257(BAFF)、CD312(EMR2)
血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、
➢ 不同细胞密度不同 ➢ 不同细胞表面生物学特性不同 ➢ 不同细胞表面分化抗原不同
17
免疫细胞的分离技术
根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法） 3、磁性分离法 4、荧光激活分离法 5、其他分离法（花环沉降法）
18
（一）外周血单个核细胞分离
加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的 一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细 胞、树突状细胞、B细胞
10
其他细胞
自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中 性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等
NK细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板
11
免疫细胞的特征
39
方法 （以CD4+T细胞为例）
1. 羊抗兔Ig包被平皿 2. CD4 一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时； 3. 收集未粘附的CD4-T细胞 4. PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞 5. 收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微
镜下观察
40
免疫磁珠法 （Magnetic activated cell
CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、
免疫细胞的分离和功能测定PPT文档共55页
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
免疫细胞的分离和功能测定
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露 沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
▪
谢谢！
55
免疫细胞的分离与计数
实验五免疫细胞的分离与计数一、实验原理外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMBC）包括淋巴细胞与单核细胞，其中T细胞约占50-70%，B细胞约占10-15%，单核细胞约占10-25%，还有部分NK细胞和其他细胞。
常规的促分裂原诱导的T细胞增殖试验和特异性抗原诱导的T细胞增殖试验可直接用PMBC作为靶细胞，其中混杂的单核细胞可作为抗原提呈细胞促进细胞增殖。
对于要求较高纯度T细胞的试验，可以从PMBC中再纯化T细胞。
因此，分离和获取外周血单个核细胞（PMBC）是检测T细胞免疫功能的基础。
目前常用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法直接分离PMBC。
用来分离人和动物外周血PMBC的分离液的比重是1.077±0.001kg/L的聚蔗糖（Ficoll）—泛影酸葡甲胺（Urografin）(F/H)分离液。
当将抗凝血叠加在淋巴细胞分离液表面水平离心后，由于红细胞、粒细胞、单个核细胞、血浆等的比重不同，会出现分层现象，即在离心管中出现5层：最上层是血浆（内含血小板），血浆层和淋巴细胞分离液层之间是PMBC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又称为棕黄层。
吸取血浆与淋巴细胞分离液层之间的白色细胞，即为所需的PMBC。
二、实验目的1. 掌握Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的技术与细胞计数法。
2. 掌握脾细胞的分离与计数方法。
三、试剂与材料1.比重为1.077±0.001kg/L的淋巴细胞分离液；2.无菌Hank’s液（4。
C冰箱保存，临用时将PH值调至7.3-7.6）；3.1%台盼蓝染液；4.柠檬酸钠抗凝剂；5.含10%犊牛血清的RPMI-1640培养液；6.仪器设备：血细胞计数板（hemocytometer）、计数器、显微镜、水平离心机、无菌注射器、碘酒、酒精、无菌试管、无菌吸管、微量移液器和无菌枪头。
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人类血液有形成分的平均密度与直径
密度
血小板 淋巴细胞 粒细胞 红细胞
1.04—1.06 1.06—1.08 1.08—1.09 1.09—1.10
直径（）
8—10 13 7.5
黏附分离法
尼龙毛法 贴壁法 亲和板法 吸附柱法
样品
流体护套
喷嘴 偏转板
接物镜
透镜
滤光片
荧光检测器
激光束
细胞收集管
荧光激活分离法（FACS）
淋
丝裂原（抗原）刺激
巴
细
胞
转
3H-TdR
化
试
验
原
理
示
放射性测定
意
细胞毒检测试验
1、T细胞介导的细胞毒试验 2、NK活性测定 3、ADCC作用测定
细
胞
毒
靶细胞
效应细胞
试
验
原
分离上清
理
示
意
放射性测定
抗体形成试验
1、直接溶血空斑试验 2、间接溶血空斑试验 3、SPA-SRBC溶血空斑试验
直接溶血空斑试验
流式细胞仪
磁性分离法
磁铁吸引法 磁式细胞分类术法
N
S
MACS (阳性选择法）
N
S
MACS (阴性选择法）
其他分离法
花环沉降法 细胞活化克隆法 MHC分子四聚体法
抗原肽-MHC分子四聚体技术
细胞的冻存与复苏
细胞冻存的原理与方法 细胞复苏的原理与方法
细胞冻存罐
第二节 免疫细胞膜分子的检测
13000g超速离心 分别提取DNA 使DNA显色，测定
凋亡百分率 =
上清液OD值 上清液OD值+沉淀OD值
流式细胞仪法
原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可 显示凋亡细胞的特征性亚二倍体 峰。并可经计算分析得出凋亡百 分率。
方法：制备细胞悬液 PI染色 FACS检测
一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型 二、免疫细胞膜分子的检测方法
免疫细胞膜分子检测的原理与类型
1、以抗体识别抗原 2、以配体识别受体
免疫细胞膜分子的主要检测方法
1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法
2、补体依赖的细胞毒试验（CDC） 3、花环形成试验
SmIg的荧光抗体检测法
细胞凋亡的检测方法
1、形态观察法 2、生化检测法 3、流式细胞仪检测法
形态观察法
普通光镜检测——HE染色 甲基绿-派诺宁染色
荧光显微镜检测——溴化丙锭染色
透射电镜检测——典型形态改变
生化检测法
凝胶电泳法 原位末端标记法 二苯胺分光光度法
凝胶电泳法
原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列 （DNA ladder）
关于免疫细胞的分离与检验
第一节 免疫细胞的分类与分离
一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、细胞的冻存与复苏
免疫细胞的特征
1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性
2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子
免疫细胞的起源与分化
红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞
SmIg的酶免疫检测法
染料
补体
补体依赖的细胞毒试验（CDC）
E-花环
花环形成细胞 B细胞
绵羊红细胞 T细胞
EA-花环
EAC-花环
第三节 免疫细胞功能测定
一、转化、增殖试验 二、细胞毒试验 三、抗体形成试验 四、细胞吞噬与杀伤试验
转化、增殖试验
1、淋巴细胞转化试验 2、混合淋巴细胞培养
方法：提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladder现象
原位末端标记法（TUNEL）
原理：利用标记的dUTP，在TdT作用 下结合DNA断片的3’末端羟基， 显示断链DNA，提示凋亡
方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检
二苯胺分光光度法
原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过 超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离， 分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。 方法：裂解细胞
免疫细胞的分离技术
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法 3、荧光激活分离法 4、磁性分离法 5、其他分离法
密度梯度离心法
稀释抗凝血
血浆
淋巴细胞分离液 离心前
单个核细胞
粒细胞 红细胞 离心后
沉降速度 =
2r2（Q—Q0） x g 9
Q =颗粒比重 Q0 =溶质比重 r =颗粒半径 = 形状因子 = 颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数 = 粘稠度 g = 相对离心力
甲月簪基（紫黑色）
NBT还原试验
方法： 1、抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。
2、推片染色、镜检。 正常值： NBT阳性细胞 7.5-15%
第四节 免疫细胞凋亡测定
一、细胞凋亡的概念与原理 二、细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡的概念与原理
1、细胞凋亡的概念 2、细胞凋亡的原理 3、细胞凋亡的特点
间接溶血空斑试验
SPA-SRBC溶血空斑试验
细胞吞噬与杀伤功能试验
1、细胞吞噬功能试验 2、细胞杀菌功能试验
吞有颗粒的吞噬细胞数 吞噬百分率 =
计数的吞噬细胞数
吞噬细胞吞噬的总颗粒数
吞噬指数 =
计数的吞噬细+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
细胞凋亡 （apoptosis）
细胞在内源性基因调控下 发生的主动死亡过程，也称程 序性死亡。
细胞凋亡的过程
凋亡信号——凋亡受体——信号传导— —凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋 白——细胞结构解体——细胞凋亡
细胞凋亡机制
细胞凋亡的特点
1、细胞皱缩 2、染色质边集 3、凋亡小体出现
细胞凋亡