激光共聚焦显微镜的使用和应用

性能特点
二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力
Confocal
A Series of Image of xy-section Cultured gliocyte of rat brain stained by Fluorescin.
性能特点
二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力
Confocal
DM RBC 直立显微镜
Magnification 5x 10x 16x 50x 100x Numeral aperture 0.12 0.30 0.50 0.75 1.20-0.45 Technique Working distance(mm) 13.1 4.9 0.15 0.12 0.07
IMM * W* W
生物医学研究院干细胞研究所 （东安路130号西13号楼410）
基本情况介绍
Leica CLSM
Confocal
显微镜 激光器
基本情况介绍
Leica TCS-NT
Confocal
显微镜
Objective type PL FLUOTAR PL FLUOTAR PL FLUOTAR PL APO N PLAN
性能特点
五. 细胞内各种离子的动态测量和分析
Confocal
利用激光扫描技术，借以特定的荧光探针，快速、 准确地测定细胞内各种离子含量，包括Ca++ 、 Mg++ 、 Na+ 、 K+ 、 H+以及pH值等。 细胞内游离钙测定 细胞内Ca2+稳态的维持对生命活动是至关重要 的，病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢 紊乱，致细胞坏死和凋亡，测定细胞内钙在生理、 病理和药理学上均具有重要意义。
Confocal
DM IRE2 倒直显微镜
Magnification 5x 10x 20x 40x 63x 100x Numeral aperture 0.15 0.4 0.7 1.25 1.4 1.4 Technique
IMM * OIL OIL OIL
780-900nm (DAPI、Hoechst、BFP、CFP)
* IMM=either water, glycerine or oil * W =water 激光器 Argon (488，514nm) He/Ne 543nm He/Ne 633nm
基本情况介绍
Leica TCS-NT
Confocal
基本情况介绍
Leica TCS-SP2
显微镜
Objective type HC PL FLUOTAR HC PL APO CS HC PL APO CS HCX PL APO CS HCX PL APO CS HCX PL APO CS * IMM=glycerin or oil 激光器 Argon (488，514nm) He/Ne 543nm He/Ne 633nm 双光子
性能特点
五. 细胞内各种离子的动态测量和分析
Confocal
性能特点
五. 细胞内各种离子的动态测量和分析
Confocal
Physiology Chart (Time: 10:15:21)
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 s
性能特点
五. 细胞内各种离子的动态测量和分析
Confocal
Cardiomyocytes Fluo-3 Ca2+ -sparks and Ca2+ -waves
性能特点
五. 细胞内各种离子的动态测量和分析
Confocal
性能特点
六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像 多通道同步采集图像
Confocal
扫描模式：xy：观察样品不同层面的荧光强度变化 xz：观察样品沿Z轴的荧光强度变化
性能特点
二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力
Confocal
扫描模式决定了图像的扫描层次。基本上是扫描水平的xy切片或垂直的xz-切片。为建立样品的三维图像，需要在第三维方 向上进行连续的光学切片以产生图像垛。还可以以时间或波长为 第三维坐标进行图像扫描。
性能特点
五. 细胞内各种离子的动态测量和分析
Confocal
提供高分辨率二维图像和三维图像
Confocal
实时动态观察Ca++ 含量变化 准确测定单个细胞内不同部位的Ca++ 含量
钙敏荧光探针 激发波长 发射波长 -------------------------------------------Quin-2 339 nm 492 nm Indo-1 350 nm 485 nm Fura-2 380 nm 510 nm Fluo-3 490 nm 525 nm Calcium Green 505 nm 530 nm Calcium Orange 505 nm 530 nm
扫描模式 xyz xzy xt xyt xzt xyzt xyλ xzλ xyλt xyλz 功能 在Z轴方向上进行连续的xy-切片 在y轴方向上进行连续的xz-切片 连续进行多次线扫描 对xy-切片进行连续多次扫描 对xz-切片进行连续多次扫描 以xyz扫描方式对图像垛进行连续多次扫描 在不同的波长下扫描xy切片 在不同的波长下扫描xz切片 在不同的波长下对xy切片进行连续多次扫描 在不同的波长下对xyz图像垛进行扫描
性能Fra Baidu bibliotek点
六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像
Confocal
四色荧光标记
C. Elegans nervous system, separation of 4 fluorescent proteins: CFP, YFP, GFP, DS RED. Courtesy. Dr. Harald Hutter, MPI for Medical Research, Heidelberg
性能特点
八. 三维重建和三维显示 设定Z轴参数 （厚度、步距） 断层扫描
Confocal
三维软件 （数据重组）
A Series of Image of xy-section Three Dimensional Image Obj: 63.0/1.40 OIL Step: 0.40 64-section
工作原理
Pinhole与图像的关系
Confocal
性能特点
一. 横向分辨率比普通荧光显微镜高1.4倍
Confocal
用抗Tubulin抗体染色的Astrocyte： 非共焦（左）及共焦（右）图像并列显示
性能特点
二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力 样品厚度可达500μm 深度分辨率为0.1μm
仪器简介
Confocal
Leica CLSM (1994.5）
Leica TCS-SP2 (2004.9) Leica TCS-NT (1997.6)
医学神经生物学国家重点实验室 （医学院路138号治道楼801）
基本情况介绍
仪器简介
Confocal
Leica TCS-SP25 (2007.12)
性能特点
三. 采用激光照明
Confocal
探测低对比度或弱荧光信号 通过目镜可直接观察各种生物样品的弱自发荧光
性能特点
四. 观察活组织和活细胞的动态变化
Confocal
四.
性能特点
四. 观察活组织和活细胞的动态变化
Confocal
Drosophila mitosis
pre-cellularized embryo GFP-tagged histone, Tubulin: rhodamine
Confocal
性能特点
八. 三维重建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）
Confocal
性能特点
八. 三维重建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）
Confocal
性能特点
八. 三维重建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）
Confocal
性能特点
八. 三维重建和三维显示 焦点扩展深度法
基本情况介绍
Leica TCS-SP2
Confocal
基本情况介绍
Leica TCS-SP5
显微镜
Objective type
Confocal
DMI6000 倒直显微镜
Magnification 10x 20x 20x 40x 63x Numeral aperture 0.4 0.4 0.7 1.25 1.4 Technique DRY DRY IMM * OIL OIL
基本情况介绍
Leica TCS-SP5
Confocal
工作原理
Confocal
Laser Pinhole
激光束经照明针孔反射至物镜， 在样品的某一焦平面形成一个点，并 进行扫描。聚焦平面内各个像素点的 荧光强度经探测针孔后由光电倍增管 收集放大，迅速形成高清晰度的荧光 图像。
♦ 照明针孔和探测针孔的共轭 ♦ 显微镜的步进马达装置
性能特点
七. 荧光和透射光重叠图像观察和分析
Confocal
用于观察和分析荧光信号在形态结构上的精确定位。
性能特点
八. 三维重建和三维显示
Confocal
LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三 维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的 三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系， 用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。
性能特点
六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像
Confocal
性能特点
六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像
Confocal
Mouse cerebellar cortex. Hoechst 33258, anti-GFAP/Cy5, anti-calbindin-D28k/Cy3
Confocal
A Series of Image of xy-section Obj: 100/1.2NA W
基本情况介绍
Confocal
特殊结构
分辨率提高30%-40% 产生真正意义的三维图像 观察活细胞的动态变化 细胞内离子的动态测量
基本情况介绍
Confocal
系统构成
激光器 扫描装置 荧光显微镜 探测器 计算机 直立或倒置 PMT 系统控制软件 各种应用软件
图像储存和输出设备
基本情况介绍
Confocal Confocal 共聚焦激光扫描显微镜技术
黄娅林 复旦大学上海医学院 医学神经生物学 国家重点实验室
Confocal

Confocal 技术基本情况介绍 Confocal 工作原理和性能特点 Confocal 样品制作和系统操作 Confocal 技术在科研中的作用
基本情况介绍
Confocal
研究各种组织和细胞内物质之间的相互关系 共定位（Co-localization）：是指两个或多 个分子（蛋白）完全处于同一空间位置上。
性能特点
六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像
A B
Confocal
C
D
3 Channels (A, B, C) + Overlay (D)
性能特点
八. 三维重建和三维显示
Confocal
模拟荧光处理法 (Simulated Fluorescence Press, SFP ) 焦点扩展深度法 (extended depth of focus) 双眼立体图对法 动画旋转法
性能特点
八. 三维重建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）
Cultured hippocampal neurons of ratFluo-3(AM)
性能特点
五. 细胞内各种离子的动态测量和分析
Confocal
Ca2+-imaging: UV-uncaging Ca-Indicator: Fluo 4, 488 nm Pancreatic acinar cells
Confocal
共聚焦激光扫描显微镜 Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM, Confocal) 共聚焦激光扫描显微镜在传统荧光显微镜成像 的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激 光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合 计算机对荧光图像进行加工处理观察细胞和组织内 部各个层面或不同侧面的形态变化。
HC PL APO CS HCX PL FLUOTAR HCX PL APO HCX PL APO HCX PL APO * IMM=glycerin or oil 激光器
405nm Laser Argon (458nm，476nm，488nm，514nm) He/Ne 561nm He/Ne 633nm