第五章 微生物的生长繁殖与生存因子

10-2
10-3பைடு நூலகம்
10-4
10-5
第二步：接种平板
10-2
-3
10
10-4
10 -5
各取 1ml，均匀 涂布于 冷固体培养基平板上或 与温热液态固体培养基 混合冷却。
第三步：培养
每一个细菌会生成一个 菌落 稀 释 过 低 菌 落 集 无 计数 度 ， 密 法 可以计数 ，但数量 过多，费 时费力 数量合 适，统 计计算， 作为结 果 数量太少 ，误差因 素太大， 不做计数
菌液滴
染色（或不染色） 面积 1cm2 0.1ml菌液
血球计数板
数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数 125个小格），折算样品细菌浓度；
数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？
(90个÷125) * 400 / 0.1ml =2880个
/ml
适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物
四、细菌生长（数量）测定方法


（一）直接计数法 借助显微镜观察测定 优点：快速 有哪些缺点? 缺点：不能区分细菌的 死活


分四种
1.涂片染色法
0．01ml 菌液均匀涂布，染色
面积 1cm2
目镜中的视野
每个视野的面积 由目测微尺的单 元格量出，视野 中菌液的体积按 比例折算
计数
每个视野细菌的平均数量 细菌数量= 视野中的菌液体积
改善废水生物处理系统中效果的关键是什么？
防止“冲击”、找出并改善限制因
子
为什么不利用对 数生长期的微生物？
对数生长期的微生物生长繁殖 快，代谢活力强，能大量去除废水 中有机物。但相应要求进水有机物 浓度高，则出水有机物的绝对值也 相应提高，不易达到排放标准。
又因为对数期微生物生长繁殖 旺盛，细胞表面的粘液层和荚膜尚 未形成，运动很活跃，不易自行凝 聚成菌胶团，沉淀性能差，致使出 水水质差。

增长率下 降阶段 mg/mL 活 细 胞 重 量
时间 t
0
③内源呼吸及死亡阶段

———内源呼吸+毒物浓度更高


（个体）瘦→死
（群体）死亡率大于出生率 从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。 此时细菌的出生率是否为零呢？为什么？
不是，利用死亡细菌的残体营养 (“化做红泥更护花或人吃人”

对数期的细菌、稳定期或衰亡期、受损细胞、 菌种本身的遗传特性（如转基因高效菌）和接种 富集培养基的细菌 数量也会影响迟缓期的长短。
后三种
稳定期细胞基 本耗尽了各种 辅酶或其他细 胞成分 受损细 胞养伤 修复 富集培养基细 菌需要合成“ 自力更生”酶


在实际工作中如接种菌种以启动 新的水处理设施，投加新鲜污泥 时，接种的细菌不习惯于新环境， 会出现或长或短的迟缓期，迟缓 期的出现会增加操作时间，降低 工作效率
连续生物处理中的细菌状态表
细菌的生 长阶段 迟缓期 应用举例 无 特点
连续化稳定操作中没有这一阶段
1:0.4~0.8BOD.d- 生长繁殖快，代谢活力强，能大量
细菌与降解BOD重量比 去除废水中有机物。（缺点是细菌
对数生长期
高负荷活性污 泥法 (大部分区域) 1:0.4以下
静止期
生物膜法 常规活性污泥法 (大部分区域)
4．比浊计数法
浊——细菌悬浮液的浊度

细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与 菌数量成正比 如何定量二者关系
（二）间接计数法(活菌计数法)

前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？
繁殖

细菌繁殖的可见现象是什么？ 产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养）


2、连续培养


一方面连续进料，另一方面又连续出料。
原理：进料=补足营养(“污染物”)


出料=稀释菌浓度、毒物浓度
它又分为两种：恒浊连续培养、恒化连续培养。
（1）恒浊连续培养

新鲜培养基
流速控制阀
恒浊——培养基浊度 恒定（实质是细菌数 量恒定）
很少应用

反 馈 控 制
光电池
出 水
光源
（2）恒化连续培养 化——？ 进料营养物总量
细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细 菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。
3.比例计数法

比例——样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例 红血球数已知(男性400~500万个／ml，女性350~450万个／ml)， 平均400万个/ml
红 血 球
样品溶液与等体积的血液混合
涂片
细 如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量 菌 比例为5.5：1，则细菌数量=？ 5.5×400万个/m l =2.2×107个/mL样品
适应环境的变化，可有性生殖；
团结就是力量
细菌群体力量改变环境

通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细 菌群体的生长规律——“生、老、病、死”。 细菌群的“生、老、病、死”表现为何呢？
外界因素引起的细菌数量的增加、停滞、衰 减等变化。 如何研究呢？ 测菌数量变化与外因的关系



细菌两次细胞分裂之间的时 间，称为世代时间。

一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为 宜。


平 第四步：均 计数


细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
如国标法水中细菌总数的测定 。
静止期的微生物代谢活力虽然 比对数期差，仍有相当的代谢活力， 去除有机物效果较好。最大特点是 体内积累了大量贮存物，强化了微 生物的生物能力，自我絮凝、聚合 能力强，泥水分离效果好，出水水 质好。
用延时曝气法处理低浓度有 机废水时，不用静止期的微生物， 而利用衰亡期的微生物的原因是： 低浓度有机物满足不了静止期微 生物的营养要求，处理效果不好。
我们可以通过哪些手段缩短停滞期呢？
采用处于高效菌群对数期的菌种、增大接种 量、尽量保持接种前后所处的培养介质和条件 一致等方法来缩短或消除迟缓期
（2）对数期（青年）
dX KX dt
K——比例常数
所有细菌均繁殖

X ln Kt X0
细菌数目X增长率倍率的
对数与时间成正比。
故称对数期。（相当于重量法细菌曲 线的增长率上升阶段）
在这期间，细胞核物质和细 胞质加倍增长，之后，平均分到 两个新细胞中。
二、研究微生物生长的方法 “生、老、病、死”

（根据投食方式） 分间歇式培养 （分批培养） 、
连续式培养两种情况


1.分批培养（间歇培养） （“坐吃山空型”）
如何人工进行细菌间歇培养？ 只有开始时的一次性投料和接种细菌（其余时间 细菌根据环境变化自行生灭）
计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌.
缺点：慢 分固体培养法和液体培养法
1.
稀释平板计数法—固体培养法
1mL 混合 1mL 混合
第一步：菌样巧妙稀释
无菌水 9mL
1 ： 10-1
10mL 10-1 ：
菌样被 无菌水 不同稀 释倍率 后平板 10-2 培养图 得到不同 稀释度 （10-x） 菌液
应用：生理特性研究、生物发酵和生物治污
生长情况用活细菌生长曲线来描述
（1）活细菌重量变化曲线
曲线：群体重量W(mg/l)——时间t
增长率上 增长率下 细菌内源呼吸 升阶段 降阶段 及细菌大量死亡阶段
mg/L 活 细 菌 重 量
曲线t`点切线斜率值= t`重量增长速率
?
0
t`
时间 t
①增长速率上升阶段
缓 慢 期 对 数 期 0 静止期 衰老期

t
时间
？
人 （4）衰亡期（老年） 类 死亡率＞出生率（相当于重量法的内源呼吸阶段） 群 体 如何给细菌延年益寿呢？ 有 补营养、环保（去除环境毒物） 类 如果把地球看作是封闭的间歇式培养基，人类看作 似 是细菌，人口若不加控制，必将经历由于资源枯竭， 规 律 污染物遍地而引发的大灭绝。 吗 自救——节约、节育防止“营养物消耗过快”， 环保防止“有害代谢物毒性抑制”。

注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小 误差
2.稀释液体计数法

特点：液体培养、统计学查表计数 又称MPN法 （或最可能数法）
Most



各种生物具有类似的规律
实验室通常采用细菌的数量变化绘制生长曲线，虽然两种曲 线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途。
2．细菌数量生长曲线
生 长 速 + 率 0
对 数 期
_
细 菌 数 目 的 对 数 值
停 滞 期
总菌数
静止期
衰 亡 期
活菌数
0 时间t
细菌的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便， 0~10代表1～1010
特点

四个时期
最短
繁殖速度最快
平均代时（繁殖一代的时间）
细菌的代时与哪些因素有关？ 种类遗传 、个体健康情况(营养、环境条件)
细 菌 数 目 的 对 数 值 0 对 数 期
如大肠杆菌在20℃时其代 时是35℃条件下的2倍； 伤寒杆菌在含0.125％的蛋 白胨培养基中的代时为 时间t
800min，而在含1.0％ 时仅为40min。
流速恒定

新鲜培养基
流速控制阀
应用：环境工程、生物 工程、实验室研究（细 菌生理特性研究、细菌 的快速筛选等）。 出 水

目前, 污水连续生物处理法均类似于恒化连续 培养；（流速不完全恒定）
3．细菌的生长曲线在污水微生物处理 中的应用
不同的生物反应器，乃至同一
反应器内不同位置处 细 菌 的 生 长状态可能不同！
衰亡期
低浓度污水延时 营养物浓度过低，难以满足其他阶 曝气法 段细菌的生长需要 污泥的厌氧消化
表面的粘液层和荚膜尚未形成，运 动很活跃，不易自行凝聚成菌胶 团，沉淀性能差，致使出水水质有 机物浓度相对较高） 虽然比对数生长期的差，但仍有相 当的代谢活力，细菌体内积累了大 量贮存物，如异染粒、聚β —羟基 丁酸等，体表的粘液层和荚膜强化 了细菌的生物吸附能力， 自我絮 凝、聚合能力强，在二沉池中泥水 分离效果好，出水水质好。

哪个时期（停滞期、对数期、静止期、衰亡期）
代时最具有种属代表性？为什么？ 最短值→无限长（休眠） 对数期代时——最短值

细菌代时通常指最适条件下的对
数期代时
（3）静止期（中年）

出生率＝死亡率

死亡原因—
细 菌 数 目 的 对 数 值
营养短缺、代谢毒物增 多
（相当于重量变化曲线中 的增长率下降阶段）
=
××个/mL
1视野菌液(ml)＝(0.01ml ／1cm2)*视野面积(cm2)
2.计数器(血球计数板）测定法
每小格深 0.1cm 盖玻片 载玻片
0.052cm2×25
计数格=4×4=16 大格 血球计数板 1 大格=5×5=25 小格 1 小格=0.05cm×0.05cm=0.0025cm2 总体积=16×0.1×25×0.0025=0.1cm3=0.1mL
平 推 流 式 活 性 污 泥 法
衰亡期

静止期
占优势
对数期
进水

细菌生长必然维持在一个与水质环境相适 应的阶段； 同一种方式中的细菌生长状态是否一成不 变呢？ 随水质波动而波动




毒害物波动(“冲击”)
营养波动(“失衡”)

“失衡”是绝对的！
总有限制性营养物控制生长。


(———按营养配比，相对贫乏的营养物)
（1）停滞期－“万事开头难” 特征： 代谢活跃，个体体积、重量增高

细 菌 数 目 的 对 数 值
不立即进行细胞分裂、增殖，数量不变甚至减少
岗前培训 停 滞
期
为什么会出现停滞期呢？ 适应环境（合成相应的 酶），营养储备（用于复 制合成）
0
时间t

根据上述原因选择接种何种状态的细菌迟缓期
会较长？

为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？ A.营养物丰富，细菌增殖；B.细菌在细胞内以糖原、油 滴等形式储存营养物，细菌个体重量增大
增长率 上升阶段
生
mg/mL 活 细 胞 重 量
0
时间 t
②增长速率下降阶段

为什么增长速率较前下降了？
营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降
代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制 这些限制性因素还不 是十分严重，细菌的代 谢速度变慢，没有停止
第五章 微生物的生长 繁殖与生存因子
第一节 细菌的生长繁殖
生长——细菌群体数量的增长，不是
个体体积的增长。
为什么这里不考察细菌个体的生长呢？ 个体太小，难观察计量 群体细菌对环境产生影响



各类细菌都是倾向于群居（物以类聚）
一 山 生存状况提高，攻防具佳 不 （攻）群居的细菌获得营养的能力大大高于游 容 离的细菌， （防）群居的细菌不易被天敌伤害， 二 还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动 虎 弱势生物的群居优势是什么？