高效液相色谱(HPLC)简介

流动相
• 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇 ＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 • 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
液相色谱图相关术语(1)
• 色谱图相关术语:
–色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线 –峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 –峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 –峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰 底相交两点之间的距离 –半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰 高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
液相色谱类型
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正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
PDA 可以辅助定性。
液相色谱分析法的特点
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化。兼具分离和分析功能，可以在线检测。
高效液相色谱法的主要类型及原理
1、液-液分配色谱
2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱
4、离子对色谱
5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)
确定最佳的溶剂强度
• ―试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶 剂强度以增加k’，当所有谱峰的k’介于1—20时，其流动相已经接近最佳 了。 • 采用梯度洗脱的实验方法，即在20min内，高强度的溶剂的比例从5%增 加到100%，找出在梯度洗脱期间，流出峰到达中点的时间tx(即流出的第 一谱峰与最末谱峰之间的中心点)，然后用下式计算合适的流动相离开梯 度混合器的时间tk=tx-2t0-tD. • t0为死时间，tD为溶剂由梯度混合器流出，通过泵和所连管线到达柱子的 时间 最佳溶剂强度时溶剂浓度%：=初始浓度（%）+tk/20[最终浓度-初始浓度]
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溶剂脱气
脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需 要脱气。 He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用
柱类型与温度选择性的关系
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柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。 温度的选择性，温度的变化会影响分离度。
色谱柱条件
流速适中，过高会降低塔板数。 当流动相粘度增加时，塔板数会降低， 对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔 板数，在50度时较好。
其他因素
工作压力：低于150bar 操作时间：应尽可能短 峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰 溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
h
A B 1/10h
拖尾
前伸
B T f＝ A
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动 保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰 最 大值所需的时间
液相色谱贮液器的使用及维护
• 常用干净的无水甲醇试剂瓶作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但瓶盖与导 管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器， 即沉子，孔径为10μ m，其作用是：①防止灰尘进入泵缸。② 作为进液导管 的重物，使导管能沉在并底。 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用 0.2μm膜过滤。 贮液瓶要不定期更换，要有2～3个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
液相色Baidu Nhomakorabea分析法
（一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导 入进样器。 2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检 测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。 3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。 这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而ＨＰＬＣ改变的是 流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 • • （二）高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一 种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不 同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
评价液相色谱方法的标准
α，k'，N∶如何控制分离度?
K′是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱。 a 是分离因子，描述两个组分分离的好坏程度，是化学因素。 N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。
改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质 在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加 。
流动相不畅的原因 原因 管路阻塞 长了霉菌 管道有大量气泡造成空化 贮液并盖子太紧 解决方法 更换管路 用稀硝酸洗去管内微生物（洗前必须洗净醇类） 采用色谱的空灌注和湿灌注 抬高贮液并或向并内加压去掉沉子
色谱柱使用及维护（一）
• 在使用前一定要注意看使用说明，了解柱子的使用范围如pH值等，一般来说，硅 胶基质：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 。极端pH的流动相能溶解硅胶。 • 温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃； 5μm柱，＞70℃。 • 柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。。 • 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器， 若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去 2～3mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。 • 延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降40～60 ％）。 • 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） • 避免流动相组成及极性的剧烈变化 • 压力升高是需要更换预柱的信号
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。 ◆ 荧光检测器（FLD）
原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。
特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。
高效液相色谱（HPLC）简介
什么是高效液相色谱(HPLC)？
• HPLC (High Performance Liquid Chromatography ) —高效液相色谱 法 • 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段: 高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器… • 广泛应用于各个领域: 医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业… • 无论在技术上,理论上,还是在应用上仍处于发展阶段
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
←色谱峰
峰宽
基线 ↓ 峰高
时间(分)
液相色谱图相关术语(2)
色谱图相关术语: 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响 应值 标准偏差(σ )(Standard Error):0.607倍峰高处所 对应峰宽的一半 拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏 度高，是通用型检测器。
紫外吸收检测器有三种类型
固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm紫外光。
可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光
光二极管阵列检测器photo－diode－array detector（PDAD，PDA, DAD）：钨灯 和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。
流动相的选择原则
• • • • • • • • ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境
提高柱效的方法
• • • • 固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀 流动相粘度低 低流速 升高柱温。
操作过程图示
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
HPLC的特点
项 目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
高效液相色谱法 样品制成溶液 溶液 吸附、分配、筛析、亲和等 UVD、PDAD、RID等 低、中、高沸点有机化合物 离子型无机化合物 热不稳定化合物 生物活性分子
检测器简介（三）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD）
原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。 色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气 （氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流 动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微 小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光 被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。
气相色谱法 样品需气化或裂解 惰性气体 吸附和分配 TCD、FID、ECD等
应用范围
低沸点有机化合物 永久性气体
高效液相色谱仪构造
HPLC的仪器配置及流程
色器 谱 泵 及 控 制
W a t8 e r s 4 6
数制 据 处 理 及 控
色器 谱 柱 检 测 进 样 器
检测器简介（一）
◆ 紫外吸收检测器（UVD） 原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓 度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。 特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）。 ◆ 折光指数检测器（RID） 原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。 特点：通用性检测器，温变化要保持在±0.001℃、灵敏度低（10-6g）。
• 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团 的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、 乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出， 而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl） 等。