根癌农杆菌介导植物基因遗传转化技术
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• 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)上，将根癌 农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙，可长出转化的 新枝条，新的转化枝条开花结实后，也可以获 得转基因种子；或者通过真空渗透或农杆菌浸 泡拟南芥开花植株，等结实之后，利用筛选萌 芽种子的方法，也可以得到转基因植株及种
子。 。
根癌农杆菌介导转化植株的基本程序
植物表达载体构建—共整合载体系统 (cointegrate vector system)
• 由卸甲Ti质粒载体、中间 表达载体组成。例如： pGV3850、 pLGVneo1103
• 外源基因首先克隆到一个 中间载体（带有重组TDNA的大肠杆菌质粒）上， 该载体含有一段与缺失TDNA的Ti质粒有同源序列。 当该载体进入土壤农杆菌 后，与Ti质粒整合，然后 由Ti质粒提供T-DNA向植物 细胞转移的vir基因产物。
Ti质粒介导转化的过程
• 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位 • 受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香
酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因 编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和 LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链 线性拷贝（T-链） • T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的 细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合 到植物的染色体基因组中 • T-DNA在植物细胞中表达
无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把 中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都 需要三种细菌参与，通常把这一过程称为三亲交 配法
1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重组植物表达载体的大肠杆菌） 原理：三种菌混合时，协助质粒游动进入供体 菌中，将供体菌中的表达载体转移到受体菌中， 最后经过适当的抗生素筛选即可获得土壤农杆菌 转化结合体
• 任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片 段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而 被共整合到Onc-Ti质粒载体上。
改造后的Ti质粒的基本结构
a. DNA复制 起始位点
b. 选择标记 基因
c. T-DNA的 边界序列
d. 多克隆位 点
左边界序列
右边界序列
植物表达载体构建—中间载体的构建
整个过程大致可分为以下几个步骤
①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②根癌农杆菌对植物信号物质的感受； ③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色
体上操纵子的活化； ④T-DNA 复合体的产生； ⑤T-DNA复合体的转运； ⑥T-DNA整合到植物基因组中。
植物表达载体构建— Onc卸甲载体（受体Ti质粒）的构建
根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)
• 在植物基因工程的发展中, 研究最清楚和应用 最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化, 在已 获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌 介导完成的. 起初, 人们认为农杆菌仅能转化双 子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物 ;而近几年, 由于在一些重要的单子叶植物以及 在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法 以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片 段DNA等优点又受到了人们极大的关注.
整株感染法
• 人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒 的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质 粒的根癌农杆菌注射到植物体内，使菌体在植物 体内进行浸染实现转化。
• 为获得较高的转化频率，多采用无菌种子的实生 苗或试管苗。
• 在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切 下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基 上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈 伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导 再生植株
根癌农杆菌介导的植物基因遗 传转化技术
常用的植物基因转化技术
• 农杆菌介导法 • 植物病毒载体介导法（如CaMV） • DNA直接导入法（PEG介导法、脂质体法、基因
枪法、电激法、激光微束法、 显微注射法等） • 种质系统介导基因转化（花粉管通道法等） • 其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重
玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的Tam转座子系统
Ac
Ds
农杆菌介导转化
• 发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）：含有Ri (rootinducing plasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生 毛发状根。
• 根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转 移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物 时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因 在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移， 而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基 因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒已成为植物基因转化中的理 想载体系统。
• 3 DNA水平：点杂交和Southern 杂交， 转录水平：Northern 杂交， 蛋白质水平：Western杂交。这些技术需要转膜、杂交, 操作繁琐, 费 用高, 不适合大批量样品的检测, 可对转基因植株随机取样检测
转基因植物的应用
一、转基因植物在植物分子生物学研究中的应用 1、转座子标签法
浸染叶盘 • 滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将处理过的叶盘置于培
养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄 青霉素的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该 培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞 再生为植株。 • 对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合 有目的基因及其表达情况。
• 叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。 实际上，其他的多种外植体，例如茎段、叶柄、胚轴、 子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的方法进行 转化。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前 应用最多的方法之一。
Ti 质粒介导的转移转化方法
• 基本程序包括：含重组Ti质粒的根癌农杆 菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆 菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培 养，转化植株再生等步骤。
• 叶盘转化法 • 原生质体(或愈伤组织)共培养转化法 • 整株感染法 • 直接转化法（电击法，液氮冷冻法）
叶盘转化法
• 打孔器从消毒叶片上打孔，获得 圆形叶片，即叶盘 • 将叶盘放入根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌
• 野生型Ti质粒不能直接用作克隆外源基因的载 体：1.质量过大 2.酶切位点多 3.T-DNA区Onc基 因干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中复制 5冗余基因
• Onc卸甲载体：无毒的Ti质粒载体。切除了TDNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大肠杆菌 的常用质粒pBR322区段（含Ampr)取代。
叶盘转化法
原生质体共培养转化法
• 以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌 与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残 留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养 基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。与叶 盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体， 一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化 体。应用此法进行基因转化时，其先决条件就 是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术 体系。
复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转 化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青 睐
若干主要的植物细胞转化方法的比较
评价内容
受体材料 宿主限制 培养条件 转化频率 嵌合体
操作 设备要求 工作效率
农杆菌 法
外植体
植物转化方法 PEG法 电击法 微注射法 原生质体 悬浮细胞 细胞或组织
基因枪 法
外植体
基因枪法 显微注射法
优点
缺点
转化效率高 主要以单拷贝或低拷贝形式插入 不需要特殊的专用设备
操作简单 转化效率高 同一实验可处理许多样品 化学法不需要特殊的专用设备
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
只能以T-DNA插入的方式导入寄主 细胞
外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入 化学法需通过原生质体培养及其再 生体系，才能产生 有体细胞克隆变异的风险
需复杂的专用设备 外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入
需昂贵的专用设备 需接受专门训练的技术人员进行操 作
与植物基因转化有关的农杆菌
• 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：含有Ti (Tumor-inducing plasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细 胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。
植物表达载体构建（E.coli） 重组质粒转化农杆菌（三亲）
选择受体材料 建立植株再生体系
遗传转化到宿主细胞（共培养） 转化体筛选（抗生素） 植株再生（组织培养） 转基因植株的检测（PCR、分子杂交等） 田间试验、遗传分析、性状鉴定
转基因植株的检测
• 1 报告基因的检测：报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景 的选择标记, 因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位 素放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达, 从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点, 大致分 为两类: 抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。
花粉管通 道法
卵细胞
有
无
无
无
无 开花植物
简单
复杂
复杂
复杂
简单
无
10-2~10-1 有
10-5~10-4 无
10-5~10-4 无
10-2~10-1 无或有
10-3~10-2 多
10-1~101 无
简单
简单
复杂
更复杂
复杂
简单
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
简便
高
低
低
更低
高
低
若干主要的植物细胞转化方法的比较
Βιβλιοθήκη Baidu
方法 农杆菌介导法 化学法及电激法
• 2 PCR 检测转化植株：PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因DNA 片段的有效方法。能在几小时内使pg 水平的起始物达到ng 乃至μ g 水平, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色后很容易观察, 不 通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于转 化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析
• 双元载体杆菌与共整合载体所不同的是， 它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需 要共整合过程就能在农杆菌内独立复制， 从大肠杆菌转移到农的频率比共整合质粒 的转移频率高10000倍。且改造的Ti质粒时 其多克隆位点无导入pBR322质粒的同源片 段。
lacZ’
三亲交配法（triparental mating ）
• 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称 为“中间载体”。
• 基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物 基因组中去的一段DNA，总长度约为23kb） 片段克隆到普通载体pBR322上，把外源基 因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外 源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌 转化植物把该外源片段导入植物体内。
Ampr
pLGVneo1103
Cointegrate plasmid
植物表达载体构建—双元载体系统 (binary vector system)
• 由微型质粒、辅助 Ti质粒组成。 例如：Bin19、 pAL4404
• 包括两个彼此相容的穿梭载体（微型质粒）和 辅助Ti质粒。 穿梭载体不带有vir基因，但带有大肠杆菌及土 壤农杆菌的复制起始位点。所有基因操作可以 在大肠杆菌中完成，之后转入一种经修饰后的 Ti质粒农杆菌中，该Ti质粒包含一整套vir,但缺 失T-DNA序列而无法转移，这样可提供仅vir基 因产物帮助双元载体转移。
细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱 的基因； • ②Vir 区：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性； • ③Con 区(接合转移编码区)：该区段上存 在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移； • ④Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调 控Ti 质粒的自我复制。
Ti质粒
• Ti质粒（tumor-inducing plasmid）：Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质， 为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中 有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA）， 能转移并整合到植物基因组中，并导致冠 瘿瘤的形成
• Ti 质粒可分为4 个功能区域： • ①T-DNA区：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物
子。 。
根癌农杆菌介导转化植株的基本程序
植物表达载体构建—共整合载体系统 (cointegrate vector system)
• 由卸甲Ti质粒载体、中间 表达载体组成。例如： pGV3850、 pLGVneo1103
• 外源基因首先克隆到一个 中间载体（带有重组TDNA的大肠杆菌质粒）上， 该载体含有一段与缺失TDNA的Ti质粒有同源序列。 当该载体进入土壤农杆菌 后，与Ti质粒整合，然后 由Ti质粒提供T-DNA向植物 细胞转移的vir基因产物。
Ti质粒介导转化的过程
• 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位 • 受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香
酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因 编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和 LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链 线性拷贝（T-链） • T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的 细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合 到植物的染色体基因组中 • T-DNA在植物细胞中表达
无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把 中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都 需要三种细菌参与，通常把这一过程称为三亲交 配法
1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重组植物表达载体的大肠杆菌） 原理：三种菌混合时，协助质粒游动进入供体 菌中，将供体菌中的表达载体转移到受体菌中， 最后经过适当的抗生素筛选即可获得土壤农杆菌 转化结合体
• 任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片 段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而 被共整合到Onc-Ti质粒载体上。
改造后的Ti质粒的基本结构
a. DNA复制 起始位点
b. 选择标记 基因
c. T-DNA的 边界序列
d. 多克隆位 点
左边界序列
右边界序列
植物表达载体构建—中间载体的构建
整个过程大致可分为以下几个步骤
①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②根癌农杆菌对植物信号物质的感受； ③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色
体上操纵子的活化； ④T-DNA 复合体的产生； ⑤T-DNA复合体的转运； ⑥T-DNA整合到植物基因组中。
植物表达载体构建— Onc卸甲载体（受体Ti质粒）的构建
根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)
• 在植物基因工程的发展中, 研究最清楚和应用 最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化, 在已 获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌 介导完成的. 起初, 人们认为农杆菌仅能转化双 子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物 ;而近几年, 由于在一些重要的单子叶植物以及 在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法 以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片 段DNA等优点又受到了人们极大的关注.
整株感染法
• 人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒 的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质 粒的根癌农杆菌注射到植物体内，使菌体在植物 体内进行浸染实现转化。
• 为获得较高的转化频率，多采用无菌种子的实生 苗或试管苗。
• 在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切 下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基 上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈 伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导 再生植株
根癌农杆菌介导的植物基因遗 传转化技术
常用的植物基因转化技术
• 农杆菌介导法 • 植物病毒载体介导法（如CaMV） • DNA直接导入法（PEG介导法、脂质体法、基因
枪法、电激法、激光微束法、 显微注射法等） • 种质系统介导基因转化（花粉管通道法等） • 其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重
玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的Tam转座子系统
Ac
Ds
农杆菌介导转化
• 发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）：含有Ri (rootinducing plasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生 毛发状根。
• 根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转 移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物 时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因 在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移， 而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基 因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒已成为植物基因转化中的理 想载体系统。
• 3 DNA水平：点杂交和Southern 杂交， 转录水平：Northern 杂交， 蛋白质水平：Western杂交。这些技术需要转膜、杂交, 操作繁琐, 费 用高, 不适合大批量样品的检测, 可对转基因植株随机取样检测
转基因植物的应用
一、转基因植物在植物分子生物学研究中的应用 1、转座子标签法
浸染叶盘 • 滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将处理过的叶盘置于培
养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄 青霉素的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该 培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞 再生为植株。 • 对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合 有目的基因及其表达情况。
• 叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。 实际上，其他的多种外植体，例如茎段、叶柄、胚轴、 子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的方法进行 转化。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前 应用最多的方法之一。
Ti 质粒介导的转移转化方法
• 基本程序包括：含重组Ti质粒的根癌农杆 菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆 菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培 养，转化植株再生等步骤。
• 叶盘转化法 • 原生质体(或愈伤组织)共培养转化法 • 整株感染法 • 直接转化法（电击法，液氮冷冻法）
叶盘转化法
• 打孔器从消毒叶片上打孔，获得 圆形叶片，即叶盘 • 将叶盘放入根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌
• 野生型Ti质粒不能直接用作克隆外源基因的载 体：1.质量过大 2.酶切位点多 3.T-DNA区Onc基 因干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中复制 5冗余基因
• Onc卸甲载体：无毒的Ti质粒载体。切除了TDNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大肠杆菌 的常用质粒pBR322区段（含Ampr)取代。
叶盘转化法
原生质体共培养转化法
• 以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌 与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残 留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养 基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。与叶 盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体， 一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化 体。应用此法进行基因转化时，其先决条件就 是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术 体系。
复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转 化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青 睐
若干主要的植物细胞转化方法的比较
评价内容
受体材料 宿主限制 培养条件 转化频率 嵌合体
操作 设备要求 工作效率
农杆菌 法
外植体
植物转化方法 PEG法 电击法 微注射法 原生质体 悬浮细胞 细胞或组织
基因枪 法
外植体
基因枪法 显微注射法
优点
缺点
转化效率高 主要以单拷贝或低拷贝形式插入 不需要特殊的专用设备
操作简单 转化效率高 同一实验可处理许多样品 化学法不需要特殊的专用设备
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
只能以T-DNA插入的方式导入寄主 细胞
外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入 化学法需通过原生质体培养及其再 生体系，才能产生 有体细胞克隆变异的风险
需复杂的专用设备 外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入
需昂贵的专用设备 需接受专门训练的技术人员进行操 作
与植物基因转化有关的农杆菌
• 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：含有Ti (Tumor-inducing plasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细 胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。
植物表达载体构建（E.coli） 重组质粒转化农杆菌（三亲）
选择受体材料 建立植株再生体系
遗传转化到宿主细胞（共培养） 转化体筛选（抗生素） 植株再生（组织培养） 转基因植株的检测（PCR、分子杂交等） 田间试验、遗传分析、性状鉴定
转基因植株的检测
• 1 报告基因的检测：报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景 的选择标记, 因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位 素放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达, 从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点, 大致分 为两类: 抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。
花粉管通 道法
卵细胞
有
无
无
无
无 开花植物
简单
复杂
复杂
复杂
简单
无
10-2~10-1 有
10-5~10-4 无
10-5~10-4 无
10-2~10-1 无或有
10-3~10-2 多
10-1~101 无
简单
简单
复杂
更复杂
复杂
简单
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
简便
高
低
低
更低
高
低
若干主要的植物细胞转化方法的比较
Βιβλιοθήκη Baidu
方法 农杆菌介导法 化学法及电激法
• 2 PCR 检测转化植株：PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因DNA 片段的有效方法。能在几小时内使pg 水平的起始物达到ng 乃至μ g 水平, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色后很容易观察, 不 通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于转 化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析
• 双元载体杆菌与共整合载体所不同的是， 它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需 要共整合过程就能在农杆菌内独立复制， 从大肠杆菌转移到农的频率比共整合质粒 的转移频率高10000倍。且改造的Ti质粒时 其多克隆位点无导入pBR322质粒的同源片 段。
lacZ’
三亲交配法（triparental mating ）
• 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称 为“中间载体”。
• 基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物 基因组中去的一段DNA，总长度约为23kb） 片段克隆到普通载体pBR322上，把外源基 因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外 源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌 转化植物把该外源片段导入植物体内。
Ampr
pLGVneo1103
Cointegrate plasmid
植物表达载体构建—双元载体系统 (binary vector system)
• 由微型质粒、辅助 Ti质粒组成。 例如：Bin19、 pAL4404
• 包括两个彼此相容的穿梭载体（微型质粒）和 辅助Ti质粒。 穿梭载体不带有vir基因，但带有大肠杆菌及土 壤农杆菌的复制起始位点。所有基因操作可以 在大肠杆菌中完成，之后转入一种经修饰后的 Ti质粒农杆菌中，该Ti质粒包含一整套vir,但缺 失T-DNA序列而无法转移，这样可提供仅vir基 因产物帮助双元载体转移。
细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱 的基因； • ②Vir 区：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性； • ③Con 区(接合转移编码区)：该区段上存 在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移； • ④Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调 控Ti 质粒的自我复制。
Ti质粒
• Ti质粒（tumor-inducing plasmid）：Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质， 为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中 有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA）， 能转移并整合到植物基因组中，并导致冠 瘿瘤的形成
• Ti 质粒可分为4 个功能区域： • ①T-DNA区：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物