根癌农杆菌介导植物基因遗传转化技术
分子生物学-根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化
根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化1 柑桔材料的准备不同品种的柑桔胚性愈伤组织保存于MT固体培养基上，每20-25d继代一次。
侵染前转入悬浮MT（附加100μM乙酰丁香酮）培养基中培养4天后用于侵染。
2 农杆菌侵染液的制备1.农杆菌（保存在-70℃）在含有50 mg·L-卡那霉素的YEB选择培养基上划线培养，28℃暗培养。
2.长出菌落后，挑取单菌落在新的选择培养基上涂皿。
3.取出培养24小时后的菌落群，再用不加卡那霉素的MT（附加100μM乙酰丁香酮）液体培养基震荡培养2个小时。
4.用分光光度计测量菌液的OD600值，并用MT液体培养基调整到 OD600=0.5～1.0进行侵染。
3侵染实验1.将悬浮培养4d的愈伤组织转入稀释菌液中浸泡20-30 min。
2.用无菌滤纸吸干表面菌液，转到MT基本培养基上，19℃共培养2～3 d。
3.共培养后的愈伤组织在无菌水中轻轻漂洗数次，直至洗液变清为止，再加入含有400 mg/L头孢霉素的无菌水浸泡20 min，倾去洗液。
4.将外植体置于无菌滤纸上吸干，转入筛选培养基（根据不同的质粒载体添加不同浓度的筛选剂），28℃暗培养。
4抗性愈伤组织的选择培养和再生（以质粒载体pCAMBIA1303为例）1.愈伤组织刚转移到筛选培养基上时，应该表现为对照逐渐褐化、死亡，转化处理的愈伤组织中转化部分逐渐长出新的抗性愈伤组织。
2.将新形成的抗性愈伤组织转至新的筛选培养基上进行继代培养，当得到的抗性胚性愈伤组织达到一定量时，将一部分转入MT+甘油2%+ Cef 50 mg·L-1的胚状体分化固体培养基上。
3.有球形胚状体开始出现后，将得到的胚状体转入MT+ME 1500 mg·L-1+ Cef50 mg·L-1培养基上，使胚状体进一步长大，形成子叶型胚状体。
7-9周后，将子叶型胚状体转入MT+Cef 50 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 +BA 0.5mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培养基上再生芽，1个月后就可见再生芽长出。
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes ）。
根癌农杆菌含有 Ti 质粒。
发根农杆菌含有 Ri 质粒。
根癌农杆菌的 Ti 质粒和发根农杆菌 Ri 质粒都具有一段转移 DNA （transfer DNA ，又称 T-DNA），在农杆菌侵染植物时， T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于 T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和 Ri 质粒上可插入大到甚至 150kb 的外源基因，因此， Ti 质粒和 Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和 Ti 质粒上 T-DNA 以外 Vir 区的基因。
染色体基因包括 chvA 、chvB 、att 、pscA 、chvD 以及 chvB 。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低 pH 和磷酸饥饿情况下提高 VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与 VirA 蛋白共同对 virG 起激活作用。
原始的 Ti 质粒根据其功能的不同，可分为 4 个区：（ 1） T-DNA 区：是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段 DNA ，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与 T-DNA 本身的转移与整合无关。
T-DNA 上最重要的是两端的2个边界（LB和RB），它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在， T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA 的右边界在 T-DNA 的整合中对于靶 DNA 位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于 T-DNA 以外的 1 个 30~40 kb 的区域内，该区段编码的基因但对 T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为 Ti 质粒编码毒性基因（vir）。
根癌农杆菌
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
33
也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
14
杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
34
基因枪
35
1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
13
Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。
根癌农杆菌介导法原理
根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。
它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。
本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。
根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。
它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。
2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。
2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。
3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。
4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。
根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。
转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。
•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。
•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。
2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。
通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。
•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展植物真菌是一类重要的微生物，在自然界中具有重要的地位，它们可以在植物体内或外引起多种作物的病害。
为了有效防治和控制植物真菌的病害，基因转化技术已经成为一种重要的手段。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术具有高效、简单、灵活等特点，在植物真菌遗传改良研究中得到了广泛应用。
本文将对根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展进行综述。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术是利用根癌农杆菌T-DNA插入真菌染色体中，实现外源基因的导入。
根癌农杆菌T-DNA在感染植物组织过程中，T-DNA的两侧的重复序列对应产生质粒的头部和尾部，T-DNA插入到植物基因组中去除了生发区和生殖区基因的调节因子，导致细胞无法分化造成根癌，自然或人工去除这些基因后，再将目的基因嵌合到T-DNA后导入目标植物组织并在细胞层或组织层产生效应。
1. 研究目的明确根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究目的是为了利用该技术将外源基因导入真菌细胞中，从而使真菌获得新的性状或功能。
目前，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术已被成功应用于多种真菌，如白僵菌、酿酒酵母、木霉等。
这些研究表明，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在真菌改良中具有广阔的应用前景。
2. 技术改进在根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究过程中，研究人员还对该技术进行了不断改进，以提高其转化效率和稳定性。
通过对根癌农杆菌T-DNA的结构和功能进行深入研究，研究人员已成功构建了一些具有高效转化能力的根癌农杆菌株系，并利用这些株系进行了真菌遗传转化研究。
研究人员还对真菌遗传转化的各个环节进行了逐一优化，从而取得了一系列令人满意的研究成果。
3. 应用领域拓展三、面临的挑战与未来展望尽管根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在植物真菌遗传改良研究中取得了一系列的进展，但在实际应用中仍然面临着一些挑战。
由于真菌的遗传特性复杂，其遗传转化技术相对于细菌和植物来说较为困难，因此对真菌的遗传机制和代谢途径的研究仍需要进一步加强。
实验七 农杆菌介导法转化烟草
实验七 农杆菌介导法转化烟草一、实验目的（1）了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤。
（2）掌握遗传转化的基本操作技术。
二、实验原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。
我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料、器材与药品1、材料烟草、LBA4404菌株质粒载体为pBi1212、器材摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。
3、药品MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、6-BA、IAA。
四、实验步骤1、根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在 YEP 固体培养基上，YEP 固体培养基的成分为每100ml含NaCl 0.5g、酵母 1g、水解酪蛋白 1g、琼脂 1．5g、pH7．0。
在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。
2、配制 YEP 液体培养基：成分同上，只是添加卡那霉素而不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5ml左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。
3、摇菌：用灭菌的牙签或者火柴棍等挑出单菌落，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于27℃摇床上摇菌16-17h（180r/min） ，培养至 OD600为 0．6～0．8。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型:根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
根癌农杆菌含有Ti 质粒。
发根农杆菌含有Ri 质粒.根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA （transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T—DNA 以外Vir 区的基因。
染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T—DNA区:是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T—DNA上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在，T—DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T—DNA的右边界在T—DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此,尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T—DNA以外的1个30～40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗 的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌 污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长； 具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生 质体再生困难，获得转化株少，操作比较 复杂。
• 叶盘转化法 • 优点：适用性广；改良的叶盘法可以适用于其它 外植体如茎段、子叶等；操作简单且重复性高。 • 注意事项：掌握叶组织侵入农杆菌培养液的适宜 时间；叶片在培养过程中常膨大而扭曲，可把切 口边缘压入埋藏在培养基中；制备叶盘是最好避 免叶脉进入。
农杆菌Ti质粒转化系统的优点
• 该转化系统是模仿天然的转化载体系统，成功率高， 效果好； • 机理研究最清楚，方法最成熟，应用最广泛； • Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片段插入，目 前已把50kb的DNA转入植物细胞中； • 农杆菌Ti质粒转化系统的外源基因以单拷贝为多 数，遗传稳定性好，且多数符合孟德尔遗传规律。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因 导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源 基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞 转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些 冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆 菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染 领域。
二、根癌农杆菌转化程序及操作原理
农杆菌基因转化可分为三部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
农杆菌附着后不能立即转化只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤因此共培养时间必须长于16h时间过长由于农杆菌的过度生长植物细胞因受到毒害而死亡
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。
自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。
农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。
农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
简略地说。
其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。
根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展
・综述与专论・生物技术通报Ｂ１０ＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹＢＵＬＬＥＴｌＮ２０１０年第３期根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展范亮波李梅冀颖刘卫德蒋细良（中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室，北京１０００８１）摘要：木霉作为土传植物病原茵的生防真菌，研究其功能基因具有重要的意义。
根癌农杆茵介导的遗传转化（ＡＴＭＴ）为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。
对根癌农杆茵介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。
关键词：根癌农杆茵木霉茵遗传转化Ｔ・ＤＮＡＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＭｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＦａｎＬｉａｎｇｂｏＬｉＭｅｉｊｉＹｉｎｇＬｉｕＷｅｉｄｅＪｉａｎｇＸｉｌｉａｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ如ｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｇａｉｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｔｏａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓｏｉｌ－ｂｏｒｎｅｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓａｎｄｉｔｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｉｔ＇ｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｆｏｒｗｈｉｃｈＡＴＭＴｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔ００１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｎｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｔｒａｎｓ—ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＴ・ＤＮＡ木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，是一种广泛存在于土壤中的丝状真菌。
甘蔗根癌农杆菌介导遗传转化研究
Ｗ ａ ｇＺ ｚ ａ ｇ ２ Ｚｈ ｎ ｈ ｚ ｅ ｎ ｉｈ ｎ ａ ｇＳ ｕ ｈ ｎ Ｌｕ ｉ ｇ ｉ ｇ Ｌ Ｙａ ｇ ｕ ｏ Ｊｎ ｐ ｎ ｉ ｎ ｒｉ
（ ． ａｉｎ ｌ ｙ ｉｔｃ ｎ ｌｇ Ｌ ｂ ｒｔ ｙｆ ｒ ｒ ｐｃ Ｃ ｐ ， ｈ ｅ ｅ ａ ｅ １ Ｎ ｔ ａ Ｋｅ Ｂ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ ａ ｏａｏ ｏ Ｔ ｏ ｉ ｏ ｒ ｌ ｏ ａ ｒ ｓ Ｃ ｉ ｓ Ａｃｄ ｍｙｏ Ｔ ｐ ｃ Ａｇｉｕｔｒｌ ｃｅ ｃ ｓ Ｈ ｉ ｕ ５ １ ０ ， ｎ ｆ ｒ ｉａ ｒ ｌ ａ Ｓ ｉ ｅ ， ａｋ ７ １ １ ｏ ｌ ｃ ｕ ｎ ｏ
养 获得 ＧＵＳ及 Ｓｕｈｒ 测 阳性 植 株 ；ｎｉｕｚｏ ｏ ｔｅｎ检 Ｅ ｒ ｅ－－ ｑ ｂｅｏ 习 携 带 抗 除 草剂 基 因 （ ａ ） Ｃ ８ ｒｇｎ 将 ｂｒ 的 ５Ｃ１菌
根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展与对策
根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展与对策张洁;周岩【摘要】在植物基因工程中,根癌农杆菌介导法是目前研究得较为深入、技术较为完善有效的转基因方法.但由于单子叶植物不是根癌农杆菌的天然宿主,因此阻碍了根癌农杆菌介导法在单子叶植物遗传转化研究方面的应用.随着分子生物学的迅猛发展,人们对农杆菌介导法的转化机理、影响因素不断探索与研究,使根癌农杆菌介导法被逐步应用于单子叶植物中,尤其是禾本科作物,并取得突破性进展.对农杆菌转化机理与特点、影响单子叶植物转化的因素进行介绍,综述农杆菌介导法在小麦、玉米和水稻三大作物遗传改良方面的研究进展,并从超声波处理、表面活性剂、抗氧化剂和乙酰丁香酮的添加四个方面阐述提高农杆菌转化单子叶植物转化效率的对策,以期为农杆菌转化单子叶植物的进一步改进与优化提供参考.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】8页(P7-14)【关键词】农杆菌;单子叶植物;研究进展;对策【作者】张洁;周岩【作者单位】河南科技学院生命科技学院,新乡453003;河南科技学院生命科技学院,新乡453003【正文语种】中文自1983年成功获得第一例农杆菌介导的转基因烟草以来，有关农杆菌介导的基因转移的应用研究逐步发展成为植物基因工程领域的研究热点，通过农杆菌介导法转化植物的研究也日益广泛和深入。
农杆菌介导法具有转化植物受体，操作易行，经济简便，可插入大片段DNA，整合于基因组上的外源基因拷贝数少且重排程度低，技术仪器要求低，转化效率高等颇多优点。
由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，利用农杆菌介导法对单子叶植物进行遗传转化的研究因此受到限制。
Portrykus［1］曾认为农杆菌转化单子叶植物是不可能的。
禾谷科作物如水稻、小麦、玉米都是单子叶植物，是人类重要的粮食作物，利用基因工程技术对该类植物的研究具有十分重要的价值。
近年来，随着农杆菌介导法转化机制和影响因素的进一步研究以及转化方法的不断完善，农杆菌介导法已逐步发展成为大部分双子叶植物和一部分单子叶植物遗传转化的主流方法，以及植物基因工程中不可或缺的研究工具，具有极大的应用价值。
根癌农杆菌介导的植物转化-叶盘转化法
根癌农杆菌介导的植物转化－叶盘转化法一、原理以根癌农杆菌介导的遗传转化是目前最有效的途径之一。
根癌农杆菌对植物释放的化学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。
经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。
Vir基因产物使Ti质粒上的T－DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。
插入在T－DNA左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。
二、目的了解根癌农杆菌介导的植物基因转化的方法和用途，掌握叶盘转化法的基本原理和操作。
三、材料、试剂和器具1、烟草、甘蓝无菌苗或田间生长的植株。
2、含目的基因的共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
3、YEB液培养基。
4、抗菌素储备液(Kan, Cif, Rif, Amp)。
5、MS基本培养基。
6、MS分化培养基。
7、70％乙醇。
8、0.1%升汞。
四、操作步骤1、取幼嫩健康的叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6－8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。
2、将无菌叶片剪成份0.5cm×0.5cm的小块，叶片近轴面向下，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，预培养2－3天。
3、挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20ml附加相应抗生素的YEB培养液中，在27℃恒温摇床上培养到OD值为0.6-0.8。
取上述上培养物按1％－2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEB培养液中，继续培养6小时，当OD值为0.2-0.5时即可用于转化。
4、在超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿，从培养液中取出预培养的外植体，放入菌液中泡1－5分钟。
取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。
然后接种在愈伤组织诱导或分化培养基（烟草的培养基为MS附加IAA0.5mg/L, BA2.0mg/L）上，28℃暗培养2－4天。
5、将经过共培养的外植体转移到加有选择压的脱菌分化和愈伤组织诱导培养基上。
在光照的条件下，25℃进行选择培养。
根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
［中 图分 类 法］￥３３０．２５
［文 献 标 识 码 ］Ａ
［文 章 编 号 ］１００３－６１８０ （２００８）Ｏ１—００３Ｏ一 ０３
水 稻是 重要 的粮 食 作 物 ，全 世界 约 有 三 分 之 一 以上 的人 口以 稻 米 为 主食 ，因此 ，提 高 水 稻 产 量 、改 良稻 米 品质关 系到人 类 的发展 和健康 ．近年 来 ，应 用基 因工 程 技术 导 人 外 源有 利 基 因 已创 造 出一批 抗病 、抗 虫 、抗逆 的水 稻新 品种 、新 品系．本 实验采 用根 癌农 杆 菌介 导 的遗 传 转 化方 法 ，将反 义编码 Ｗａｘｙ（蜡 质 基 因）片段 基 因导 入 水 稻 中． 通过成 熟胚 和 幼胚 转 化 效果 的 比较 ，以期 获 得转 化 的最 佳受 体．
参 考文 献
［１３ Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｈ ，Ｈｉｎａｔａ Ｋ．ＮＡＡ－ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏ－ｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｓｏ ｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ Ｌ［－Ｊ］．Ｅｘｐ
Ｂｏｔ，１９７９ ，３０ Ｉ３６３－３７０．
１．２ 培养基
外植体 培养 基 培 养基 中均加入 水水 解酪 蛋 白 ０．５ ｇ／Ｌ，蔗糖 ３０ ｇ／Ｌ，葡萄糖 １０ ｇ／Ｌ，琼脂粉 ８ ｇ／Ｌ．
① 愈伤组 织诱 导培 养基 ：Ｎ６＋２，４一Ｄ ２ ｍｇ／Ｌ （单 位 下同）＋ＫＴ ０。５＋ＮＡＡ ０。５ ＰＨ＝５。８
②共 培养 培养 基 ：Ｎ６＋ ２，４一Ｄ ２＋ 乙 酰 丁香 酮 １００ ｇｍｏｌ／Ｌ ｐＨ＝５．２
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ampr
pLGVneo1103
Cointegrate plasmid
植物表达载体构建—双元载体系统 (binary vector system)
• 由微型质粒、辅助 Ti质粒组成。 例如：Bin19、 pAL4404
• 包括两个彼此相容的穿梭载体（微型质粒）和 辅助Ti质粒。 穿梭载体不带有vir基因，但带有大肠杆菌及土 壤农杆菌的复制起始位点。所有基因操作可以 在大肠杆菌中完成，之后转入一种经修饰后的 Ti质粒农杆菌中，该Ti质粒包含一整套vir,但缺 失T-DNA序列而无法转移，这样可提供仅vir基 因产物帮助双元载体转移。
浸染叶盘 • 滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将处理过的叶盘置于培
养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄 青霉素的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该 培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞 再生为植株。 • 对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合 有目的基因及其表达情况。
• 叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。 实际上，其他的多种外植体，例如茎段、叶柄、胚轴、 子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的方法进行 转化。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前 应用最多的方法之一。
外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入 化学法需通过原生质体培养及其再 生体系，才能产生 有体细胞克隆变异的风险
需复杂的专用设备 外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入
需昂贵的专用设备 需接受专门训练的技术人员进行操 作
与植物基因转化有关的农杆菌
• 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：含有Ti (Tumor-inducing plasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细 胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。
• 双元载体杆菌与共整合载体所不同的是， 它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需 要共整合过程就能在农杆菌内独立复制， 从大肠杆菌转移到农的频率比共整合质粒 的转移频率高10000倍。且改造的Ti质粒时 其多克隆位点无导入pBR322质粒的同源片 段。
lacZ’
三亲交配法（triparental mating ）
整株感染法
• 人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒 的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质 粒的根癌农杆菌注射到植物体内，使菌体在植物 体内进行浸染实现转化。
• 为获得较高的转化频率，多采用无菌种子的实生 苗或试管苗。
• 在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切 下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基 上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈 伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导 再生植株
• 2 PCR 检测转化植株：PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因DNA 片段的有效方法。能在几小时内使pg 水平的起始物达到ng 乃至μ g 水平, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色后很容易观察, 不 通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于转 化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析
复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转 化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青 睐
若干主要的植物细胞转化方法的比较
评价内容
受体材料 宿主限制 培养条件 转化频率 嵌合体
操作 设备要求 工作效率
农杆菌 法
外植体
植物转化方法 PEG法 电击法 微注射法 原生质体 悬浮细胞 细胞或组织
基因枪 法
外植体
细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱 的基因； • ②Vir 区：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性； • ③Con 区(接合转移编码区)：该区段上存 在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移； • ④Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调 控Ti 质粒的自我复制。
• 任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片 段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而 被共整合到Onc-Ti质粒载体上。
改造后的Ti质粒的基本结构
a. DNA复制 起始位点
b. 选择标记 基因
c. T-DNA的 边界序列
d. 多克隆位 点
左边界序列
右边界序列
植物表达载体构建—中间载体的构建
整个过程大致可分为以下几个步骤
①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②根癌农杆菌对植物信号物质的感受； ③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色
体上操纵子的活化； ④T-DNA 复合体的产生； ⑤T-DNA复合体的转运； ⑥T-DNA整合到植物基因组中。
植物表达载体构建— Onc卸甲载体（受体Ti质粒）的构建
玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的Tam转座子系统
Ac
Ds
农杆菌介导转化
• 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)上，将根癌 农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙，可长出转化的 新枝条，新的转化枝条开花结实后，也可以获 得转基因种子；或者通过真空渗透或农杆菌浸 泡拟南芥开花植株，等结实之后，利用筛选萌 芽种子的方法，也可以得到转基因植株及种
子。 。
根癌农杆菌介导转化植株的基本程序
• 3 DNA水平：点杂交和Southern 杂交， 转录水平：Northern 杂交， 蛋白质水平：Western杂交。这些技术需要转膜、杂交, 操作繁琐, 费 用高, 不适合大批量样品的检测, 可对转基因植株随机取样检测
转基因植物的应用
一、转基因植物在植物分子生物学研究中的应用 1、转座子标签法
Ti质粒
• Ti质粒（tumor-inducing plasmid）：Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质， 为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中 有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA）， 能转移并整合到植物基因组中，并导致冠 瘿瘤的形成
• Ti 质粒可分为4 个功能区域： • ①T-DNA区：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物
根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)
• 在植物基因工程的发展中, 研究最清楚和应用 最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化, 在已 获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌 介导完成的. 起初, 人们认为农杆菌仅能转化双 子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物 ;而近几年, 由于在一些重要的单子叶植物以及 在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法 以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片 段DNA等优点又受到了人们极大的关注.
根癌农杆菌介导的植物基因遗 传转化技术
常用的植物基因转化技术
• 农杆菌介导法 • 植物病毒载体介导法（如CaMV） • DNA直接导入法（PEG介导法、脂质体法、基因
枪法、电激法、激光微束法、 显微注射法等） • 种质系统介导基因转化（花粉管通道法等） • 其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重
• 野生型Ti质粒不能直接用作克隆外源基因的载 体：1.质量过大 2.酶切位点多 3.T-DNA区Onc基 因干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中复制 5冗余基因
• Onc卸甲载体：无毒的Ti质粒载体。切除了TDNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大肠杆菌 的常用质粒pBR322区段（含Ampr)取代。
基因枪法 显微注射法
优点
缺点
转化效率高 主要以单拷贝或低拷贝形式插入 不需要特殊的专用设备
操作简单 转化效率高 同一实验可处理许多样品 化学法不需要特殊的专用设备
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
只能以T-DNA插入的方式导入寄主 细胞
Ti质粒介导转化的过程
• 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位 • 受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香
酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因 编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和 LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链 线性拷贝（T-链） • T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的 细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合 到植物的染色体基因组中 • T-DNA在植物细胞中表达
Ti 质粒介导的转移转化方法
• 基本程序包括：含重组Ti质粒的根癌农杆 菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆 菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培 养，转化植株再生等步骤。
• 叶盘转化法 • 原生质体(或愈伤组织)共培养转化法 • 整株感染法 • 直接转化法（电击法，液氮冷冻法）
叶盘转化法
• 打孔器从消毒叶片上打孔，获得 圆形叶片，即叶盘 • 将叶盘放入根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌
无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把 中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都 需要三种细菌参与，通常把这一过程称为三亲交 配法
1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重组植物表达载体的大肠杆菌） 原理：三种菌混合时，协助质粒游动进入供体 菌中，将供体菌中的表达载体转移到受体菌中， 最后经过适当的抗生素筛选即可获得土壤农杆菌 转化结合体
植物表达载体构建（E.coli） 重组质粒转化农杆菌（三亲）
选择受体材料 建立植株再生体系
遗传转化到宿主细胞（共培养） 转化体筛选（抗生素） 植株再生（组织培养） 转基因植株的检测（PCR、分子杂交等） 田间试验、遗传分析、性状鉴定
转基因植株的检测
• 1 报告基因的检测：报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景 的选择标记, 因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位 素放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达, 从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点, 大致分 为两类: 抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。
• 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称 为“中间载体”。