实验三 抗生素效价的测定

实验三抗生素效价的生物测定

一、实验目的

1．熟悉抗生素效价测定的原理

2．掌握培养基的配制、灭菌

3、掌握接种技术

二、实验原理

抗生素的医疗价值决定于它的抗菌特性，因此利用它们各自的抗菌活性来测定其效价有着特殊的意义。效价的测定法有：液体稀释法，比浊法和扩散法等。本实验采用国际上最为常用的杯碟扩散法来定量测定洁霉素的效价。测定时，将规格完全一致的不锈钢小管（即牛津小杯）置于含敏感菌的琼脂平板上，并在牛津小杯中加入己知浓度的标准青霉素溶液和未知浓度的青霉素发酵液。于是，抗生素就自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。在一定的范围内，抗生素浓度的对数值与抑菌圈直径呈线性关系。因此，只要将被测样品与标准样品抑菌圈直径进行比较，就可在标准曲线上查得未知样品的抗生素效价。

三、材料和器皿

1 菌种：大肠杆菌（E.coli）。

2培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（作生物测定用时，平板应分上下两层，上层须另加25％葡萄糖）。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配方：

牛肉膏3g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂15-20g 1000ml 水pH 7.4-7.6

3试剂

（1）l％pH6磷酸缓冲液：K2HPO4 0.2g（或K2HPO4·3H20 0.253g）KH2P040.8g，蒸馏水100ml。

（2）25% 葡萄糖溶液100ml。

（3）苄青霉素钠盐：1667U／mg（1U即1国际单位，等于0.6ug）。

4其他：牛津小杯（不锈钢小管，内径6土0.lmm，外径8土0.lmm，高10土0.1mm），培养皿（直径90mm，深20mm；大小一致，皿底平坦），试管、滴管、移液管（5ml）、移液枪（1ml）、枪头、镊子、涂布棒等。

四、方法和步骤

1标准曲线的测绘

(1）倒底层培养基：取无菌培养皿5套，每皿移入20ml牛肉膏蛋白陈底层琼脂培养基，置水平待凝，备用。

（2）铺含菌上层培养基：将装在三角瓶中的牛肉膏蛋白陈琼脂培养基（100ml）融化，待冷却到50℃左右时再加入25%葡萄糖液2ml和大肠杆菌菌液5ml(加入菌液的浓度应控制在使IU／ml青霉素溶液的抑菌圈直径在20－24mm），充分混匀后，用移液管吸取4ml于底层平板上迅速铺平，然后移水平位置凝固。

（3）放牛津小杯；待上层充分凝固后，在每个琼脂平板上轻轻放置4只牛津小杯，其间距应相等，如图所示。

（4）滴加标准样品液，用无菌洁净移液管滴加标准样品，每一稀释度应更换一根移液管。每只牛津小杯中的加量为0.2ml。或者用带滴头的滴管加样品，加液量如图所示与杯口水平为准。每一稀释度做三个重复。

（5）培养：待样品加毕后，最好换上无菌陶瓷盖作培养皿的盖子，并将平板置于37℃温箱内培养18－24h观察测定结果。

（6）测量与计算：移去测定培养皿的陶瓷盖，再将牛津小杯移去，精确地测量各稀释度的青霉素的抑菌圈直径（若用圆规两脚的针尖测量则更精确），并记录。

计算步骤：

算出各组（即各剂量）抑菌圈的平均值。

算出各组IU／ml的抑菌圈平均值。

统计5套培养皿中IU／ml的抑菌圈总平均值。

以IU／ml抑菌圈的总平均值来校正各组的IU／ml抑菌圈的平均值，即求得各组的校正值。

以各组IU／ml的抑菌圈的校正值校正各剂量单位浓度的抑菌圈的直径，即获得各组抑菌圈的校正值。

举例：若30个IU／ml青霉素溶液的抑菌圈直径的总平均值为22.6mm。而第一组内6个IU／ml青霉素溶液的抑菌圈直径的平均值为22.4mm，则：第一组的校正值＝22.6－22.4＝0.2mm。若第一组皿内40 IU／ml青霉素溶液的抑菌圈平均值为18.6mm，那么，第一组中40 IU／ml青霉素溶液的抑菌圈校正值＝18.6＋0.2＝18.8mm。其他各组依次类推以获得各自的校正值。

（7）绘制标准曲线：在对数坐标纸上，以青霉素浓度（对数值）为纵坐标；以抑菌圈直径的校正值为横坐标；绘制标准曲线。

2青霉素发酵液效价的测定

用1％pH6磷酸盐缓冲液将青霉素发酵液作适当稀释。每个被检样品用3套培养皿进行测定。青霉素标准液（IU／ml）与发酵液的稀释液间隔地加入牛津小杯中，然后将平板放37℃下培养18-24h后，测定抑菌圈的直径。

3青霉素发酵液效价的计算

(1) 将青霉素标准工作液（IU／ml）在培养皿中抑菌圈的平均值与标准曲线上IU／ml的抑菌圈直径进行校正，求得校正数。

（2）将此校正值校正被检发酵液抑菌圈直径，求得该被检发酵液的校正值。

（3）将此校正值在标准曲线上查得被检青霉素发酵液稀释液的效价。

（4）将被检青霉素稀释发酵液乘上其稀释倍数，就可求得青霉素发酵液原液的效价。

五、结果记录

1将标准青霉素和青霉素发酵液的实验数据分别填入表中。

2在对数坐标纸上，以青霉素浓度（IU／ml）的对数值为纵坐标，以抑菌圈直径的校正值（mm）为横坐标，绘制标准曲线。

3计算发酵液中青霉素的效价。

注意事项

l要注意控制大肠杆菌的菌液浓度，否则会影响抑菌圈的大小。

2不同的青霉素制剂每毫克所含的国际单位有差异，做标准曲线测定时应注意选择。

苄青霉素钠盐1mg＝1667国际单位

苄青霉素钾盐1mg＝1595国际单位

六、思考题

1用微生物法测定抗生素效价有何优缺点？

2本实验中哪些操作易引入误差，如何避免？