狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）[导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）（1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179）（2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015）【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。
另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。
结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。
结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。
免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author)1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 1101792. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain.【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。
狂犬病毒滴度检测噬斑法（PFU）的建立及应用
狂犬病毒滴度检测噬斑法（PFU）的建立及应用
黄琼[1,2]
【期刊名称】《生物技术世界》
【年(卷),期】2016(000)003
【摘要】目的建立狂犬病毒滴度的快速、经济的检测方法-噬斑法（PFU）,验证其与小鼠脑内攻击法（计算LD50）的相关性,并用于PM株狂犬病毒的滴度测定. 方法狂犬病毒做10倍系列稀释,然后接种于单层BHK21细胞上, 37℃、5%CO2吸附1h后,加入覆盖液, 33℃、5%CO2培养7～10天后用1.5%的结晶紫染色.用建立的噬斑法和小鼠脑内攻击法同时测定狂犬病毒的滴度,以比较两种方法的相关性和重复性.结果两种方法测定狂犬病毒滴度的结果差异无统计学意义,相关系数为0.939,两种方法的检测结果呈良好的正相关性.结论噬斑法可替代小鼠脑内滴定法检测狂犬病毒滴度.
【总页数】1页(P318-318)
【作者】黄琼[1,2]
【作者单位】[1]四川大学生物治疗国家重点实验室,四川成都610041;[2]成都康华生物制品有限公司,四川成都610100
【正文语种】中文
【中图分类】R-33
【相关文献】
1.检测狂犬病毒的胶体金免疫层析法的建立及应用 [J], 徐葛林;胡巧玲;吴杰;郑新雄;张燕
2.猪伪狂犬病抗体免疫金标快速检测试纸法的建立和应用 [J], 黄印尧;孔繁德;张长弓;颜江华;方莹
3.狂犬病免疫抗体胶体金检测试纸法的建立及其应用 [J], 金颜辉;夏晓红;许先明;杨佳;吴波平;严乾临;林芬;巴雷
4.检测犬抗狂犬病毒抗体的胶体金免疫层析法的建立及应用 [J], 廖园园;钱金宏;唐利军;王业富
5.猪伪狂犬病抗体免疫金标快速检测试纸法的建立和应用 [J], 黄印尧;孔繁德;张长弓;颜江华;方莹
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直接免疫荧光法检测狂犬病毒滴度的可行性研究
收稿日期 : 2 01 1 -03 -ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 5 ; 修回日期 : 2 01 1 -04 -2 7 E - m ai l : 作者简 介 : 谈小 荣 ( 1 970 - ) ， 男， 医学 生 物助 理 工程 师 ， t x r 1 970 @ 1 6
o f ra bie sv iru s .R
re s ul t sw e recom pa re d for s e ns i ti v it y ，s pe ci fi cit y a nd re produ ci bil it y. I t wa sfou nd t ha tt h edFA i sa ss e ns i ti v ea nd s pe c ific a st h em o us ebra i n inocu l a t io nt e s tw i th h i g h re produ ci bi l i t y. T h edFA cou l d prov i dea na l te rna t iv efor th em ou s ebra in i no cul a ti on te s ti nt it ra t ion of ra bi e sv i ru s e s . K :R ; Dire ct im m u nofl u ore s ce nt a s s a y ; M ou s ebra i ni no cu l a t ion te s t; V i ru sti t e r
摘
2 1 331 6 ; 2 罗益( 无锡) 生物制药有限公司， 无锡 2 1 4 02 8 )
要: 实验研究中建立用于定量检测狂犬病毒滴度 的直接免 疫荧光 法， 并将检 测结果 与传统小 鼠脑内 滴定法 进
狂犬病诊断方法研究
健康养殖·诊疗2021.04 畜牧业环境79摘 要：狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种高度致死性人兽共患性疾病，提高该病的诊断水平对保障人类健康尤为重要。
本文就狂犬病各种诊断方法的研究与应用现状进行综述，将为临床中快速诊断狂犬病提供参考依据。
关键词：狂犬病；诊断方法；研究进展1 前言狂犬病（rabies，RAB）是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一种高度致死性人兽共患传染病，近年来随着我国宠物行业的快速发展，犬科和猫科动物的异地流通加剧，RAB的发病率呈现出明显的上升趋势，提高RAB的诊断水平对该病的综合防控至关重要。
由于RAB引起的临床症状与其他致病原体导致的脑炎非常相似，故对于RAB的确诊需使用实验室诊断方法，一直以来RAB的实验室经典诊断方法为快速荧光灶抑制试验和荧光抗体试验，但两种方法存在操作繁琐、耗时、检测成本高、对试验条件和人员要求高等缺点，随着现代细胞培养技术、免疫学和分子生物学诊断技术的发展，RAB的新型替代诊断方法得到了快速发展，本文就RAB的各种诊断方法的研究与应用情况进行综述，以期为临床中RAB的快速确诊提供参考依据。
2 临床诊断依靠本病典型的临床表现即可做出初步诊断，愈合的咬伤伤口及伤口周围具有麻木发痒或蚁走感，临床表现出极度兴奋或烦躁，对风、水、光、声等外界刺激的敏感性增强，具有“恐水”症状，感染后期出现肌肉瘫痪或颅神经瘫痪。
3 实验室诊断3.1 荧光抗体试验该方法是实验室诊断RAB抗原的经典方法，将采集的临床样品与荧光素标记的抗RAB高免抗体进行反应，通过显微镜观察与抗原结合后的荧光抗体即可判断出样品中是否含有RAB抗原。
3.2 荧光灶抑制试验该方法是实验室诊断RAB抗体的经典方法，将采集人或动物的血清与RABV等量混合，置于37℃下中和反应1h，然后将抗原抗体混合物接种细胞并培养1d，次日对接种的细胞进行固定后进行荧光抗体染色，荧光显微镜下观察荧光灶个数，计算血清抗体效价。
狂犬疫苗介绍
成大生物狂犬病疫苗一）技术来源1984 年11 月，世界卫生组织（WHO ）和洛克菲勒基金会（RF）开始一项合作项目——以Vero 细胞为基质工业化生产狂犬病疫苗。
历时15 年的努力，科学有效地解决了生产、纯化中的诸多问题。
1999 年，该技术生产的高品质人用狂犬病纯化疫苗首先被批准在哥伦比亚使用，经过5年的实践，证明具有卓越的安全性和免疫效果。
该技术的核心在于实现了细胞的悬浮培养。
（二）主要技术1、高密度微载体技术1）微载体的诞生实现了细胞从贴壁生长到悬浮培养的革命。
成大速达? 的微载体技术指标：1 个微载体= 180 μm1 克微载体（干重）= 4,400cm 2500 克微载体= 1,000 转瓶（3 升转瓶）7.5 升反应器= 150 克微载体= 350 转瓶30 升反应器= 750 克微载体= 1,750 转瓶细胞密度: 10 x 106个细胞/ml细胞生长30 L 生物反应器= 7 天病毒生长天数= 20 天从上图我们可以看到细胞在微载体表面生长的非常好，细胞密度达107/ml 。
刚才已经谈过，巴斯德PV2061 狂犬病固定毒毒株是WHO 公认的免疫原性高的Vero 细胞适应株，因此，接种病毒后，连续收获病毒的滴度很高，这样从技术上就保证了成大速达?0.5ml 的小剂量里面，能够含有较高的抗原蛋白和较少的杂蛋白。
2）生物反应器为大规模细胞培养提供了设备支持。
全自动、封闭式、管道化的生物反应器3）比照传统生产工艺，微载体高密度细胞培养的优势：* 高细胞密度* 高病毒收获* 低污染的机会* 生产工艺可控性强* 微载体投放量高达25g/L ，细胞密度高达1.1-1.5x107/ml ，远超过其他工艺(转瓶、细胞工厂、其他类型反应器) 。
2、四柱层析纯化系统从前面的工艺流程中，我们已经知道，收获的病毒液必须经过无菌连接的管道化的澄清过滤和超滤浓缩后，灭活，然后，进行层析纯化。
下面的图中显示先进的纯化设备和训练有素的工作人员在操纵全自动的装备，经过这道关键的工艺后，有效地去除99.95%的杂蛋白和Vero 细胞DNA ，保证了成大速达?具有卓越的安全性。
狂犬病的实验诊断方法
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。
早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。
因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。
目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。
直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。
它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。
通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。
这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。
然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。
滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。
该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。
这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。
这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。
然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。
聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。
它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。
首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。
这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。
此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。
人用狂犬病疫苗效价测定法(nih法) 附疫苗(vero 细胞+地鼠肾细胞)技术资料
人用狂犬病疫苗效价测定法（NIH法）本法系将供试品免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。
试剂稀释液（PBS）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
攻击毒株CVS制备启开毒种，稀释成10-2悬液，接种11～13g小鼠，不少于8只，每只脑内接种0.03ml，连续传2～3代，选择接种4～5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入含2%马血清或小牛血清制成20%悬液，经每分钟1000转离心10分钟，取上清液经病毒滴定（用10只18～20g小鼠滴定）及无菌检查符合规定后作攻击毒用。
参考疫苗的稀释参考疫苗用PBS稀释成1∶25、1∶125和1∶625等稀释度。
供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀。
测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12～14g小鼠16只，每只小鼠腹腔注射0.5ml，间隔1周再免疫1次。
小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100个LD50的病毒量进行脑内攻击，每只0.03ml。
同时将攻击毒稀释成100、10-1、10-2和 10-3进行毒力滴定，每个稀释度均不少于8只小鼠。
小鼠攻击后逐日观察14天，并记录死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。
计算供试品和参考疫苗ED50值。
计算相对效力P＝T/S×dT /dS×D式中P为供试品效价，IU/ml;T为供试品ED50的倒数；S为参考疫苗ED50的倒数；dT为供试品的一次人用剂量，ml；dS为参考疫苗的一次人用剂量，ml; D为参考疫苗的效价，IU/ml。
【附注】（1）动物免疫时应将疫苗保存在冰浴中。
（2）各组动物均应在同样条件下饲养。
（3）攻击毒原病毒液(100 )注射的小鼠应80%以上死亡。
人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）Renyong Kuangquanbing Yimiao(Vero Xibao)Rabies Vaccine for Human Use（Vero Cell）本品系用狂犬病病毒固定毒接种Vero细胞，经培养、收获、浓缩病、病毒灭活、纯化后，加入适宜的稳定剂后制成，用于预防狂犬病。
人体狂犬疫苗说明书
人体狂犬疫苗说明书药品名称]通用名：人用狂犬病疫苗（Vero细胞）英文名称：RabiesVaccineforHumanUse（Verocell）汉语拼音：RenyongKuangquanbingYimiao（VeroXibao）通用名：冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）英文名称：RabiesVaccineforHumanUse（Verocell），Freeze-dried 汉语拼音：DongganRenyongKuangquanbingYimiao（VeroXibao）[成分和性状]本品系用狂犬病病毒（L巴斯德固定毒PV2061毒株）接种Vero细胞培养后，收获病毒液，经浓缩、灭活、纯化，并加入适量的人白蛋白制成。
1免疫剂量即为在有效期内其保护效价等于或高于2.5个国际单位（IU）。
本品为无佐剂疫苗，呈无色澄明液体。
本品系用狂犬病病毒(L巴斯德固定毒PV2061毒株)接种Vero细胞养后，收获病毒液，经浓缩、灭活、纯化，并加入适量的人血白蛋白、右旋糖酐制成。
1免疫剂量即为在有效期内其保护效价等于或高于2.5个国际单位(IU)。
本品为白色疏松体，加稀释液溶解后为澄明液体。
稀释液为无色、澄清溶液。
[接种对象]暴露前：本疫苗用于预防狂犬病，推荐下列人员按照暴露前免疫程序接种：所有暴露于持续危险的工作着：如狂犬病病毒诊断、研究的工作者，应进行免疫接种；建议每6个月进行一次血清学检测，当血清抗体滴度低于公认的保护水平（0.5IU/ml）时，应接种加强针。
凡有接触狂犬病病毒危险的人员：如兽医、动物饲养员、林业从业人员、屠宰厂工人、洞穴居住者、动物聚居区的儿童、成人和旅游者等应进行免疫接种。
暴露后：凡被患有或可疑患有狂犬病的动物咬伤、抓伤后，应立即按暴露后程序免疫接种。
[作用与用途]接种本疫苗后，可刺激机体产生抗狂犬病病毒免疫力，用于预防狂犬病。
[规格]水针：每盒内装5支疫苗，0.5ml/支，1剂量/支。
冻干：每盒内装5支冻干疫苗和5支0.5ml稀释液。
生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗
生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗查力;高军;侯剑英;白珠穆;袁德明;杨俊伟;李旭;李庆岸;陈焕玉;孙非非;赵红梅;周德水【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2006(19)3【摘要】目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。
方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。
结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。
经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。
结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。
【总页数】3页(P288-290)【关键词】生物反应器;微载体;Vero细胞;狂犬病疫苗【作者】查力;高军;侯剑英;白珠穆;袁德明;杨俊伟;李旭;李庆岸;陈焕玉;孙非非;赵红梅;周德水【作者单位】辽宁成大生物技术有限公司;辽宁省生物医学工程研究院有限公司【正文语种】中文【中图分类】R392-33;R318.14【相关文献】1.不同毒株制备的人用狂犬病疫苗免疫原性比较 [J], 于洪涛;李淑兰;胡晓明;黄永诚;张莹;郭海英;荣爱红2.应用生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗的研究 [J], 董纪英;3.ELISA定量检测人狂犬病疫苗免疫血浆抗体的工作参比品制备 [J], 李裕惠;郭中平;刘红;王艳;赵宇4.不同规格的细胞培养瓶生产浓缩人用狂犬病疫苗的比较 [J], 刘济众;孙敏;蒋茨蕾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
狂犬病毒PV-2061株免疫荧光检测方法的可行性
狂犬病毒PV-2061株免疫荧光检测方法的可行性摘要】采用免疫荧光法检测狂犬病毒株PV-2061株的病毒滴度，并将检测结果与小鼠进行比较，验证该方法的可行性。
两名实验人员分别检测相同样品3次，比较两种方法的重复性与精密度。
结果显示，免疫荧光法测得的结果与小鼠法结果趋势相同；重复性实验中，免疫荧光法的变异系数更低，表明重复性更好。
免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，可广泛推广。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）33-0176-02Feasibility of immunofluorescence assay for rabies virus PV-2061 strainLi Shuang,Tian Wei(Correspondence author), Xie Hua,Li He.Shenyang Pharmaceutical University Liaoning Shenyang 110016【Abstract】The virus titer of rabies virus strain PV-2061 strain was detected by immunofluorescence, and the detection results were compared with mouse method to verify the feasibility of the method. Two experimenters tested the same sample three times to compare the repeatability and precision of the two methods. The results show that the immunofluorescence has the same trend as the mouse method. In the repetitive experiment, the variation coefficient of immunofluorescence method is lower, indicating that the repeatability is better. The immunofluorescence method can be widely used to detect virus titration, which is fast, accurate and precise.【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent狂犬病是一种人兽共患急性传染病，由狂犬病毒引起的，可导致严重的中枢系统疾病，又称恐水症，是死亡率高达100%的急性传染病，被传染病防治法列为乙类传染病。
细胞传代培养法检测狂犬病毒PV-2061株限度的研究
细胞传代培养法检测狂犬病毒PV-2061株限度的研究摘要】目的：将病毒滴度不同的狂犬病毒PV-2061株接种Vero细胞，收获连续传代培养的病毒液后脑内注射小鼠，通过小鼠的死亡情况确定细胞传代培养法对于该病毒的检测限度。
方法：先采用小鼠脑内接种法测定狂犬病毒的病毒滴度，然后将10倍系列稀释的狂犬病毒接种Vero细胞，在细胞上连续传代3次后收获细胞培养物并脑内注射小鼠，观察小鼠的死亡情况。
结果：小鼠脑内接种法检测狂犬病毒的病毒滴度为7.0lgLD50/ml，且不高于1LD50/ml的病毒无法致小鼠死亡。
细胞传代培养法检测狂犬病毒的结果为：0.1LD50/ml的狂犬病毒检出率为5%～10%，0.01LD50/ml的狂犬病毒无法检出。
结论：细胞传代培养法检测狂犬病毒PV-2061株的检测限度约为0.1LD50/ml，且灵敏度远高于小鼠脑内接种法。
【关键词】狂犬病毒PV-2061株；病毒滴度；细胞传代培养；检测限度；Vero细胞【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）28-0095-02Study on Cell subculture method to detect the rabies virus PV-2061 strain limitYao Yu,Zhang Jinghai,Li He,Xie Hua.Shenyang Pharmaceutical University 110016,China【Abstract】Objective The PV-2061 strain of rabies virus with different virustiters were inoculated into Vero cells. Continuous subculture virus solution were received and intracerebrally injected into mice. Detection limit of cell subculture method for Rabies virus was determined by dealth of mice. Methods The rabies virus titer was first determined by mouse intracerebral inoculation method. Then 10-fold dilution of the rabies virus was inoculated into Vero cells which were cultured and passaged three times. The cell cultures were harvested and inoculated into mice by intracerebral injection. Death of mice was observed. Results The rabies virus titer was 7.0 lgLD50/ml by mouse intracerebral inoculation method and the rabies virus was no higher than 0.1LD50/ml could not kill the mice. As the results of detection for rabies virus by cell subculture method: 5%～10% of the rabies virus was 0.1LD50/ml could be detected, the rabies virus was 0.01LD50/ml could not be detected. Conclusion The minimum detection limit of rabies virus is about 0.1LD50/ml by cell subculture method and the sensitivity is much higher than mice intracerebral inoculation method.【Key words】Rabies virus PV-2061 strain;Virus titer;Cells passageculture;Detection limit;Vero cell狂犬病毒属于弹状病毒科的狂犬病毒属，外形为子弹状，表面有包膜，内含单链RNA，是引起狂犬病的病原体，本文中所研究的狂犬病毒PV-2061株(以下均简称PV株)是Louis Pasteur固定毒株的Vero细胞适应株[1]。
狂犬病灭活疫苗PV2061株的免疫原性试验
狂犬病灭活疫苗PV2061株的免疫原性试验张晓华;杨琪;王庆波;张立波【摘要】本试验对兽用狂犬病灭活疫苗PV2061株的保护效率进行评估,分别以常量、1/2剂量和1/4剂量免疫本动物并进行街毒攻击试验.血清中和抗体检测结果表明,前2组在免疫4周后抗体阳性率均为100％,抗体的平均滴度分别为4.86IU/mL和1.18 IU/mL,1/4剂量组的抗体滴度较低,平均滴度仅为0.36 IU/mL.攻毒后前2组的保护率为100％,1/4剂量组的保护率为40％,阴性对照组攻毒后全部死亡.对试验犬的脑组织进行直接荧光抗体染色检测表明仅有死亡犬脑组织中有狂犬病病原存在.综上所述,狂犬病灭活疫苗PV2061株正常免疫剂量和1/2免疫剂量的强毒攻击保护率均在80％以上,阴性对照犬的死亡率高于80％,符合国际标准.本试验为灭活疫苗PV2061株的保护效率提供了试验依据,为其实际应用并投入生产奠定了试验基础.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2014(050)002【总页数】2页(P30-31)【关键词】狂犬病;灭活疫苗;攻毒试验;中和抗体【作者】张晓华;杨琪;王庆波;张立波【作者单位】辽宁成大动物药业有限公司,辽宁本溪117000;辽宁成大动物药业有限公司,辽宁本溪117000;中国动物疫病预防控制中心,北京朝阳100125;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5狂犬病是由狂犬病病毒(RV)引起的一种自然疫源性人畜共患传染病。
RV属于弹状病毒科（rhabdoviridae）狂犬病病毒属（lyssavirus）[1]。
狂犬病主要引起神经系统症状，死亡率几乎为100%。
我国是狂犬病的高发区，在过去的60年间，已有12万人死于狂犬病。
RV可以感染所有的温血动物，其中病犬是狂犬病病毒主要传染源。
疫苗接种是预防狂犬病最主要的方法[2]。
WHO建议当动物群体的狂犬病有效免疫率超过70%时，即可控制动物狂犬病的发生和流行[3-4]。
病毒滴度测定
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度.第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释,所得病毒原液为第一个Ep中的1/10,记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释,所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ;依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10,记为1E—5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E—6 uL ；换句话说:如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E—5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位:TU/mL,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数.「TU」为「transducing units」的缩写,中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔.放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养.第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下:每种病毒准备10 个1。
5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001)。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记.第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液,利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
病毒滴度的测定 PPT课件
Reed-Muench法计算CCID50 (难点、重点)
病毒液 CPE孔数 无CPE
累计
出现CPE孔
稀释度
孔数 CPE孔数 无CPE孔数 所占的%
10-1
8
0
27
0
100（27/27）
10 -2
8
0
19
0
100（19/19）
10 -3
7
1
11
1
91.6 （11/12）
10 -4
3
5
4
6
40（4/10）
Karber法计算CCID50 (难点、重点)
病毒液稀释度
出现CPE孔的比率
10-1
8/8=1
10-2
8/8=1
10-3
7/8=0.875
10-4
3/8=0.375
10-5
1/8=0.125
10-6
0/8=0
lgCCID50=L+d(s-0.5) L: 病毒的最低稀释倍数的对数 L=lg10-1 = -1
中性红
(掌握)
(熟悉)
(了解)
(了解)
空斑形成单位试验技术举例 p51-52 防止琼脂凝固； Hanks液？ 双抗？ 5% CO2
空斑形成单位的计算 (重点)
(掌握)
(熟悉)
LD50 ID50 CCID50
(重点)
(熟悉)
(熟悉) 5% CO2培养箱
(熟悉)
CCID50 TCID50
病毒滴度的测定
空斑形成单位法测定病毒滴度
原理(重点)：适当稀释的病毒悬液与长成单 层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培 养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制， 病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶 解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成， 计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的 病毒感染单位的浓度。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定◆病毒感染的测量方法–直接计数法将病毒与乳胶颗粒混合,电子显微镜观测缺点是无法判断病毒的感染性–间接计数法空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)50%终点法血凝试验干扰滴定第一节空斑形成单位法一、基本原理◆原理–空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)试验：将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒引起，计数空斑数目再乘稀释倍数，得病毒感染的浓度–病毒空斑—蚀斑将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中，吸附1h后，覆盖营养琼脂病毒在琼脂中只感染临近的细胞，形成空斑的退化细胞区中性红染色：活细胞染红色；死细胞无色产生CPU的病毒均可用此方法二、方法与步骤◆测定病毒空斑的试验方法–病毒杀死感染细胞的检测：产生细胞病变效应中型红：活细胞染红色台盼兰：死细胞染蓝色M TT：溴化二苯基四氮唑，将活细胞染成深蓝色，易于计数，易分离病毒转化或有抵抗力的细胞–未能杀死细胞可产生血凝素因能吸附红细胞，空斑用血吸附显出用显微镜计数吸附红细胞的空斑–细胞融合：病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞，用显微镜观查合胞体空斑–空斑中含有病毒的抗原免疫荧光分析–免疫组化技术生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术间接免疫过氧化物酶染色三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算◆空斑形成单位试验技术–传代细胞平皿法单层细胞浓度为2×106，培养液为RPMI1640，Eagle，MEM病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释，每个稀释度培养2瓶，每加一次样时要新吸管，来回吸三次，加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾斜来回摇动，使病毒均匀C O2孵箱吸附90min后，再用营养琼脂覆盖培养5~8d后，加入0.01%的中性红染色，计数空斑◆病毒滴度的计数–按以下公式计算空斑形成单位(PFUs/ml) = d vn n ∙∙X +X +X 21 X1、X2、Xn ：表示同一稀释度在不同培养孔板（实验单位）中数得到的空斑数；n 表示计数空斑的培养板孔数；v 表示病毒量（ml ）；d 表示稀释倍数例：以稀释成10-4的病毒悬液感染细胞，四个培养板孔中的空斑数分别为1，1，3及5个，接种量为0.2 ml空斑形成单位(PFUs/ml) = 4100.245311⨯⨯+++ = 1.25×105PFUs/ml ◆ 空斑形成单位（PFUs ）与重复感染数（M.O.I ）– 重复感染数（Mutiplicity of Infection ，M.O.I ）是指感染一个细胞的病毒颗粒的平均数– 一般来说， M.O.I 值越大，则实验细胞被感染的比例越大– 若某病毒的PFUs 已经测得，要按一定量的M.0.I 进行感染细胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算公式1：实验细胞数×所需的M.O.I 值=所需的PFUs公式2：所需的PFUs/实际病毒的PFUs=需要加的病毒量例：已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml ，试验细胞数为每孔1.8×106，计划M.O.I 值为200。
狂犬病病毒快速荧光抗体技术测定的研究
狂犬病病毒快速荧光抗体技术测定的研究张砚锦;唐桂运【期刊名称】《中国兽医科技》【年(卷),期】1993(023)006【摘要】本试验用自制兔抗狂犬病病毒荧光抗体,检测病毒在BHK_(21)-C_(13)单层细胞中的增殖,建立了快速荧光抗体技术(RFAT)用于狂犬病病毒TCID_(50)的测定。
用RFAT和小白鼠脑内接种半数感染量(MID_(50))测定法对狂犬病病毒 ERA 株毒液32批,冻干种毒两批和Flury-LEP株冻干苗11批进行了平行测定,并对测毒结果进行了统计学分析。
病毒滴度平均值(log10):ERA株TCID_(50)/ml为6.16,MID_(50)/0.03ml为4.86;Flury-LEP株T CID_(50)/ml为5.85,MID_(50)/0.03ml为4.74。
ERA株TCID_(50)和MID_(50)相关系数为0.826,Flury-LEP株为0.754。
结果表明在可靠性和可重复性方面RFAT至少同MID_(50)测定法相同。
但RFAT简便、快速,是替代MID_(50)测定法进行病毒测定的理想方法。
【总页数】2页(P3-4)【作者】张砚锦;唐桂运【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】S852.655【相关文献】1.病毒分离结合荧光抗体技术与抗原捕获ELISA检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原的敏感性比较研究 [J], 高志强;张鹤晓;刘继红;郭晋优;吴丹;谷强2.直接荧光抗体法快速诊断狂犬病 [J], 龚国华;张苏华3.利用直接荧光抗体法检测病料中的伪狂犬病病毒 [J], 郎洪武;李博4.狂犬病荧光抗体技术研究 [J], 邵振华;刘效文5.使用TaqMan^(TM)技术的快速RT-PCR方法:区分6种已知基因型的狂犬病病毒及狂犬病相关病毒 [J], 戴智勤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
测定病毒滴度的方法
测定病毒滴度的方法Protocol:1) 转导前一天（第 1 天），胰酶消化细胞并计数细胞密度，按照合适的细胞密度接种到 6 孔板中，能使转染当天的融合度达到 30%-50%。
放置 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养。
例如：如果用HT1080细胞测定滴度，通常一个六孔版的孔接种 2×105 个细胞；2) 转导当天（第 2 天），融解病毒，准备 10 倍稀释系列样品，稀释倍数从 10-2到10-6。
对于每一个稀释样品，用完全培养液稀释病毒至总体积 1mL 。
避免漩涡震荡；3) 去除细胞中的培养液，加入已含有不同病毒量的完全培养液。
另外，保留一孔不添加病毒的细胞，作为空白对照组。
注：每孔加入的培养液的体积应为 1mL ；4) （可选）在含有病毒的培养液中加入聚凝胺，促进病毒感染细胞。
轻轻地摇晃培养板以混匀聚凝胺。
放置 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养；注：一般 polybrene 的储液浓度是 6mg/ml （用超纯水配制，－20 度储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果）。
工作浓度是 6ug/ml 。
5) 转染后一天（第 3 天），去除含有病毒的培养液，加入 2mL 新鲜的完全培养液。
放置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜培养；6) 转染后两天（第 4 天），去除培养液，加入含有适当浓度的嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞；7) 每 3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液；8) 筛选数天后，可以看到对照组没有活细胞，而添加过病毒的 1 个或者更多个的孔会出现药物抗性的克隆。
去除培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
注：筛选所需天数应以对照组的所有细胞死亡为准；9) 先加入95%甲醇固定10min,再 加入结晶紫染色液（6 孔板每孔 1mL ）并放置室温孵育10 分钟；10) 去除染色液，用 PBS 洗涤细胞 2 次；11) 计数被染成蓝色的克隆数目，并计算病毒滴度。
无佐剂狂犬病疫苗的反应及免疫效果观察
无佐剂狂犬病疫苗的反应及免疫效果观察查力;高军;侯剑英;白珠穆;袁德明;杨俊伟;李旭;李庆岸;陈焕玉;吴小红;唐建蓉;李艳萍;李荣成【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2006(19)2【摘要】目的观察无佐剂狂犬病疫苗的反应及免疫效果。
方法以巴斯德PV2061为生产毒株,以143代以内的Ve-ro细胞为培养基质,采用生物反应罐灌流方式培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成无佐剂Vero细胞狂犬病纯化疫苗。
作为受试疫苗,按暴露后程序接种,无佐剂疫苗502人(A组),进口疫苗100人(对照组B组),观察反应和免疫效果。
结果所有接种对象均未出现局部和全身强副反应。
首剂免疫后14d,A组与B组抗体阳转率均达100%,中和抗体几何平均滴度为5.2IU/ml和5.6IU/ml。
第45天A组抗体几何平均滴度上升到9.5IU/ml,B组9.8IU/ml。
结论无佐剂狂犬病疫苗具有良好的安全性和免疫原性。
【总页数】2页(P206-207)【关键词】狂犬病疫苗;佐剂;安全性;免疫原性【作者】查力;高军;侯剑英;白珠穆;袁德明;杨俊伟;李旭;李庆岸;陈焕玉;吴小红;唐建蓉;李艳萍;李荣成【作者单位】辽宁成大生物技术有限公司;辽宁省生物医学工程研究院有限公司;中国药品生物制品检定所;广西壮族自治区疾病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】R392;R512.99【相关文献】1.国产冻干无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗对暴露后人群接种反应及免疫原性观察[J], 渠慎稳;杨聪伶;杨位芳;梁玉民;杨琳琳;陈明霞;徐晶;赵福河;张黎明;司侠2.两种无佐剂国产狂犬病疫苗的免疫效果观察 [J], 赵德峰;徐葛林;郑新雄;祝玉桃;胡巧玲;严家新3.无佐剂Vero细胞狂犬病纯化疫苗的接种反应及免疫效果观察 [J], 蔡文安4.人用无佐剂狂犬病疫苗的接种反应及免疫效果 [J], 肖奇友;罗述斌;李苗;徐青松;宋一平;宋海晖;张义;钟群;李谞;徐葛林;董关木5.国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果 [J], 刘华章;黄桂花;曹庆;潘淮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
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狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）[导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）（1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179）（2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015）【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。
另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。
结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。
结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。
免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author)1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 1101792. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain.【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。
狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。
在疫苗生产的各项检测指标中，狂犬病毒毒力的测定是至关重要的，其直接关系到疫苗成品的效价和免疫效果。
《中华人民共和国药典》三部（2015版）狂犬病毒滴度检测的方法推荐采用小鼠法。
但是由于实验动物之间存在个体差异，实验人员操作的熟练程度等诸多因素均会影响实验结果的准确性。
细胞法作为病毒滴度测定的一种替代方法，近年来广受国内外学者的青睐，其中蚀斑法、免疫荧光法等都是比较经典的实验方法。
1.材料和方法1.1 病毒及细胞病毒株狂犬病毒PV-2061株第18代，由辽宁成大生物股份有限公司提供，原始毒株来源于ATCC。
细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）来源于中科院上海细胞库。
1.2 实验动物昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.3 主要试剂FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体购自美国Novus Biologicals公司，浓度0.93mg/ml；新生牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。
1.4 蚀斑法1.4.1制备单层细胞将BHK-21细胞浓度调整至1×105个/ml，接种6孔细胞培养板，长满单层备用。
1.4.2病毒滴度测定将狂犬病毒样品5倍稀释，然后进行10倍系列稀释，共6个稀释度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接种至已制备好的6孔细胞培养板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培养箱内吸附90min，每隔15min轻摇板一次，然后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，于培养箱中培养7d后，弃去覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温30min后弃去染色液，用自来水冲洗至流水无色，晾干，细胞培养板孔内蚀斑清晰可见。
统计各孔蚀斑数，计算结果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。
PFU/ml=（每孔平均蚀斑数×病毒稀释倍数）/每孔接种病毒量1.5 免疫荧光法1.5.1制备单层细胞将Vero细胞调整浓度至1×105个/ml，接种96孔细胞培养板中，长满单层后备用。
1.5.2病毒滴度测定用细胞培养液将待测的狂犬病毒样品以10倍系列稀释，共6个稀释度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接种至制备好的96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度6孔，每块板上设正常细胞对照孔和病毒阳性对照孔，置5% CO2、37℃培养箱中培养2d后，用PBS洗板3次，室温干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后弃丙酮，置室温干燥，然后用100×稀释的荧光抗体进行染色，50μL/孔，置湿盒内37℃温育30min，洗板3次，甘油封闭，荧光显微镜下观察，计数病毒感染细胞的荧光灶数，细胞浆内有绿色特异性荧光颗粒者为阳性。
正常细胞对照无特异性荧光，病毒对照阳性者为有效，以Reed-Muench法计算感染性滴度[2]。
1.6 小鼠LD50测定法将病毒样品进行10倍系列稀释，脑内接种11～13g的小鼠，每个稀释度注射6只，0.03ml/只。
连续观察14d，3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内，计算LD50。
2.结果12份病毒液样品分别用蚀斑法、免疫荧光法及小鼠脑内滴定法测定病毒滴度，结果见表1。
蚀斑法、免疫荧光法分别与小鼠法进行比较，均显示差异无统计学意义（P值分别为0.154，0.699，均为P＞0.05），相关系数为0.646，0.859，说明蚀斑法和免疫荧光法的检测结果与小鼠LD50法呈良好的正相关性。
重复性实验，同一份病毒样本分别用蚀斑法和免疫荧光法检测6次，结果见表2。
蚀斑法测得的lgPFU/ml值的范围为6.62～7.11，变异系数为2.41%；免疫荧光法测得的lgFFU/ml值的范围为6.69～7.00，变异系数为1.69%。
说明免疫荧光法有更好的重复性，精密度更高。
3.讨论国内狂犬病毒的毒力测定一直沿用小鼠LD50法，随着越来越多的人关注动物保护和动物福利等问题，细胞替代法将成为一个必然趋势。
细胞培养条件相对比较好控制，不同批次的细胞均来源于同一株细胞，重复性较好，检测时间也相对较短。
WHO推荐的实验室诊断方法为免疫荧光法，可精确计数被病毒感染的细胞个数，此法敏感且特异性好。
目前，国内也已经开始采用免疫荧光法控制狂犬病疫苗的生产过程[3-5]。
蚀斑法，从理论上讲，一个蚀斑是由一个病毒颗粒感染一个易感细胞形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆，因此，以蚀斑法对毒力强弱的评价较直观、客观性强。
目前这两种方法均被广泛用于狂犬病毒感染的诊断。
实验验证蚀斑法和免疫荧光法与小鼠LD50法检测结果均呈良好的正相关性，可应用于狂犬病毒株PV-2061病毒滴度的检测。
重复性实验显示免疫荧光法的精密度更好，值得推广用于狂犬病毒感染性滴度的检测。
【参考文献】[1]路明霞，殷大鹏．世界卫生组织关于狂犬病疫苗的意见书[J]．中国疫苗和免疫,2008,14(2):187-188．[2]戴华生.新实验病毒学.病毒的滴定及其应用.第1版.北京:中国学术出版社，1983.[3]杨屹，汝东宇，郭秀侠，等.应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志,2011，24（5）:583-585，589.[4] Hassanzadeh SM，Zavareh A，Shokrgozar MA，et al. High vero cell density and rabies virus proliferation on fibracel disks versus cytodex-1 in spinner flask[J].Pak J Biol Sci，2011，14（7）:441-448.[5] Guo CP，Wang CH，Luo S，et al. The adaptation of a CTN-1 rabies virus strain to high-titered growth in chick embryo cells for vaccine development[J].Virol J，2014，11（1）:85-92.。