高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中β-乳球蛋白

高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中α-乳白蛋白Determination of α-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography ( HPLC)

关荣发1，黄光荣1，贾振宝1，戴贤君1，叶兴乾2 GUAN Rong-fa1, HUANG Guang-rongn1, JIA Zhen-bao1, DAI Xian-jun1, YE Xing-qian2（1.中国计量学院生命科学学院，杭州310018; 2.浙江大学食品科学与营养系，杭州310029）

(1. College of Life Sciences, China Jiliang University，Hang Zhou 310018; 2. Department of

Food Science and Nutrition, Zhejiang University, Hangzhou 310029) 摘要: 建立了利用常规的C18色谱柱的高效液相色谱测定牛乳中主要过敏蛋白α-乳白蛋白含量的方法。色谱条件: 色谱柱Alltima-C18( 4.6 mm×200 mm, 5μm) , 柱温为45℃, UV 检测波长2l5 nm, 流动相A为含0.1%三氟乙酸的超纯水,流动相B为乙腈∶超纯水∶三氟乙酸=400∶100∶0.5，采用梯度洗脱方法，流速0.8mL/min。结果表明: α-乳白蛋白的线性范围分别为50μg/mL-1000μg/mL( r=0.9909); α-乳白蛋白平均回收率为97.27 %, RSD=0.76%(n=5);该方法简便、准确, 适合于乳制品中α-乳白蛋白含量的测定。

关键词: 高效液相色谱法; α-乳白蛋白; 乳制品; 测定

Abstract: A method for the determination ofα-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography has been established. The chromatography conditions as follow: Alltima-C18 conlum (4.6 mm×200 mm, 5 μm), UV detection wavelengts 215 nm. This method consisted of a linear gradient of the two mobile phases of 0.1% trifluoroacetic acid in water and 0.5% trifluoroacetic acid and 80% acetonitrile in water at a flow rate of 0.5 mL/min, The conlum temperature was 25

℃.The result showed that for α-lactalbumin the calibration curve was linear in the range of 50μ

g/mL ~1000μg/mL( r=0.9909). The average recovery percent was 97.27, the RSD was

0.76%( n=5).The methods is suitable for contents analysis of α-lactalbumin in milk products.

Key words: high performance liquid chromatography; α-lactalbumin; milk products; determination 随着人们生活水平的提高，奶制品在国内的消费量迅速增加，2005年我国城镇居民奶类人均消费量（折鲜奶）已达25公斤以上，饮用UHT奶、巴氏杀菌奶等液态奶已在我国渐成习惯，液态乳已经成为我国的主要乳制品。但牛乳过敏是儿童中一种常见的食物过敏，严重地影基金项目：浙江省分析测试科技计划项目（编号：2007F70027）

作者简介:王关荣发(1975 - )男,中国计量学院生物安全与食品科学研究所

讲师,博士研究生。E-mail:rfguan@163. com

响儿童的身体健康[]1。在成年人中牛乳过敏也时有发生，已引起了全球的广泛关注[]2。牛乳中的主要过敏成分有α-乳白蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白等。2002年国际食品规范委员会提议对欧洲的食品标签法规进行修改，提议对所有的食物中的过敏成分进行标识[]3。这一提议对保护食物过敏人群非常有利，但同时也要求更可靠有效的食物过敏原检测方法来确保它的实施。

用于检测牛乳过敏原的方法主要有：免疫吸附实验、SDS-PAGE电泳、酶联免疫吸附实验、聚丙烯凝胶电泳结合激光扫描、电泳和毛细管电泳等方法。但以上各种方法在测定α-乳白蛋白时都有一定的难度，难以在实践中应用。反相高效液相色谱法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一，与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势,国内外相关的α-乳白蛋白液相测定方法需要专门的C4色谱柱，而C4色谱柱用途不及C18色谱柱广泛。本文采用C18色谱柱，优化了α-乳白蛋白的分析条件，与现有的方法相比,可以利用常规的C18色谱柱，缩短了分析时间，建立的定量测定α-乳白蛋白的方法为监测目前市场中各类乳制品中的α-乳白蛋白及低过敏乳制品的研究和质量提供了有效的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生乳：浙江省杭州二牧奶牛场，浙江省杭州普利奶牛场，浙江省杭州乔司奶牛场

α-乳白蛋白标准品(Sigma公司)

乙腈：色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司

甲醇：色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司

三氟乙酸（TFA）：色谱纯，美国TEDIA公司

氯化钠：分析纯, 上海光铧科技有限公司

叠氮化钠（Sodium Azide），分析纯, 浙江东阳利得医药化学有限公司

1.2 仪器

BioSafe Avanti J-10 型高速冷冻离心机：美国贝克曼有限公司

C5型超高压均质机：加拿大A VESTIN公司

Delta 320-S pH计：瑞士梅特勒公司

Millex-HA 型滤器：美国密理博公司

Hitachi(日立) CR22G高速冷冻离心机：日本日立公司

Waters2695 型高效液相色谱仪：美国Waters公司

Warters 2996二级管阵列检测器：美国Waters公司

QL-901型旋涡混合器：东莞市华达电子仪器有限公司