高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中β-乳球蛋白
基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法[发明专利]
![基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a8b9b18cc67da26925c52cc58bd63186bceb92e3.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610983381.9(22)申请日 2016.11.09(71)申请人 北京奶牛中心地址 100192 北京市朝阳区德胜门外清河南镇(72)发明人 刘林 吕小青 赵凤 水明 赵凤茹 王彦平 李艳华 张建聪 曾伊凡 李智洋 高耀超 (74)专利代理机构 北京汇智英财专利代理事务所(普通合伙) 11301代理人 何晖(51)Int.Cl.G01N 30/74(2006.01)G01N 30/06(2006.01)G01N 30/86(2006.01)(54)发明名称基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法(57)摘要本发明涉及一种基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法，包括如下步骤：S1：制备β-酪蛋白标准品；S2：制备β-酪蛋白样品；S3：制备第一流动相和第二流动相；S4：在液相色谱仪中进样样品后，不同时间以不同浓度比例的第一流动相和第二流动相的混合液分别冲洗样品和标准品，根据标准品中β-酪蛋白两种不同结构样品的出峰时间，实现β-酪蛋白样品中不同结构样品的分离；其中，所述第一流动相为三氟乙酸水溶液，第二流动相为乙腈溶液。
本发明提供的基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法，简单易行、方便可靠、重现性好、准确度高，能够实现对样品的批量检测，大大减少分析时间。
权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 108072725 A 2018.05.25C N 108072725A1.一种基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：制备β-酪蛋白标准品；S2：制备β-酪蛋白样品；S3：制备第一流动相和第二流动相；S4：在液相色谱仪中进样样品后，在不同时间以不同浓度比例的第一流动相和第二流动相的混合液分别冲洗β-酪蛋白样品和β-酪蛋白标准品，根据β-酪蛋白标准品中β-酪蛋白两种不同结构样品的出峰时间，实现β-酪蛋白样品中不同结构样品的分离；其中，所述第一流动相为三氟乙酸水溶液，第二流动相为乙腈溶液。
牛乳清蛋白中β-乳球蛋白的分离纯化
牛乳清蛋白中β-乳球蛋白的分离纯化
吴凤;王志耕;王子龙;董娟娟
【期刊名称】《包装与食品机械》
【年(卷),期】2008(026)004
【摘要】结合硫酸铵分段盐析和凝胶层析两种方法,从牛乳乳清蛋白中分离、提纯出β-乳球蛋白.通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白成分,结果显示:①在20%～30%、70%～80%盐析段只有两条带,分别是β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白带,得到较纯的蛋白;②再用SephadexG-50凝胶过滤层析,电泳结果显示只有一条带,并与标准β-乳球蛋白带一致,得到较纯的β-乳球蛋白.
【总页数】3页(P32-33,40)
【作者】吴凤;王志耕;王子龙;董娟娟
【作者单位】安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036;安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036;安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036;安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.4
【相关文献】
1.消除乳清蛋白中β-乳球蛋白致敏性的研究进展 [J], 李永涛;张兰威;孔保华
2.人乳、牛乳、羊乳中乳清部分氨基酸组成及乳清蛋白中蛋白质二级结构的对比[J], 张熙桐;关博元;孔繁华;刘彪;陶冬冰;武俊瑞;岳喜庆
3.脱盐牛乳乳清粉中β-乳球蛋白的分离纯化 [J], 杨章昀;冯郑珂;潘家荣
4.高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α乳白蛋白和β乳球蛋白及其改性降敏 [J], 赵倩如;朱丽英;赵权宇;江凌
5.超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定乳清蛋白粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白 [J], 杜娟;郑云鹏;董洪涛;张凤霞
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高效液相色谱法测定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白
食品研究与开发
Ｆｏ ｏ ｄ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ａｎ ｄ Ｄｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｏ ｍｅ ｎ ｔ
２ ０ １ ３年 １ 月 第３ ４卷第 ２期
５ ７ ＝＝ Ｉ
高效液相色谱法测定 一 乳 白蛋 白和
１ ３ － ￥ Ｌ 球蛋 白
王 莹 ， 屈 玉 霄 ， 刘春红 ， 冯 志 彪 ，
ｔ ｒ ｉ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｏ ａ ｃ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｉ ｎ ａ ｃ ｅ ｔ ｏ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｌ ｅ ａ ｎ ｄ ０ ． １％ ｔ ｒ ｉ ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｏ ａ ｃ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｉ ｎ ｗａ ｔ ｅ ｒ ａ ｔ ａ ｌｏ ｆ ｗ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｆ １ ｍＬ ／ ｍｉ ｎ ． Ｔｈ ｅ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍｎ
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（ ４ ． ６ ｍｍ ｘ ｌ ５ ０ ｍｍ， ５ Ｉ ｘ ｍ） 色谱 柱 ， 流动 相 Ａ为 含 ０ ． １ ％三 氟 乙 酸 的超 纯 水 ， 采 用
梯 度洗 脱的 方法 ， 流速 １ ｍＬ ／ ｍ ｉ ｎ ， 枉温 ２ ５℃， 检测 波 长 ２ ８ ０ ｎ Ｉ ｎ 。 结果 表 明 ， 一 乳 白蛋 白和 母 ～ 乳 球蛋 白的回 收率
ｔ ｈ ａ ｎ ９ ２ ％ ，ｔ ｈ ｅ Ｒ Ｓ Ｄ ｌ ｅ ｓ ｓ ｔ ｈ ａ ｎ ５％ ． Ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｉ ｓ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｏｒ ｆ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ仅－ ｌ ａ ｃ ｔ ａ ｌ ｂ ｕ ｍｉ ｎ ａ ｎ ｄ Ｂ—
超高效液相色谱法快速检测牛乳中β-乳球蛋白
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图3 定量限色谱图
3 结论
本检测方法可以满足测定正常牛乳中β-乳球蛋白
据《GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化
检测》的要求，参考上述方法条件，选择在牛乳样品中
添加300mg/L、1 000mg/L、2 000mg/L三个浓度水平
的回收实验和精密度实验，重复6次，结果见表2。
表2 牛乳中β-乳球蛋白添加回收率
添加浓度 (mg/L)
实验 次数
测定浓度 回收率
三氟乙酸TFA（色谱纯）；浓盐酸（分析纯）；磷 酸氢二钠（分析纯）；磷酸二氢钠（分析纯）；乙腈 （色谱纯）。 1.3 标准溶液配制
（1）β-乳球蛋白标准储备溶液（10mg/mL）： 将β-乳球蛋白标准品(CAS：9045-23-2，Sigma） 按证书提供的纯度换算后称量，用水定容至10mL， 于-20℃保存，有效期为3个月。
处理时间，故将其当做一个峰来处理。
以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐
标，绘制标准曲线。按照上述仪器条件进行检测，得到
各浓度值的峰面积（表1）。
标准曲线线性方程：Y=34129ρ+94714。标准曲 线线性相关系数R2=0.9981，高于0.99。
牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定 高效液相色谱法
ICS67.100CCSX16NY 中华人民共和国农业行业标准NY∕TXXXXX-XXXX牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法Determinationofimmunog1obu1inGinmi1kanddairyproducts-Highperformance1iquidchromatography点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）（本稿完成日期：2023.07）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施中华人民共和国农业农村部发布■》4. —1—刖百本文件按照GB/T1.1—2023《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
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本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。
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本文件起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）、内蒙古智慧质量中心有限公司、黑龙江飞鹤乳业有限公司。
本文件主要起草人：XXXo牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法1范围本文件描述了牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG测定的高效液相色谱方法。
本文件适用于生牛乳、巴氏杀菌牛乳和添加了含有免疫球蛋白IgG成分的牛乳基婴幼儿配方乳粉中免疫球蛋白IgG含量的测定。
本文件中生牛乳、巴氏杀菌牛乳中免疫球蛋白IgG的定量限为10mg/kg；添加了含有免疫球蛋白IgG成分的牛乳基婴幼儿配方乳粉中免疫球蛋白IgG的定量限为40mg/kgo2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。
高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中α-乳白蛋白
高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中α-乳白蛋白Determination of α-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography ( HPLC)关荣发1，黄光荣1，贾振宝1，戴贤君1，叶兴乾2 GUAN Rong-fa1, HUANG Guang-rongn1, JIA Zhen-bao1, DAI Xian-jun1, YE Xing-qian2（1.中国计量学院生命科学学院，杭州310018; 2.浙江大学食品科学与营养系，杭州310029）(1. College of Life Sciences, China Jiliang University，Hang Zhou 310018; 2. Department ofFood Science and Nutrition, Zhejiang University, Hangzhou 310029) 摘要: 建立了利用常规的C18色谱柱的高效液相色谱测定牛乳中主要过敏蛋白α-乳白蛋白含量的方法。
色谱条件: 色谱柱Alltima-C18( 4.6 mm×200 mm, 5μm) , 柱温为45℃, UV 检测波长2l5 nm, 流动相A为含0.1%三氟乙酸的超纯水,流动相B为乙腈∶超纯水∶三氟乙酸=400∶100∶0.5，采用梯度洗脱方法，流速0.8mL/min。
结果表明: α-乳白蛋白的线性范围分别为50μg/mL-1000μg/mL( r=0.9909); α-乳白蛋白平均回收率为97.27 %, RSD=0.76%(n=5);该方法简便、准确, 适合于乳制品中α-乳白蛋白含量的测定。
关键词: 高效液相色谱法; α-乳白蛋白; 乳制品; 测定Abstract: A method for the determination ofα-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography has been established. The chromatography conditions as follow: Alltima-C18 conlum (4.6 mm×200 mm, 5 μm), UV detection wavelengts 215 nm. This method consisted of a linear gradient of the two mobile phases of 0.1% trifluoroacetic acid in water and 0.5% trifluoroacetic acid and 80% acetonitrile in water at a flow rate of 0.5 mL/min, The conlum temperature was 25℃.The result showed that for α-lactalbumin the calibration curve was linear in the range of 50μg/mL ~1000μg/mL( r=0.9909). The average recovery percent was 97.27, the RSD was0.76%( n=5).The methods is suitable for contents analysis of α-lactalbumin in milk products.Key words: high performance liquid chromatography; α-lactalbumin; milk products; determination 随着人们生活水平的提高，奶制品在国内的消费量迅速增加，2005年我国城镇居民奶类人均消费量（折鲜奶）已达25公斤以上，饮用UHT奶、巴氏杀菌奶等液态奶已在我国渐成习惯，液态乳已经成为我国的主要乳制品。
高效液相色谱法在牛乳整体蛋白检测中的应用
Aug. 2020 CHINA FOOD SAFETY 167食品科技1 应用液相色谱法分离牛乳及其乳制品中的蛋白1.1 疏水相互作用色谱（HIC）HIC 是利用盐水体系中不同蛋白的疏水残基与填料疏水性配基相互作用力的不同而进行分离的一种方法，固定相的疏水性适中。
其梯度洗脱的弱洗脱剂是高浓度盐的缓冲液，而强洗脱溶液是低盐浓度的缓冲溶液，通常是在pH 值为6～8条件下进行分 离的。
文献[1]利用疏水色谱柱在快速蛋白液相色谱系统下，分析了β-酪蛋白、αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白与γ-酪蛋白5种酪蛋白的含量，其中γ-酪蛋白是β-酪蛋白的水解产物变种，但该方法并未分开γ-酪蛋白和αs2-酪蛋白。
当调整pH 值并改善缓冲液后，分离了4种乳清蛋白：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白。
文献[2]用TSK 疏水色谱柱对α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白进行了分析，流动相为磷酸盐缓冲液和高浓度的变性剂脲，用硫酸铵梯度洗脱，对全脂奶粉和脱脂酸奶进行了分析测定。
在实际样品中分析酪蛋白主要有两个困难：酪蛋白在水中溶解度低；乳清蛋白的干扰[2]，文献[1-2]中很好的解决了这个问题，表明了TSK 柱是定性定量分析实际样品很好的工具，结果准确，重现性好，在检测乳制品酪蛋白含量具有独特的优势。
1.2 反相液相色谱（RPLC）RPLC 是公认的HPLC 中分离度最高，应用范围最广的液相色谱分析方法。
它是基于蛋白质分子的疏水性的不同而实现分离的，与HIC 相比，RPLC 固定相的非极性更强。
文献[3]通过实验发现对分别经盐酸胍和脲处理后的样品进行立即分析，二者具有相似的分离效果，但在放置8.5 h 以后，发现用脲处理的样品的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分离度降低。
同时也发现用二硫苏糖醇处理样品要比β-巯基乙醇更能改善这两种蛋白的分离效果。
文献[4]又在预处理培养液中加入了Bis-tris 缓冲液，离心去脂后得到了澄清溶液，用碳18反相柱分析了αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白6种蛋白。
反相高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白
反相高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白李慧;陈敏;李赫;罗永康;戴蕴青【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2007(25)1【摘要】乳清蛋白是牛奶中的一种主要蛋白质，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是其主要成分，分别占其总量的40％～50％和10％～20％。
乳清蛋白具有较高的营养价值及功能特性，已经被越来越多地应用于食品工业，市场上已经出现了许多不同种类和品牌的乳清蛋白粉保健品，如儿童营养蛋白粉、婴儿配方奶粉等。
但乳清蛋白又是一种常见的过敏原，β-乳球蛋白是最主要的过敏原，其次为α-乳白蛋白。
因此，通过蛋白质改性的方法已经开发出了低过敏或无过敏的乳清蛋白质制品。
反相高效液相色谱法（RP—HPLC）是分析乳清蛋白成分的有效方法之一，与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势。
【总页数】2页(P116-117)【作者】李慧;陈敏;李赫;罗永康;戴蕴青【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.牦牛乳清中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白的热聚合反应 [J], 王立枫;马莺;李琳;崔杰2.聚合物/磷酸盐双水相分离乳清分离蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白条件的优化[J], 张鹤;姜彬;冯志彪;屈玉霄;李璇3.含有α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的乳清蛋白浓缩物分馏产品在水溶液中的特性[J],4.高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α乳白蛋白和β乳球蛋白及其改性降敏 [J], 赵倩如;朱丽英;赵权宇;江凌5.超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定乳清蛋白粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白 [J], 杜娟;郑云鹏;董洪涛;张凤霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
反相高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白
小的 ， 其相 对分 子 质量 为 １ ７ ， １３个 氨 基 酸 残 基 组 成 ４１４ 由 ２ 的单 体 球 蛋 白 。卢乳 球 蛋 白是 由 １２个 氨 基 酸 残 基 折 叠 成 一 ６
的 紧 密 球 状 结 构 ， 对 分 子 质 量 为 ｌ ０ 。口 乳 球 蛋 白 的 二 相 ８ ０ 一 ０
蛋 白质 制 品 。反 相 高 效 液 相 色 谱 法 （ ＰＨＰ Ｃ） 分 析 乳 清 Ｒ— Ｌ 是 蛋 白成 分 的有 效 方 法 之 一 ， 其 他 色 谱 方 法 相 比具 有 分 辨 率 与
和 回收 率 高 、 复性 好 、 作简 便 等 优势 。 目前 ， Ｐ Ｈ Ｌ 重 操 Ｒ —Ｐ Ｃ 分 析乳 清蛋 白在 国 外 已 经 进 行 了一 定 的 研 究 一 ， 国 内 尚 但 未 见有 关 的 研究 报 道 。本 文 采 用 Ｃ 色 谱 柱 ， 化 了 Ｏ 乳 白 优 ／ 一 蛋 白 和 口 乳 球 蛋 白 的 分 析 条 件 ， 现 有 的方 法 相 比缩 短 了 分 一 与
２ 结 果 与 讨 论
２ １ ＨＰ Ｃ 条 件 的 选 择 ． Ｌ 乳 清 蛋 白 中的 ａ 乳 白蛋 白是 牛 奶 蛋 白 质 中 分 子 质 量 最 一
析 时 间 ， 立 的 定 量 测 定 两 种 蛋 白质 的 方 法 为 监 测 目前 市 场 建
中 各 类 乳 清 蛋 白粉 保 健 品 及 低 过 敏 乳 制 品 的 质 量 提 供 了 有
乳 清 蛋 白 是 牛 奶 中 的 一 种 主 要 蛋 白质 ， 哥Ｌ 蛋 白和 ａ 口 球 一 乳 白蛋 白 是 其 主要 成 分 ， 别 占其 总 量 的 ４ ％ ～ ０ 和 １ ％ 分 ０ ５％ ０
～
高效液相色谱法测定牛乳中_乳白蛋白
基金项目:浙江省分析测试科技计划项目(编号:2007F70027);中国计量学院校立自然科学(重点)项目(编号:0100801-0035)作者简介:关荣发(1975-),男,中国计量学院生物安全与食品科学研究所副教授,博士。
E -mail :rfgu an @ 收稿日期:2010-10-25第27卷第1期2011年1月V ol .27,N o .1Jan .201110.3969/j .issn .1003-5788.2011.01.017高效液相色谱法测定牛乳中α-乳白蛋白Determination of α-lactalbu min in milk products by highperforman ce liquid chromatography 关荣发1GUA N Rong -fa1 贾振宝1J I A Zhen -bao 1 黄光荣1H U AN G Guang -rongn 1 戴贤君1D A I X ian -jun 1 叶兴乾2YE X ing -qian2(1.中国计量学院生命科学学院,浙江杭州 310018;2.浙江大学食品科学与营养系,浙江杭州 310029)(1.College o f L i f e Sciences ,China J iliang University ,Hangzhou ,Z he jiang 310018,China ;2.Department of Food Science and N utrition ,Z hejiang University ,Hangzhou ,Zhej iang 310029,China )摘要:利用常规的C 18色谱柱的高效液相色谱建立测定牛乳中主要过敏蛋白α-乳白蛋白含量的方法。
色谱条件:色谱柱A lltima -C 18(4.6mm ×200mm ,5μm ),柱温为45℃,U V 检测波长215nm ,流动相A 为含0.1%三氟乙酸的超纯水,流动相B 为乙腈∶超纯水∶三氟乙酸=400∶100∶0.5,采用梯度洗脱方法,流速0.8mL /min 。
211242154_高效液相色谱-同位素稀释质谱法准确定量牛乳中β-乳球蛋白
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第S期 陈 燕 秋 等 (高 效 液 相 色 谱1同 位 素 稀 释 质 谱 法 准 确 定 量 牛 乳 中1乳 球 蛋 白
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高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中α-乳白蛋白Determination of α-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography ( HPLC)关荣发1，黄光荣1，贾振宝1，戴贤君1，叶兴乾2 GUAN Rong-fa1, HUANG Guang-rongn1, JIA Zhen-bao1, DAI Xian-jun1, YE Xing-qian2（1.中国计量学院生命科学学院，杭州310018; 2.浙江大学食品科学与营养系，杭州310029）(1. College of Life Sciences, China Jiliang University，Hang Zhou 310018; 2. Department ofFood Science and Nutrition, Zhejiang University, Hangzhou 310029) 摘要: 建立了利用常规的C18色谱柱的高效液相色谱测定牛乳中主要过敏蛋白α-乳白蛋白含量的方法。
色谱条件: 色谱柱Alltima-C18( 4.6 mm×200 mm, 5μm) , 柱温为45℃, UV 检测波长2l5 nm, 流动相A为含0.1%三氟乙酸的超纯水,流动相B为乙腈∶超纯水∶三氟乙酸=400∶100∶0.5，采用梯度洗脱方法，流速0.8mL/min。
结果表明: α-乳白蛋白的线性范围分别为50μg/mL-1000μg/mL( r=0.9909); α-乳白蛋白平均回收率为97.27 %, RSD=0.76%(n=5);该方法简便、准确, 适合于乳制品中α-乳白蛋白含量的测定。
关键词: 高效液相色谱法; α-乳白蛋白; 乳制品; 测定Abstract: A method for the determination ofα-lactalbumin in milk products by high performance liquid chromatography has been established. The chromatography conditions as follow: Alltima-C18 conlum (4.6 mm×200 mm, 5 μm), UV detection wavelengts 215 nm. This method consisted of a linear gradient of the two mobile phases of 0.1% trifluoroacetic acid in water and 0.5% trifluoroacetic acid and 80% acetonitrile in water at a flow rate of 0.5 mL/min, The conlum temperature was 25℃.The result showed that for α-lactalbumin the calibration curve was linear in the range of 50μg/mL ~1000μg/mL( r=0.9909). The average recovery percent was 97.27, the RSD was0.76%( n=5).The methods is suitable for contents analysis of α-lactalbumin in milk products.Key words: high performance liquid chromatography; α-lactalbumin; milk products; determination 随着人们生活水平的提高，奶制品在国内的消费量迅速增加，2005年我国城镇居民奶类人均消费量（折鲜奶）已达25公斤以上，饮用UHT奶、巴氏杀菌奶等液态奶已在我国渐成习惯，液态乳已经成为我国的主要乳制品。
但牛乳过敏是儿童中一种常见的食物过敏，严重地影基金项目：浙江省分析测试科技计划项目（编号：2007F70027）作者简介:王关荣发(1975 - )男,中国计量学院生物安全与食品科学研究所讲师,博士研究生。
E-mail:rfguan@163. com响儿童的身体健康[]1。
在成年人中牛乳过敏也时有发生，已引起了全球的广泛关注[]2。
牛乳中的主要过敏成分有α-乳白蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白等。
2002年国际食品规范委员会提议对欧洲的食品标签法规进行修改，提议对所有的食物中的过敏成分进行标识[]3。
这一提议对保护食物过敏人群非常有利，但同时也要求更可靠有效的食物过敏原检测方法来确保它的实施。
用于检测牛乳过敏原的方法主要有：免疫吸附实验、SDS-PAGE电泳、酶联免疫吸附实验、聚丙烯凝胶电泳结合激光扫描、电泳和毛细管电泳等方法。
但以上各种方法在测定α-乳白蛋白时都有一定的难度，难以在实践中应用。
反相高效液相色谱法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一，与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势,国内外相关的α-乳白蛋白液相测定方法需要专门的C4色谱柱，而C4色谱柱用途不及C18色谱柱广泛。
本文采用C18色谱柱，优化了α-乳白蛋白的分析条件，与现有的方法相比,可以利用常规的C18色谱柱，缩短了分析时间，建立的定量测定α-乳白蛋白的方法为监测目前市场中各类乳制品中的α-乳白蛋白及低过敏乳制品的研究和质量提供了有效的方法。
1 材料与方法1.1 试验材料生乳：浙江省杭州二牧奶牛场，浙江省杭州普利奶牛场，浙江省杭州乔司奶牛场α-乳白蛋白标准品(Sigma公司)乙腈：色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司甲醇：色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司三氟乙酸（TFA）：色谱纯，美国TEDIA公司氯化钠：分析纯, 上海光铧科技有限公司叠氮化钠（Sodium Azide），分析纯, 浙江东阳利得医药化学有限公司1.2 仪器BioSafe Avanti J-10 型高速冷冻离心机：美国贝克曼有限公司C5型超高压均质机：加拿大A VESTIN公司Delta 320-S pH计：瑞士梅特勒公司Millex-HA 型滤器：美国密理博公司Hitachi(日立) CR22G高速冷冻离心机：日本日立公司Waters2695 型高效液相色谱仪：美国Waters公司Warters 2996二级管阵列检测器：美国Waters公司QL-901型旋涡混合器：东莞市华达电子仪器有限公司Waters Oasis HLB Extracton Cratridge：美国Waters公司Alltima-C18色谱柱(4.6mm x 250mm, 5μm，美国奥泰科技(中国)有限公司)1.2 试验方法1.2.1 色谱条件流动相：流动相(A)：超纯水含0.1%三氟乙酸（TFA），流动相(B)：乙腈+超纯水+三氟乙酸(400/100/0.5)，流速0.8mL/min，柱温45℃，检测波长：215nm表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition时间Time（min）流速mL/min洗脱液ASolvent A (%)洗脱液BSolvent B (%)0 0.8 64 3620 0.8 44 5630 0.8 40 6035 0.8 64 3638 0.8 64 361.2.2 对照品溶液的制备精确称取α-乳白蛋白标准品16mg，用超纯水配制成1.6mg/mL的原液；适量吸取原液，配制成标样浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL的系列标准液。
1.2.3 样品供试液的制备将牛乳于20℃条件下，以2000g离心20min后，把上层脂肪去掉；取上清液于10mL离心管中，置于-20℃保存，待测；分别取5mL0.10mol/L,pH 4.6醋酸缓冲液和1mL上清液于10mL离心管中；用漩涡振荡器混匀牛乳样品后，于室温下以4000g离心10min；取上清液，用0.45μm水性滤器过滤到1.5mL离心管中，滤液用于α-乳白蛋白的测定。
2 结果与分析2.1 流动相的选择采用反相高效液相色谱方法分析蛋白的流动相系统基本为三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液，采用梯度洗脱，但随着样品的不同及色谱柱的不同，梯度洗脱条件也随之改变。
在蛋白质的反相液相色谱分离中，初始洗脱条件下流动相中有机溶剂的浓度较低，蛋白质与固定相间的疏水作用较强，蛋白质几乎完全被固定相吸附。
而一旦流动相中的有机溶剂达到特定的浓度，使蛋白质与固定相的作用小于与流动相的作用时，蛋白质就会完全从固定相上洗脱下来，几乎不再与固定相发生作用。
本试验尝试了以不同比例的三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液作流动相。
当以高比例的水进行梯度洗脱时，蛋白质的出峰时间延迟；而以高比例的乙腈进行梯度洗脱时，多肽及蛋白质的出峰时间缩短，但α-乳白蛋白和β-乳球蛋白不能分开。
在兼顾保留时间和分离度的前提下，最终选择用于测定α-乳白蛋白的流动相及梯度洗脱条件如“1.2.1”节所述。
标准品和样品的分离结果分别见图1和图2。
a:α-乳白蛋白图1 标准品HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of standard reference2.2 回归方程、线性范围及检出限精确称取α-乳白蛋白标准品6mg，用超纯水配制成0.6mg/mL的原液；适量吸取原液，配制成标样浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mg/mL的系列标准液，按1.2.1所述色谱条件进行测定, 以峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标做标准曲线, 得α-乳白蛋白的回归方程为Y=1406800X+1221.4(r=0.9909)，线性范围为50μg/mL-1000μg/mL; 以信噪比S/N=3 计算α-乳白蛋白的检测限为30ng色谱图（见图1）。
2.3 加样回收率实验以同一奶粉配制的牛奶为空白样品，精确定量加入α-乳白蛋白标准品溶液，按样品处理方法制备样品液，进行测定，用已知浓度的样品溶液定溶, 按1.2.1 所述色谱条件, 每样平行测定5 次, 每次进样50μL, 测定其中α-乳白蛋白的含量, 计算回收率, 得α-乳白蛋白平均回收率为97.27%，RSD=0.76%( 结果见表1)。
表1 α-乳白蛋白回收率(n=5) Table 1 Recovery ofα-lactalbumin (n=5)本底含量（mg/mL）Background amount/（mg/mL）加入量（mg/mL）Added amount/（mg/mL）测出量（mg/mL）Detectable amount/（mg/mL）平均回收率/%Averagerecovery/%RSD/%0.601 0.05 0.649 96.4 3.840.601 0.1 0.699 97.6 3.570.601 0.2 0.797 97.8 2.362.4 精密度实验取同一对照品溶液(α-乳白蛋白0.2 mg/mL) , 按1.2.1 所述色谱条件进行测定, 连续进样5次, 每次50μL记录色谱峰面积, 计算相对标准偏差, 结果α-乳白蛋白RSD=0.86 %。