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分析化学精品课程课件色谱法
组分在固定相中的浓度 K 组分在流动相中的浓度
(1) 一定温度下， K值最小的组分最先流出色谱柱，而 K值越大的组分，出峰越慢；
(2) 试样一定时，K 主要取决于固定相性质；即 每个组 份在各种固定相上的分配系数 K 不同；
(3) 选择适宜的固定相可改善分离效果；
(4) 试样中的各组分具有不同的 K 值是分离的基础；
2.色谱法分类
根据流动相和固定相物理状态分:
气相色谱 液相色谱
气固色谱
流动相为气体， 固定相为固体吸附剂
气液色谱
流动相为气体， 固定相为液体
液固色谱 流动相为液体， 固定相为固体吸附剂。
液液色谱 流动相为液体， 固定相为液体
(2) 根据分离过程中固定相的形状分:
A、柱色谱法:填充柱色谱、毛细管色谱 B、平面色谱:纸色谱、薄层色谱
第九章 色谱法
GC/HPLC/IC
2024年11月3日12时20 分
§9.1 概述 §9.2 气相色谱分析理论基础 §9.3 气相色谱分离操作条件
的选择
§9.4 气相色谱检测器 §9.5 气相色谱定性/定量分析 §9.6 高效液相色谱法简介 §9.7 离子色谱法简介
本章基本要求
1.熟悉GC/HPLC/IC的基本组成、结构流程及各部件作用； 2.熟悉分配系数、容量因子的定义及相互关系； 3.掌握塔板理论、速率理论及分离度； 4.掌握气相色谱检测器结构、原理及特点； 5.掌握定量分析方法，了解定性分析方法; 6.了解操作条件的选择原则以及操作条件对分离的影响.
(3) C ·u —传质阻力项
传质阻力包括气相传质阻力 Cg和液相传质阻力CL即：
C =（Cg + CL）
Cg
0.01k (1 k)2
高效液相色谱分析实验
高效液相色谱分析实验高效液相色谱(HPLC)是一种用于分离、检测和定量分析化学样品的分析技术，具有高分辨率、高灵敏度和高选择性。
在实验室中，HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍HPLC的实验原理、步骤及关键技术。
一、实验原理HPLC的原理是将混合物通过高压注射，经过固定相柱进行分离。
在HPLC中，固定相柱是最重要的组成部分之一，它可以根据样品之间的化学性质选择不同的固定相柱，如反相柱、离子交换柱、手性柱等。
在HPLC实验中，样品可以通过两种方式进样，一种是自动进样器，另一种是手动进样。
进样器将样品注入进样站点后，通过高压泵将样品推入柱子中，样品在柱子中分离后，被通过光学检测器检测，进而得到分离的结果。
二、实验步骤1.样品准备：根据实验要求，准备需要进行分析的物质样品，将其溶解或稀释到适当的浓度。
2.选择柱子：根据样品的性质选择适当的固定相柱。
例如，如果样品是极性的，则选择反相柱。
3.设定实验条件：根据样品的特征和实验需求，设置高压泵的流速、检测器、柱温等参数。
4.样品进样：将样品使用自动进样器或手动进样器进行进样。
5.柱子分离：开启高压泵，将样品推入柱子中。
样品将在柱子中根据化学性质进行分离。
6.数据检测和记录：通过光学检测器检测样品的峰值，并记录分离结果。
可以使用计算机软件进行数据分析。
7.清洗和重用：实验完成后，需要对HPLC仪器进行清洗和重置，以便下次使用。
三、关键技术1.换柱：为了保证实验结果的准确性和可靠性，柱子需要定期更换。
柱子的寿命取决于样品的特性和使用情况。
2.校准标准品：在实验中使用标准品校准HPLC仪器，以确保仪器的准确性和灵敏度。
3.优化实验条件：通过改变流速、温度、柱子等实验条件，可以优化分离效果。
4.检测器选择：根据样品的性质选择合适的检测器，例如紫外检测器、荧光检测器等。
5.数据分析：使用HPLC软件对数据进行分析，生成和保存分析报告。
四、实验安全1.注意个人防护：在操作HPLC仪器时，应佩戴安全防护眼镜和手套，避免接触有害物质。
无机及分析化学第9章-高效液相色谱法
二、方法原理
5.亲和色谱法 主要利用生物大分子与固定相之间的特异亲和力 进行选择性分离及纯化的方法。
原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称 为间隔臂），然后再连接上配基。当含有复杂混合试样的流动 相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲和力特性的生物大 分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被淋洗出；随后 ，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形 式洗脱出来。
1.高压输液系统 一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过 滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成，其中高压输 液泵是核心部件。
（1）贮液器 用来贮存流动相，其材料对流动相是化学惰性的 。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等
（2）过滤和脱气装置 流动相在使用前应根据其性质选用不 同材料的滤膜过滤，一般选用市售的0.45 m的水性和油性滤 膜进行过滤 。样品溶液一般用市售的0.45 m针形滤器过滤。 另外，在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样 的滤柱和滤板。
一、分离类型的选择 色谱分离类型的选择原则列于图9－3中。
图9－3 PHLC分离类型的选择参考表
二、固定相和流动相的选择
（一）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为 刚性固体和硬胶两大类。固定相按孔隙深度可分为表 面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃 球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离 子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
例1 有机氯农药的测定，采用液－固色谱法。
色谱条件：50cm×2.5mm（内径）色谱柱；
三、HPLC法应用实例
流动相：正己烷； 固定相：薄壳硅胶 CorasilⅡ37~50μ m）；
什么是高效液相色谱(HPLC)
什么是HPLC
（高效液相色谱）？
1
什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
2
简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
6
3
什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
（高效液相色谱）？
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
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简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
安捷伦高效液相色谱基本原理-理论
前言
色谱柱内部的作用原理
时间 t
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 5
分离 tr2-tr1 峰宽 Wb1,2
前言
色谱柱内部的作用原理
tr2-tr1
tr2-tr1
较好分离
对比
较差分离
Wb1
Wb2
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 6
较好分离
对比
Wb1
Wb2
较差分离
前言
色谱柱内部的作用原理
Rs
tr2 tr1 1/ 2 (Wb2 Wb1)
分离度是对色谱基线分 离。
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 7
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 12
关键参数
保留因子 (k)
k
=
æ ç
tr
è
- t0 t0
ö ÷ ø
保留因子测定了样品组分在固定相与流动相中的保留时间之比。它是用保留 时间除以不保留峰的出峰时间 (t0) 计算得出的。
Wb2
t
关键参数
分离度 — 基线分离
分离度是对色谱柱分离目标峰能力的描 述。分离度将受到柱效 (N)、选择性 (a) 和保留 (k) 的影响。
• 可以进行充分定量分析的可测分离的最 小分离度为 1。
• 可辨别出两个等高峰之间峰谷的最低分 离度为 0.6。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
《液相色谱技术》课件
通过液相色谱技术，可以检测环境中的有毒有害物质，如农药、酚类等，为环境治理和保护提供科学依据。
生态毒理学研究
液相色谱技术可以用于研究环境污染物对生物体的毒理学效应，有助于了解环境污染对生态系统的危害。
液相色谱技术的未来发展与挑战
高效液相色谱法（HPLC）
HPLC是液相色谱技术中的一种，具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点，被广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。随着技术的不断发展，HPLC的分离柱、检测器等关键部件也在不断改进，提高了分离效果和检测灵敏度。
智能化与自动化：随着机器人技术和自动化控制技术的发展，液相色谱技术的操作将更加智能化和自动化。未来的液相色谱仪将更加便捷、高效，能够实现自动化进样、自动优化分离条件等功能，大大提高分析效率。
感谢观看
THANKS
流动相的准备与更换
根据实验要求，准备好适量的流动相，并定期更换以保证实验结果的准确性。
定期清洗进样器、色谱柱和检测器，保持仪器表面清洁。
日常保养
定期校准
常见故障排除
对仪器进行定期校准，确保检测结果的准确性。
遇到问题时，应先检查电源、管线连接等基本情况，再根据仪器手册排查故障。
03
02
01
液相色谱技术的实验设计
色谱柱
检测色谱柱流出的组分，并将其转化为电信号，便于记录和检测。
检测器
用于采集、处理、分析和存储色谱数据。
数据处理系统
数据处理与分析
采集色谱数据，进行峰识别、定量和合适的流速、检测波长等参数，开始色谱分离。
进样
将样品注入进样器，设定进样量，启动进样程序。
准备工作
检查仪器是否正常，准备好流动相、色谱柱和样品。
样品前处理的挑战：液相色谱技术对于样品的要求较高，需要进行适当的前处理以去除杂质、提高分离效果。目前常用的样品前处理方法包括沉淀、萃取、吸附等，但这些方法操作繁琐、耗时长且效果不稳定。为解决这一问题，新型的样品前处理技术如固相萃取、免疫吸附等正在不断发展，以提高样品处理的效率和效果。
生态毒理学研究
液相色谱技术可以用于研究环境污染物对生物体的毒理学效应，有助于了解环境污染对生态系统的危害。
液相色谱技术的未来发展与挑战
高效液相色谱法（HPLC）
HPLC是液相色谱技术中的一种，具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点，被广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。随着技术的不断发展，HPLC的分离柱、检测器等关键部件也在不断改进，提高了分离效果和检测灵敏度。
智能化与自动化：随着机器人技术和自动化控制技术的发展，液相色谱技术的操作将更加智能化和自动化。未来的液相色谱仪将更加便捷、高效，能够实现自动化进样、自动优化分离条件等功能，大大提高分析效率。
感谢观看
THANKS
流动相的准备与更换
根据实验要求，准备好适量的流动相，并定期更换以保证实验结果的准确性。
定期清洗进样器、色谱柱和检测器，保持仪器表面清洁。
日常保养
定期校准
常见故障排除
对仪器进行定期校准，确保检测结果的准确性。
遇到问题时，应先检查电源、管线连接等基本情况，再根据仪器手册排查故障。
03
02
01
液相色谱技术的实验设计
色谱柱
检测色谱柱流出的组分，并将其转化为电信号，便于记录和检测。
检测器
用于采集、处理、分析和存储色谱数据。
数据处理系统
数据处理与分析
采集色谱数据，进行峰识别、定量和合适的流速、检测波长等参数，开始色谱分离。
进样
将样品注入进样器，设定进样量，启动进样程序。
准备工作
检查仪器是否正常，准备好流动相、色谱柱和样品。
样品前处理的挑战：液相色谱技术对于样品的要求较高，需要进行适当的前处理以去除杂质、提高分离效果。目前常用的样品前处理方法包括沉淀、萃取、吸附等，但这些方法操作繁琐、耗时长且效果不稳定。为解决这一问题，新型的样品前处理技术如固相萃取、免疫吸附等正在不断发展，以提高样品处理的效率和效果。
色谱法概论PPT课件
能。
色谱法与其他技术的联用
色谱-质谱联用（GC-MS, LC-MS）
通过将色谱的分离能力与质谱的高灵敏度检测相结合，可实现对复杂样品中目标化合物 的定性和定量分析，广泛应用于药物代谢、环境监测等领域。
色谱-光谱联用（GC-IR, LC-UV/Vis）
色谱与光谱技术的联用可以提供更丰富的化合物结构和组成信息，有助于深入了解化合 物的性质和行为。
实验材料
确保色谱柱、试剂、溶 剂等材料的质量和纯度，
以满足实验要求。
实验设备
检查色谱仪、检测器、 注射器等设备的运行状 况，确保实验过程中设
备正常工作。
实验设计
根据实验目的和要求， 设计合理的色谱条件和
实验方案。
实验安全
注意实验过程中的安全 问题，如使用有毒有害
试剂时的防护措施。
实验操作步骤
色谱柱安装与条件设置
数据整理
整理实验过程中记录的数据，包括 色谱图、峰面积等。
结果分析
对实验结果进行深入分析，探究可 能的原因和影响因素。
03
02
结果判断
根据实验目的和要求，判断实验结 果是否符合预期。
结论总结
总结实验结果，得出结论，并提出 进一步改进和完善的建议。
04
04 色谱法在分析化学中的应 用
在食品分析中的应用
食品成分分析
色谱法用于分离和检测食品中的营养 成分，如脂肪、蛋白质、碳水化合物、 维生素和矿物质等，以确保食品质量 和安全。
食品添加剂分析
食品污染物分析
色谱法用于检测食品中的有害物质， 如农药残留、重金属、霉菌毒素等， 以防止食品污染和保障食品安全。
色谱法用于检测食品中添加的防腐剂、 色素、香料等成分，以控制食品添加 剂的使用量，保障消费者健康。
高效液相色谱HPLC流程示意图PPT课件
样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离）
论文内容
第8页/共16页
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
第9页/共16页
HPLC组成图
第10页/共16页
HPLC组成示例
第11页/共16页
高效液相色谱法的特点
▪ 高压：一般可以达到150~300kg/cm2 ▪ 高速：一般可以达到1~10mL/min ▪ 高效：一般可以达到60000理论塔板/米 ▪ 高灵敏度 ：微升数量级的就可以进行全分析
第12页/共16页
➢分类：液—液分配色谱
液—固分配色谱 离子交换色谱 排斥色谱
➢选择：样品的分子量范围
溶解度 分子结构
❖20世纪60年代后期 液相色谱法得到了快速
发展
论文内容
第2页/共16页
第3页/共16页
第4页/共16页
❖ 分配系数 K和分配比k K=(溶质在固定相中的浓度)/(溶质在流动相中的
浓度) =Cs / Cm
K为每一溶质的特征值，仅为固定相和温度有关， 与两相体积论文内容、柱管特性及仪器无关。 k=(组分在固定相中的质量)/(组分在流动相中的质 量)
论文内容
➢ 色谱分析方法发展概述 ➢ 分类 ➢ 基本原理
➢流出曲线及有关术语 ➢高效液相色谱简介
第1页/共16页
❖1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分 离了叶绿素）
❖20世纪四五十年代 出现了纸色谱（PC)和 薄层色谱法（TLC)
❖1952年 James和Martin提出了气相色谱法 （GC)
第13页/共16页
高效液相色谱的应用
高效液相色谱，特别适用于分离 沸点高和热稳定性差的物质，目前已 广泛应用于化工、食品、医药、生化、 卫生、环境保护和高能化合物等生产 和科研工作中。
论文内容
第8页/共16页
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
第9页/共16页
HPLC组成图
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HPLC组成示例
第11页/共16页
高效液相色谱法的特点
▪ 高压：一般可以达到150~300kg/cm2 ▪ 高速：一般可以达到1~10mL/min ▪ 高效：一般可以达到60000理论塔板/米 ▪ 高灵敏度 ：微升数量级的就可以进行全分析
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➢分类：液—液分配色谱
液—固分配色谱 离子交换色谱 排斥色谱
➢选择：样品的分子量范围
溶解度 分子结构
❖20世纪60年代后期 液相色谱法得到了快速
发展
论文内容
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❖ 分配系数 K和分配比k K=(溶质在固定相中的浓度)/(溶质在流动相中的
浓度) =Cs / Cm
K为每一溶质的特征值，仅为固定相和温度有关， 与两相体积论文内容、柱管特性及仪器无关。 k=(组分在固定相中的质量)/(组分在流动相中的质 量)
论文内容
➢ 色谱分析方法发展概述 ➢ 分类 ➢ 基本原理
➢流出曲线及有关术语 ➢高效液相色谱简介
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❖1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分 离了叶绿素）
❖20世纪四五十年代 出现了纸色谱（PC)和 薄层色谱法（TLC)
❖1952年 James和Martin提出了气相色谱法 （GC)
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高效液相色谱的应用
高效液相色谱，特别适用于分离 沸点高和热稳定性差的物质，目前已 广泛应用于化工、食品、医药、生化、 卫生、环境保护和高能化合物等生产 和科研工作中。
高效液相色谱法
1971年科克兰等人出版了《液相色 谱的现代实践》一书，标志着高效液相 色谱法 (HPLC)正式建立。在此后的时 间里，高效液相色谱成为最为常用的分 离和检测手段，在有机化学、生物化学、 医学、药物开发与检测、化工、食品科 学、环境监测、商检和法检等方面都有 广泛的应用。高效液相色谱同时还极大 的刺激了固定相材料、检测技术、数据 处理技术以及色谱理论的发展。
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色 谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中 同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。
高效液相色谱法基本原理
（1）正键合相色谱中，采用和反相液液分配色 谱相似的流动相，流动相的主体成分为己烷或庚 烷。 （2）反相键合相色谱中，流动相采用和反相液 液分配色谱相似的流动相，主题为水。 4.应用 （1）正键合相色谱法的应用：多用于分离各类 极性化合物如染料、炸药、多巴胺、氨基酸等； （2）反键合相色谱法的应用：由于操作简单， 稳定性和重复性好，该方法已成为一种通用型液 相色谱分析方法。在生物化学、医药研究、食品 分析和环境污染分析等多个领域有了很大的应用 和发展。
高效液相色谱 分析法
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一、概述
高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 简称(HPLC) 高效液相色谱法 又叫做高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱 或近代柱色谱,以液体为流动相，采用高压输液 系统，是色谱法的一个重要分支。 它是用高压 输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的 混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色 谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱 内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进 行检测，从而实现对试样的分析。这种方法已成 为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
2021/11/1
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
2021/11/1
（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
2021/11/1
2021/11/1
液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
2021/11/1
液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
2021/11/1
2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
2021/11/1
小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
2021/11/1
（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
2021/11/1
2021/11/1
液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
2021/11/1
液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
2021/11/1
2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
2021/11/1
小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
安捷伦高效液相色谱基本原理-理论
• 对于更小粒径的填 料，流速提高时分 离效率的损失更少
• 化合物和仪器特异 性
• 最佳流速取决于具 体化合物
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 28
5.0 m 3.5 m 1.8 m
峰容量
梯度分析
hf(w2 ) 折合理论塔板高度是峰宽的函数
安捷伦科技致力于为教育领域做出 贡献，并愿意提供这里所包含的为 公司所拥有之资料的访问权限。
本幻灯片集由安捷伦科技制作。幻灯片集的使用仅限于教 学目的。其中所包含的资料和信息被“原样”接受，安捷 伦对于资料不作任何形式的陈述或担保，并且对于您对资 料的使用或复制不承担责任。由于您使用、复制或传播这 些资料所引起或相关之损失，安捷伦不承担责任。您同意 赔偿并使安捷伦免于遭受由于您使用或复制这些资料所招 致的任何索赔。
h = f ( weddy + wax + wC ) • 涡流扩散
• 扩散系数
h = A + B/u + C u
• 传质阻力
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 26
折合理论塔板高度 (h)
Van Deemter 方程
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 18
影响分离的因素
同一种样品采用相同固定相、流动相及相同梯度，但采用不同柱温 进行分析。
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 19
• 化合物和仪器特异 性
• 最佳流速取决于具 体化合物
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 28
5.0 m 3.5 m 1.8 m
峰容量
梯度分析
hf(w2 ) 折合理论塔板高度是峰宽的函数
安捷伦科技致力于为教育领域做出 贡献，并愿意提供这里所包含的为 公司所拥有之资料的访问权限。
本幻灯片集由安捷伦科技制作。幻灯片集的使用仅限于教 学目的。其中所包含的资料和信息被“原样”接受，安捷 伦对于资料不作任何形式的陈述或担保，并且对于您对资 料的使用或复制不承担责任。由于您使用、复制或传播这 些资料所引起或相关之损失，安捷伦不承担责任。您同意 赔偿并使安捷伦免于遭受由于您使用或复制这些资料所招 致的任何索赔。
h = f ( weddy + wax + wC ) • 涡流扩散
• 扩散系数
h = A + B/u + C u
• 传质阻力
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 26
折合理论塔板高度 (h)
Van Deemter 方程
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 18
影响分离的因素
同一种样品采用相同固定相、流动相及相同梯度，但采用不同柱温 进行分析。
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 19
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；
高效液相色谱分析实验
高效液相色谱分析实验高效液相色谱分析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种高分辨率、高灵敏度的分析技术，被广泛用于判断物质的化学性质和分析化学成分。
在分析过程中，液相色谱柱起着关键作用，能够分离出分子混合物中的单个化合物。
本文将介绍高效液相色谱分析实验的基本步骤。
1. 样品的制备样品的制备是高效液相色谱分析实验中非常关键的一步。
首先，需要确定要测量的分析化学成分，并准备代表性样品。
在制备样品的过程中，可能需要对样品进行预处理、分离和纯化。
样品的进样是液相色谱分析实验中的核心步骤。
在进样前，需要对HPLC仪器进行调整，确保柱子、检测器、泵等零部件的状态良好。
主要有两种样品进样方式：手动进样和自动进样。
手动进样的优点是灵活性较高，自动进样则更加准确和可重复。
3. 色谱柱的选择和条件设置色谱柱用来分离化合物，并应该根据实验的需求进行选择。
通常情况下，更长的柱可以提高分离效果，但是也会影响分析时间。
色谱柱的条件设置涉及流速、温度、压力等多个参数的选择，这些参数应依据样品性质以及色谱柱的选择进行调整。
4. 分离和检测在液相色谱分析中，化合物混合物通过移动相分离，其中的各组分通过变化的吸附力被吸附在固定相上，因而产生分离效应。
这个过程会涉及多种检测器的应用，通常包括紫外线检查器、荧光检测器、电化学检测器等。
检测器能够检测到化合物分析中的各个部分，从而可以确定样品中各部分的浓度。
5. 结果的解读和分析最后，通过对分析数据的收集和整合，能够得出准确的分析结果。
这个过程中需要自己对数据进行解读和分析，并根据实验目标进行结果的总结和归纳。
这些解读和分析结果将被用于进一步改进实验和探索更加深入的实验方向。
总结综上所述，高效液相色谱分析实验是一种非常有用的分析工具。
在实验中，样品的制备、柱子的选择、样品的进样、良好的条件设置和准确的检测均需要严谨仔细。
高效液相色谱分析的结果可以为抗菌剂的研究、药物发现、环境污染的控制和食品检测等方面提供重要的参考。
高效液相色谱技术(HPLC)
溶质在固定相中的量 溶质在流动相中的量
ab
• “ k’ ”是比“ tR”还常用的保留值，它与柱子
的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动
相
的分
配
性
质、
柱
温 以 及 k ,＝ tR－t0 t0
相空
间
比
（
即
固
定相
和流动相之体企积比）有关。“ k’ ”又定义为
在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消
除了保留值的波动因素，而平衡常数“ K ”是
⑸选择性指标“α’ ”和相对保留值“α”
α’ 可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏：
α'＝ tR(2)
进样 tR(1)
tR(2)
tR (1)
相对保留值α(分离因子)：
α＝ t' R(2) ＝ k ' (2) ( α＞1.1为好 ) t' R(1) k ' (1)
• 2. 柱效率：
•
定义：
理论塔板数
• 键合相使用硅胶作基质的优点是：
①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和 表面积易人为控制；③化学稳定性好。
• 硅胶 ( SiO2•n H2O) ：
OH OH —Si—O—Si—
｜｜
• 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的 产物。
• 最常用的键合相键型是： ｜ ｜
—Si—O—Si—C
平衡时物质在两相中的浓度比。
• k’值的范围： 0.4＜k’＜20～30 k’＝2～5 为佳，过大则耗时太长。
⑷保留体积：VR＝tR•FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－VR0＝tR’ •FC
分析化学 高效液相色谱法
来自2 16tr
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下， B 0 u
修正的速率方程： H A Cu
柱径：0.9 cm
F：30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离：1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相) 传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
注意：
流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求：
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下， B 0 u
修正的速率方程： H A Cu
柱径：0.9 cm
F：30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离：1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相) 传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
注意：
流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求：
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
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b. 反相色谱 固定液为非极性 洗脱液为极性，如水（常用方法, 75%) C18柱（十八烷基化的SiO2填充柱）为标准色谱柱 应用：醇类、芳香族、蒽醌素、抗菌素、低聚物、甾族化合 物, 维生素等极性不太大的组分
2. 液固色谱(吸附色谱)
✓ 分离原理 固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同
§8.2 几种常见的液相色谱形式
1. 液液色谱（分配色谱）
1941年Martin发明: 用吸着在硅胶上的水作为 固定相，用氯仿为流动相
应用范围：最常用方法。 相对分子量小于3000，不带电的极性化合物
✓ 分离原理 固定液通过分子间的亲和力或化学键合力附着在粒度很
细的惰性载体表面上，被分离的组分溶解在流动相中，并按 其分配系数 K 在两相之间进行分配
3. 分离系统
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm， 柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微 粒固定相。柱温一般为室温或接近室温
匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米
来进行分离的 ✓ 固体相: 极性的硅胶，Al2O3, MgSiO3等
硅胶柱的柱效高，容量大，最常见 ✓ 流动相
“相似相用”: 如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易
被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强度参数 e 表征， e 越大，极性越
强 ✓ 应用
分离极性不同的化学物,同分异构体
不适用同系物的分离
3. 离之一，压力：150～350×105 Pa
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
2. 进样装置
流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置
第8章 高效液相色谱法 HPLC
High Performance Liquid Chromatography
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
§8.1 高效液相色谱仪
四大部分组成： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测记录系统（检测器，记录仪等）
折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）
因 n～f（T），故需精密恒温（±0.001℃） 灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱 用于无紫外吸收的化合物，如糖类
➢ 伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 ➢ 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 ➢ 电极表面易中毒
5. 梯度洗脱
1975年 H. Small 发明,现为发展最快的分支
✓ 分离原理: 离子交换树脂为固定相,试样中的离子与离子交换
树脂上的离子发生离子交换反应
平衡常数
K = ﹝-NR4+X-﹞﹝Cl-﹞/﹝-NR4+Cl-﹞﹝X-﹞
K越大,溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大
磺酸型阳离子交换树脂,阳离子的保留值大小:
✓ 流动相 H2O、H2O + 乙醇、H2O + pH 缓冲剂
✓ 应用 无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等
4. 尺寸排阻色谱法 size exclusion chromatography SEC
凝胶过滤色谱: 水为流动相 gel filtration chromatgraphy GFC
4. 检测器
✓ 要求:
灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,
对温度和流速的变化不敏感
✓ 两种类型
❖ 溶质型检测器：
仅对被分离组分的物理或理化性质响应
如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器
❖ 总体型检测器:
对试样和洗脱剂均有响应
如示差折光，介电常数检测器
UV检测器最常用，占70％ 池体积: 1～10μL 光程常: 2～10 mm 波 长: 254 nm 窗 口: 石英
一价阳离子：Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+ 二价阳离子：Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+>Mg2+
强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序:
PO43->SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CN->NO2->Cl>HCOO->OH->F->CH3COO-
缺点：麻烦 不能采用梯度洗脱技术
方法二: 化学键合固定相 将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面
正相与反相液液分配色谱 a. 正相色谱: 固定液为极性，洗脱液为非极性
常用于分离极性化合物，极性大的组分保留时间长，后出峰 固定液： 水、甘油、ß，ß’—氧化二丙腈（极性） 流动相： 己烷、苯、氯仿（非极性）
分配比 k 相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开
可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随 时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH， 以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析 时间的目的
梯度洗脱装置分为两类：
外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合， 用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压 后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱 系统。
梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合 样品中各组分的 k 值，使所有谱带都以最佳平均 k 值通过色谱 柱。
它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温： 通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值， 在GC中借程序调节温度改变k值。
K不同导致迁移速度不同，从而使不同组分得到分离
✓固定液的流失 样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因
而两相在某种程度上互溶 长时间使用将导致固定液流失，不利分离
✓ 防止固定液流失的方法
???
防止固定液流失的方法
方法一: 抑制柱
在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理 柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使 流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失
2. 液固色谱(吸附色谱)
✓ 分离原理 固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同
§8.2 几种常见的液相色谱形式
1. 液液色谱（分配色谱）
1941年Martin发明: 用吸着在硅胶上的水作为 固定相，用氯仿为流动相
应用范围：最常用方法。 相对分子量小于3000，不带电的极性化合物
✓ 分离原理 固定液通过分子间的亲和力或化学键合力附着在粒度很
细的惰性载体表面上，被分离的组分溶解在流动相中，并按 其分配系数 K 在两相之间进行分配
3. 分离系统
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm， 柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微 粒固定相。柱温一般为室温或接近室温
匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米
来进行分离的 ✓ 固体相: 极性的硅胶，Al2O3, MgSiO3等
硅胶柱的柱效高，容量大，最常见 ✓ 流动相
“相似相用”: 如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易
被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强度参数 e 表征， e 越大，极性越
强 ✓ 应用
分离极性不同的化学物,同分异构体
不适用同系物的分离
3. 离之一，压力：150～350×105 Pa
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
2. 进样装置
流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置
第8章 高效液相色谱法 HPLC
High Performance Liquid Chromatography
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
§8.1 高效液相色谱仪
四大部分组成： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测记录系统（检测器，记录仪等）
折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）
因 n～f（T），故需精密恒温（±0.001℃） 灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱 用于无紫外吸收的化合物，如糖类
➢ 伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 ➢ 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 ➢ 电极表面易中毒
5. 梯度洗脱
1975年 H. Small 发明,现为发展最快的分支
✓ 分离原理: 离子交换树脂为固定相,试样中的离子与离子交换
树脂上的离子发生离子交换反应
平衡常数
K = ﹝-NR4+X-﹞﹝Cl-﹞/﹝-NR4+Cl-﹞﹝X-﹞
K越大,溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大
磺酸型阳离子交换树脂,阳离子的保留值大小:
✓ 流动相 H2O、H2O + 乙醇、H2O + pH 缓冲剂
✓ 应用 无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等
4. 尺寸排阻色谱法 size exclusion chromatography SEC
凝胶过滤色谱: 水为流动相 gel filtration chromatgraphy GFC
4. 检测器
✓ 要求:
灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,
对温度和流速的变化不敏感
✓ 两种类型
❖ 溶质型检测器：
仅对被分离组分的物理或理化性质响应
如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器
❖ 总体型检测器:
对试样和洗脱剂均有响应
如示差折光，介电常数检测器
UV检测器最常用，占70％ 池体积: 1～10μL 光程常: 2～10 mm 波 长: 254 nm 窗 口: 石英
一价阳离子：Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+ 二价阳离子：Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+>Mg2+
强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序:
PO43->SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CN->NO2->Cl>HCOO->OH->F->CH3COO-
缺点：麻烦 不能采用梯度洗脱技术
方法二: 化学键合固定相 将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面
正相与反相液液分配色谱 a. 正相色谱: 固定液为极性，洗脱液为非极性
常用于分离极性化合物，极性大的组分保留时间长，后出峰 固定液： 水、甘油、ß，ß’—氧化二丙腈（极性） 流动相： 己烷、苯、氯仿（非极性）
分配比 k 相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开
可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随 时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH， 以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析 时间的目的
梯度洗脱装置分为两类：
外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合， 用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压 后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱 系统。
梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合 样品中各组分的 k 值，使所有谱带都以最佳平均 k 值通过色谱 柱。
它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温： 通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值， 在GC中借程序调节温度改变k值。
K不同导致迁移速度不同，从而使不同组分得到分离
✓固定液的流失 样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因
而两相在某种程度上互溶 长时间使用将导致固定液流失，不利分离
✓ 防止固定液流失的方法
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防止固定液流失的方法
方法一: 抑制柱
在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理 柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使 流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失