分析化学高效液相色谱HPLC.ppt
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一价阳离子：Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+ 二价阳离子：Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+>Mg2+
强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序:
PO43->SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CN->NO2->Cl>HCOO->OH->F->CH3COO-
b. 反相色谱 固定液为非极性 洗脱液为极性，如水（常用方法, 75%) C18柱（十八烷基化的SiO2填充柱）为标准色谱柱 应用：醇类、芳香族、蒽醌素、抗菌素、低聚物、甾族化合 物, 维生素等极性不太大的组分
2. 液固色谱(吸附色谱)
✓ 分离原理 固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同
分配比 k 相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开
可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随 时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH， 以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析 时间的目的
梯度洗脱装置分为两类：
外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合， 用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
§8.2 几种常见的液相色谱形式
1. 液液色谱（分配色谱）
1941年Martin发明: 用吸着在硅胶上的水作为 固定相，用氯仿为流动相
应用范围：最常用方法。 相对分子量小于3000，不带电的极性化合物
✓ 分离原理 固定液通过分子间的亲和力或化学键合力附着在粒度很
细的惰性载体表面上，被分离的组分溶解在流动相中，并按 其分配系数 K 在两相之间进行分配
折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）
因 n～f（T），故需精密恒温（±0.001℃） 灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱 用于无紫外吸收的化合物，如糖类
➢ 伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 ➢ 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 ➢ 电极表面易中毒
5. 梯度洗脱
1975年 H. Small 发明,现为发展最快的分支
✓ 分离原理: 离子交换树脂为固定相,试样中的离子与离子交换
树脂上的离子发生离子交换反应
平衡常数
K = ﹝-NR4+X-﹞﹝Cl-﹞/﹝-NR4+Cl-﹞﹝X-﹞
K越大,溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大
磺酸型阳离子交换树脂,阳离子的保留值大小:
✓ 流动相 H2O、H2O + 乙醇、H2O + pH 缓冲剂
✓ 应用 无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等
4. 尺寸排阻色谱法 size exclusion chromatography SEC
凝胶过滤色谱: 水为流动相 gel filtration chromatgraphy GFC
来进行分离的 ✓ 固体相: 极性的硅胶，Al2O3, MgSiO3等
硅胶柱的柱效高，容量大，最常见 ✓ 流动相
“相似相用”: 如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易
被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强度参数 e 表征， e 越大，极性越
强 ✓ 应用
分离极性不同的化学物,同分异构体
不适用同系物的分离
3. 离子交换色谱
1. 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
2. 进样装置
流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置
内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压 后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱 系统。
梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合 样品中各组分的 k 值，使所有谱带都以最佳平均 k 值通过色谱 柱。
它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温： 通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值， 在GC中借程序调节温度改变k值。
K不同导致迁移速度不同，从而使不同组分得到分离
✓固定液的流失 样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因
而两相在某种程度上互溶 长时间使用将导致固定液流失，不利分离
✓ 防止固定液流失的方法
???
防止固定液流失的方法
方法一: 抑制柱
在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理 柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使 流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失
第8章 高效液相色谱法 HPLC
High Performance Liquid Chromatography
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
§8.1 高效液相色谱仪
四大部分组成： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测记录系统（检测器，记录仪等）
缺点：麻烦 不能采用梯度洗脱技术
方法二: 化学键合固定相 将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面
正相与反相液液分配色谱 a. 正相色谱: 固定液为极性，洗脱液为非极性
常用于分离极性化合物，极性大的组分保留时间长，后出峰 固定液： 水、甘油、ß，ß’—氧化二丙腈（极性） 流动相： 己烷、苯、氯仿（非极性）
3. 分离系统wk.baidu.com
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm， 柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微 粒固定相。柱温一般为室温或接近室温
匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米
4. 检测器
✓ 要求:
灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,
对温度和流速的变化不敏感
✓ 两种类型
❖ 溶质型检测器：
仅对被分离组分的物理或理化性质响应
如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器
❖ 总体型检测器:
对试样和洗脱剂均有响应
如示差折光，介电常数检测器
UV检测器最常用，占70％ 池体积: 1～10μL 光程常: 2～10 mm 波 长: 254 nm 窗 口: 石英
强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序:
PO43->SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CN->NO2->Cl>HCOO->OH->F->CH3COO-
b. 反相色谱 固定液为非极性 洗脱液为极性，如水（常用方法, 75%) C18柱（十八烷基化的SiO2填充柱）为标准色谱柱 应用：醇类、芳香族、蒽醌素、抗菌素、低聚物、甾族化合 物, 维生素等极性不太大的组分
2. 液固色谱(吸附色谱)
✓ 分离原理 固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同
分配比 k 相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开
可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随 时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH， 以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析 时间的目的
梯度洗脱装置分为两类：
外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合， 用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
§8.2 几种常见的液相色谱形式
1. 液液色谱（分配色谱）
1941年Martin发明: 用吸着在硅胶上的水作为 固定相，用氯仿为流动相
应用范围：最常用方法。 相对分子量小于3000，不带电的极性化合物
✓ 分离原理 固定液通过分子间的亲和力或化学键合力附着在粒度很
细的惰性载体表面上，被分离的组分溶解在流动相中，并按 其分配系数 K 在两相之间进行分配
折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）
因 n～f（T），故需精密恒温（±0.001℃） 灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱 用于无紫外吸收的化合物，如糖类
➢ 伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 ➢ 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 ➢ 电极表面易中毒
5. 梯度洗脱
1975年 H. Small 发明,现为发展最快的分支
✓ 分离原理: 离子交换树脂为固定相,试样中的离子与离子交换
树脂上的离子发生离子交换反应
平衡常数
K = ﹝-NR4+X-﹞﹝Cl-﹞/﹝-NR4+Cl-﹞﹝X-﹞
K越大,溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大
磺酸型阳离子交换树脂,阳离子的保留值大小:
✓ 流动相 H2O、H2O + 乙醇、H2O + pH 缓冲剂
✓ 应用 无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等
4. 尺寸排阻色谱法 size exclusion chromatography SEC
凝胶过滤色谱: 水为流动相 gel filtration chromatgraphy GFC
来进行分离的 ✓ 固体相: 极性的硅胶，Al2O3, MgSiO3等
硅胶柱的柱效高，容量大，最常见 ✓ 流动相
“相似相用”: 如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易
被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强度参数 e 表征， e 越大，极性越
强 ✓ 应用
分离极性不同的化学物,同分异构体
不适用同系物的分离
3. 离子交换色谱
1. 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
2. 进样装置
流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置
内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压 后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱 系统。
梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合 样品中各组分的 k 值，使所有谱带都以最佳平均 k 值通过色谱 柱。
它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温： 通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值， 在GC中借程序调节温度改变k值。
K不同导致迁移速度不同，从而使不同组分得到分离
✓固定液的流失 样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因
而两相在某种程度上互溶 长时间使用将导致固定液流失，不利分离
✓ 防止固定液流失的方法
???
防止固定液流失的方法
方法一: 抑制柱
在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理 柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使 流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失
第8章 高效液相色谱法 HPLC
High Performance Liquid Chromatography
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
§8.1 高效液相色谱仪
四大部分组成： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测记录系统（检测器，记录仪等）
缺点：麻烦 不能采用梯度洗脱技术
方法二: 化学键合固定相 将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面
正相与反相液液分配色谱 a. 正相色谱: 固定液为极性，洗脱液为非极性
常用于分离极性化合物，极性大的组分保留时间长，后出峰 固定液： 水、甘油、ß，ß’—氧化二丙腈（极性） 流动相： 己烷、苯、氯仿（非极性）
3. 分离系统wk.baidu.com
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm， 柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微 粒固定相。柱温一般为室温或接近室温
匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米
4. 检测器
✓ 要求:
灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,
对温度和流速的变化不敏感
✓ 两种类型
❖ 溶质型检测器：
仅对被分离组分的物理或理化性质响应
如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器
❖ 总体型检测器:
对试样和洗脱剂均有响应
如示差折光，介电常数检测器
UV检测器最常用，占70％ 池体积: 1～10μL 光程常: 2～10 mm 波 长: 254 nm 窗 口: 石英