大肠杆菌甘油发酵代谢的定量分析
甘油微生物间歇发酵过程的参数辨识
二醇的参数辨识 问题．本文以斜率误差准则为 目标函数建立参数辨识优化模型 ； 然后利用 Ｂ样条法估计 实验数据的一阶导数 ； 最后采用遗传算法优化模型中的参数．
１ 动力学模 型
甘油微 生 物发 酵过 程 的物料 平衡 可 由下列方 程式 给 出 ， ：
ｄ ｘ １
＝
（ ， ｐ ）＝ （ ， ｐ ）
一
动 力学模 型进 行 了改进 ．在此 基础 上 ， 徐 恭 贤等 ¨ 研 究 了甘 油生 物 歧化 为 ｌ ， ３一丙 二 醇过 程 的 Ｈ∞
控制与优化控制．高群王等 研究了甘油生物歧化为 １ ， ３一 丙二醇过程的稳态优化．高群王等¨ 研究 了
一
类连续生物过程的双 目标优化． 王明美 基于三次样条插值算法研究 了甘油间歇生物歧化为 １ ， ３一 丙
第 ４期
谭雯心 ， 张 静 ， 宋一凡 ， 等： 甘油微生物间歇发酵过程的参数辨识
３ ０ ５
其中 ： 。 为生物量 ， ｇ ／ Ｌ ； ｘ 为反应器 中底物的浓度 ， ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ； ３ 、 ４ 、 分别为产物 １ ， ３ 一丙二醇、 乙酸、 乙醇 的浓度 ， ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ； ｔ 为发酵时间， ｈ ； ／ ｘ 为细胞比生长速率 ， ｈ ～； ｇ 哜 、 ｑ ｔ ４ Ａ ｃ ＂ ， ｑ 啪 分别为底物甘油 的比消耗速
０ 引 言
１ ， ３一丙二 醇是 一种 粘稠 液体 ， 易溶 于水 、 醇、 醚等 有 机 溶剂 ， 是 一 种 重要 的化 工原 料 ， 其 应 用前 景 广 阔， 近 年来 备受 国内外学 者 的重视 … ．曾安平 等 针 对 底物 和 产 物 建立 了动力 学模 型．修 志 龙等 对 这
第３ ７卷 第 ４期 ２ ０ １ ６年 ｌ ２月
大肠杆菌发酵中的代谢途径研究
大肠杆菌发酵中的代谢途径研究大肠杆菌是一种广泛存在于自然界中的细菌。
它既是人类肠道中的一种重要微生物，也可以在实验室中被广泛地应用于基因工程和蛋白质生产等方面。
在大肠杆菌的代谢过程中，发酵是一个重要的途径。
通过对大肠杆菌的发酵代谢途径进行深入研究，可以为相关领域的应用提供理论基础和技术支撑。
1. 大肠杆菌的代谢途径大肠杆菌的代谢途径可以分为有氧和无氧两种。
在有氧条件下，大肠杆菌利用氧气作为最终电子受体，通过呼吸链来产生能量。
而在无氧条件下，大肠杆菌则采用发酵代谢途径来产生能量。
在发酵代谢途径中，有些代谢产物可以被直接或间接地应用于生物合成、食品工业等领域。
2. 大肠杆菌的乳酸发酵乳酸发酵是一种无氧代谢途径，它是大肠杆菌中最主要的代谢途径之一。
在乳酸发酵中，大肠杆菌通过先将糖类分解成各种代谢产物，然后将这些代谢产物进一步分解产生乳酸。
这个过程产生两个ATP（三磷酸腺苷）分子作为能量，同时产生乳酸作为副产物。
乳酸是一种重要的化学品，它可以用于制备面包、酸奶、酸菜等食品。
3. 大肠杆菌的丙酮酸发酵丙酮酸发酵也是大肠杆菌中的一种发酵代谢途径。
在丙酮酸发酵中，糖类可以被分解为各种代谢产物，包括乳酸、酒精、丙酮酸等。
丙酮酸是一种可以进行酯化反应的化学品，它可以用于制备香料、高级聚合物等化学品。
此外，丙酮酸还可以被氧化成乙酸或芳香酸，这些化合物也广泛应用于精细化工领域。
4. 大肠杆菌代谢途径的调控机制大肠杆菌代谢途径的调控涉及到很多基因和酶的参与。
大肠杆菌有很强的调节机制，不同代谢途径之间的平衡可以通过这样的机制来实现。
在代谢途径中，先天性调控主要是通过调节一些代谢酶的量来实现。
而获得性调控则是通过信号分子的积累或降解来实现。
总之，大肠杆菌发酵代谢途径的研究对于相关领域的应用具有重要的理论和技术意义。
未来，我们还需要对代谢途径的调控机制、代谢产物的分离提纯等方面进行深入的研究，以实现更广泛、更深入的应用。
甘油的检测方法汇总
甘油的检测方法汇总在发酵行业中，甘油作为底物，是发酵液中生物合成的直接前体，会影响外源蛋白的启动表达效率，其含量的高低直接影响产物的发酵单位，是决定菌种取舍的重要指标，是提高工程菌的发酵密度，提高产品生产率的关键。
在生物柴油生产中，它是副产物，其含量直接影响生物柴油的使用性能，是衡量生物柴油产品品质的重要指标之一。
此外，甘油能与水结合以防止红细胞的冷冻损伤，能延长红细胞的保存期，被普遍用作细胞内冷冻保护剂等。
由于甘油用途很广，因此其含量的测定具有非常重要的意义。
目前国内外甘油含量的测定方法较多，主要有高碘酸氧化法、Cu2 +络合比色法、酶比色法法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、近红外光谱法以及原子吸收法等。
下面将对其进行简要概述：一、高碘酸法二、酶比色法1.原理：它是利用酶的特异性催化反应建立的测定甘油的一种酶学方法，是指甘油在甘油激酶作用下转化为3-磷酸甘油，后者由磷酸甘油氧化酶催化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，然后过氧化氢和4-氨基安普比林、4-氯酚在过氧化物酶催化下反应生成紫兰色、能在500 nm 左右有特征吸收峰的醌亚胺，通过颜色深浅即吸光度的变化测定所生成的H2O2，甘油的含量与生成的H2O2成正比，这样用比色法就可以测定甘油的含量。
2.操作步骤波长：500nm (480~520nm) 反映温度：37℃比色杯光径：1cm取一定量R1(参看R2瓶签)加入1瓶R2中，溶解后即为工作液，工作液预先保温至测试温度。
三、高效液相色谱法1.原理：高效液相色谱法( HPLC) 的原理是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，利用色谱柱对待测混合物先进行分离，然后再进行检测，从而实现对试样的分析，因而其测量的准确性和精确度较高，目前已成为检测生化分子较常用的一种方法。
2.操作步骤（1）首先用水将发酵液稀释2.5倍,然后加H3PO4调pH至5.5,在转速8000r/min、温度4℃下离心10min,经微孔滤膜过滤用于HPLC分析；（2）将甘油标准系列溶液在最佳色谱条件下进行HPLC分析,以峰面积外标法定量得到甘油标准曲线；（3）按照样品预处理方法处理后进样5微升,记录峰面积,代入线性方程中,计算其测定值。
最新大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
大肠杆菌群的代谢功能与生态系统作用研究
大肠杆菌群的代谢功能与生态系统作用研究大肠杆菌是常见的微生物之一，它们广泛分布在各种生态系统中，如水体、土壤和动物肠道中等。
许多研究表明，大肠杆菌在不同环境中发挥着重要的生态系统作用，其中最重要的是代谢功能。
在本文中，我们将探讨大肠杆菌群的代谢功能及其在生态系统中的作用。
代谢功能大肠杆菌是一种好氧菌，具有广泛的代谢功能，能够将各种底物转化为能量和生物物质。
在营养不足的条件下，大肠杆菌就会发生代谢途径的改变，以适应新的环境。
这些代谢途径包括：糖代谢途径、氨基酸代谢途径和脂质代谢途径等。
糖代谢途径大肠杆菌可以利用许多单糖和多糖来进行糖代谢，例如葡萄糖、半乳糖和乳糖等。
它们可以通过糖酵解和三羧酸循环来获得能量。
此外，大肠杆菌还可以通过发酵来代谢某些糖类，如乳酸、乙酸和丙酮酸等。
氨基酸代谢途径大肠杆菌可以通过氨基酸降解途径和氨基酸合成途径来代谢氨基酸。
大肠杆菌可以利用氨基酸来合成蛋白质、核酸和维生素等生物物质。
此外，在耐受极端条件的情况下，大肠杆菌可以利用氨基酸代替糖类来代谢。
脂质代谢途径大肠杆菌可以利用两种脂质来进行代谢：甘油三酯和磷脂。
甘油三酯是一种能量储备物质，而磷脂是构成生物膜的重要组成部分。
大肠杆菌可以将甘油三酯和磷脂合成为脂肪酸和甘油。
生态系统作用大肠杆菌在许多生态系统中都扮演着重要的角色。
在人类肠道中，大肠杆菌可帮助维持人体健康。
它们通过发酵未被消化的食物残渣，产生有益的代谢产物，如丁酸和丙酸等。
这些代谢产物可以促进肠道蠕动和维持肠道正常功能。
在水体和土壤中，大肠杆菌也发挥着重要的生态系统作用。
大肠杆菌可以利用水中和土壤中的有机物、氮和硫等元素来进行代谢。
在水体中，大肠杆菌被广泛应用于水质监测和废水处理等领域，因为大肠杆菌可以作为环境中微生物群落的代表性指标。
在土壤中，大肠杆菌可以通过生物降解来降解许多有害物质，如重金属和有机物等。
结语综上所述，大肠杆菌是一种多功能的微生物，具有广泛的代谢功能和生态系统作用。
酶法测定发酵液中甘油含量方法的研究
酶法测定发酵液中甘油含量方法的研究方法一：酒石酸酶法测定发酵液中甘油含量酶法是一种常用的测定甘油含量的方法，它通过酒石酸酶催化甘油生成对应产物，通过检测产物的数量来确定甘油的含量。
下面是一个用酒石酸酶法测定发酵液中甘油含量的步骤。
1.拟定标准曲线：首先准备一系列标准溶液，浓度范围覆盖待测样品的含量范围。
可以通过称取甘油精确配制出不同浓度的标准溶液，也可以购买商用标准溶液。
将每个标准溶液分别加入试管或反应瓶中。
2.加入酒石酸酶：将一定量的酒石酸酶溶液加入每个试管或反应瓶中，混匀后放置在适宜的环境中进行恒温反应。
3.反应终止：在一定的反应时间后，加入适当的反应终止剂，如盐酸、硫酸等，将反应停止。
4.添加试剂：为了产生显色反应，可以添加相应的试剂，如3,5-二硝基水杨酸、间苯二胺等。
5.测定吸光值：将反应溶液转移至比色皿或比色管中，用紫外-可见分光光度计测定吸光值。
根据标准溶液的吸光值绘制标准曲线。
6.测定待测样品：取一定量待测样品，重复上述步骤，得到吸光值。
7.计算甘油含量：根据待测样品吸光值在标准曲线上的位置，利用标准曲线的拟合方程计算出甘油的含量。
此方法的优点是测定条件简单，对样品无特殊要求，测定结果准确可靠。
但是，酒石酸酶法测定的甘油含量仅仅是通过酶催化来确定含量，不能直接测定甘油含量的绝对值。
方法二：酒精脱水法测定发酵液中甘油含量酒精脱水法是一种常用的测定发酵液中甘油含量的方法，它通过将发酵液与酒精进行混合，使甘油与酒精形成共沸体而被脱水，在测定前后甘油的脱水程度来确定其含量。
下面是一个用酒精脱水法测定发酵液中甘油含量的步骤。
1.选择合适的酒精：选择一种纯度较高的酒精，一般使用无水乙醇。
确保酒精的纯度可以满足脱水的要求。
2.预处理样品：将待测样品进行预处理，通常可以通过蒸馏或其他方法去除杂质。
3.混合样品和酒精：将一定量的待测样品和酒精按一定比例混合，如1:1、混合后，对混合液进行搅拌，使其充分接触。
大肠杆菌的代谢途径和基因调控机制
大肠杆菌的代谢途径和基因调控机制大肠杆菌是普遍存在于人类肠道内的一种常见细菌。
除了在肠道内发挥重要作用之外，大肠杆菌也是一种常用的实验室模式生物，被广泛应用于基因工程、发酵、药物开发等领域。
大肠杆菌的代谢途径和基因调控机制是研究该菌种的基础，本文将对其做一简要介绍。
一、代谢途径1. 糖类代谢大肠杆菌的糖分解路径很复杂，能够分解大多数一般存在于肠内的糖类，包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、棕榈糖、果糖、乳糖等等。
糖分解通常在核糖磷酸通路（PPP）或子戊糖磷酸路径中进行，其中每个途径的最后一步是生成丙酮酸和磷酸酸，以供三羟基丙酮酸（TCA）循环的酵素使用。
2. 氨基酸代谢氨基酸代谢是大肠杆菌的另一个重要代谢途径。
该菌种能够分解大多数氨基酸，包括丝氨酸、谷氨酸等。
不同氨基酸的代谢途径不同，这意味着在产生不同类型的氨基酸缺失时，该菌可以通过代谢不同的氨基酸来生存。
例如，在缺乏丝氨酸的情况下，该菌可以使用异亮氨酸通路来产生丝氨酸。
3. 脂肪代谢像其他微生物一样，大肠杆菌利用三酰甘油和磷脂等脂类进行细胞壁的生成。
这需要控制脂肪酸的合成和代谢，使其与其他新陈代谢途径相匹配。
脂质合成通常发生在细胞质中，并需要一系列酶催化，其中包括acp、cta等。
4. 细胞色素代谢大肠杆菌可以利用三呈花四烷胆固醇来合成胆固醇，这是菌种生长所必需的。
细胞色素的生成需要细胞内一系列复杂代谢途径的支持，其中包括膜蛋白合成、铁硫蛋白合成以及色素的合成等等。
二、基因调控机制1. 负反馈机制在大肠杆菌中，负反馈是一种常见的基因调控机制。
这种机制通常通过大肠杆菌中常表达的RNA聚合酶酶子来实现，通过抑制形成新的RNA分子来维持基因表达的恒定状态。
负反馈机制经常用于调节细胞中的代谢途径，从而保持稳定的代谢状态。
2. 激酶/磷酸酶信号传递激酶/磷酸酶信号传递机制是大肠杆菌中常见的细胞信号传递机制。
这种机制能够控制细胞中不同路径的功能表达和催化活性，从而使细胞对环境变化做出更快反应。
通过代谢组学技术研究大肠杆菌发酵代谢途径
通过代谢组学技术研究大肠杆菌发酵代谢途径在很多实验室里，大肠杆菌（Escherichia coli）是最常用的模式生物之一。
因为它具有很高的生长速度、相对简单的代谢途径和基因修饰便利性等特点。
然而，对于复杂代谢途径的研究和优化，传统方法已经无法满足研究需要。
因此，为更好的了解大肠杆菌代谢途径的变化及其对生存环境的响应，研究者采用了代谢组学技术。
代谢组学是研究生物化合物与功能的科学技术。
这一技术利用高通量仪器对生物组织和生化液体进行分析，关注基于特定代谢途径的几千个代谢产物。
代谢组学技术在大肠杆菌代谢途径的研究中得到了广泛应用。
研究代谢组学的关键，是利用先进的生物技术对生物的代谢产物进行系统、快速、准确的分析。
近年来，气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是居于代谢组学领域中最先进的技术之一，这一技术利用一系列化学试剂对样本进行预处理，并将分子结构从母离子到碎裂离子级别分离。
通过分析样品各成份比例变化，可以了解它们所代表的功能变化及其代谢途径的详细情况。
对于大肠杆菌代谢途径的研究来说，使用代谢组学技术可以使研究者更好地了解大肠杆菌的代谢通路，并精确地定位问题所在。
举个例子，研究者使用代谢组学技术分析大肠杆菌在同样生长条件下的代谢通路变化情况，找到了参生酸代谢通路中两个致病基因的变化。
这是具有关键意义的发现，为进一步研究大肠杆菌在惰性代谢状态下的调控机理提供了新思路。
除了在生物研究领域中实用性外，代谢组学技术在其他行业中也有广泛应用。
在医药领域，代谢组学技术可以用于药物代谢途径的研究，由此使药物疗效去除了毒副作用。
因此，代谢组学技术也逐渐成为生物科技领域的基础分析技术之一。
总之，代谢组学技术是一种揭示代谢途径的先进技术。
在大肠杆菌代谢途径的研究中，它具有着巨大的优势。
通过代谢组学技术，研究者可以更清晰地了解大肠杆菌代谢通路的变化，找到问题所在。
同时，由于代谢组学技术在生物科技领域中的广泛应用，对于其他行业也具有重要意义。
甘油发酵的代谢与调控
丙酮酸
乙醛
乙醇
乙酸
NADH+H+
a-磷酸甘油 NAD+
甘油
展望
• 关于HOG途径对细胞生理功能的影响极其作 用机制的探索是一个重要的研究方向。 • 通过定点突变或其他分子生物学方法研究N 端氨基酸残基的功能将进一步揭示GPD基因 的生理功能。 • 在借鉴酿酒酵母研究基础上，开展非酿酒 酵母，特别是工业应用酵母如产甘油假丝 酵母的CgGPD基因结构与特殊功能及其催化 机理之间的关系
• 某些调控因子能够对已经磷酸化的HOG1进 行去磷酸化，从而也会降低GPD基因的表达， 细胞的甘油合成能力随之下降，同时胞内 过量的甘油也通过甘油通道蛋白迅速输送 到胞外，从而控制胞内甘油水平。因此， 细胞通过HOG信号途径能够精确调控自身甘 油合成能力和积累水平。
• 实际上甘油发酵过程中，仍有一些乙醇生 成，因为亚硫酸氢钠不能加入太多，否则 会使酵母中毒而导致发酵终止。因此，未 被亚硫酸氢钠结合的部分乙醛还可以转化 为乙醇。同时，酵母进行第二类发酵未能 获得能量，必须依靠部分酒精发酵以获得 能量。
• 由于酿酒酵母细胞缺乏转运酶活力，胞质 中的NAD+/NADH无法穿过线粒体膜，所以 为了维持胞内氧化还原平衡，还原性辅酶 必须在相应的区室内重新氧化成NAD+。因 此当酵母细胞处于厌氧环境中时通过诱导 GPD2和GPP1表达由DHAP到G3P的生化反应 促使细胞合成甘油消耗NADH成为调节胞内 氧化还原平衡的最主要且最重要的方式之 一。
由于酿酒酵母细胞缺乏转运酶活力胞质中的nadnadh无法穿过线粒体膜所以为了维持胞内氧化还原平衡还原性辅酶必须在相应的区室内重新氧化成nad此当酵母细胞处于厌氧环境中时通过诱导gpd2和gpp1表达由dhap到g3p的生化反应促使细胞合成甘油消耗nadh成为调节胞内氧化还原平衡的最主要且最重要的方式之2atpnahso2adpco3磷酸甘油醛丙酮酸乙醛乙醛hso2atp2adpnad乙醇葡萄糖16二磷酸果糖磷酸二羟丙酮a磷酸甘油甘油当酵母细胞处于渗透压胁迫状态时gpd1和gpp2在短时间内诱导表达促使代谢流迅速转向甘油合成途径并大量在胞内积累以平衡外界渗透压从而保护细胞免受渗透脱水的损伤
大肠杆菌产脂肪酶代谢通量分析
大肠杆菌产脂肪酶代谢通量分析左正三;张柯;宋萍;黄宝琪;方心草;黄和【摘要】考察了5L发酵罐中大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的发酵特性,诱导2h后,脂肪酶比活达到最高值18.11 U/mg.建立了E.coli代谢合成脂肪酶的反应网络,并通过代谢通量分析发现,经诱导产酶后,乳酸代谢通量增加,碳流通过糖酵解途径(embden-meyerhof-parnas pathway,EMP)生成乳酸,分流了部分合成生物量的碳流,降低了生物量合成的速率;缬氨酸通量的增加满足了脂肪酶合成的需求;ATP通量的减少,限制了脂肪酶的高效合成.该研究为进一步指导提高生产脂肪酶菌种的发酵条件优化和代谢途径改造提供了理论依据.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)001【总页数】8页(P14-21)【关键词】大肠杆菌;代谢通量分析;脂肪酶;LipA【作者】左正三;张柯;宋萍;黄宝琪;方心草;黄和【作者单位】南京北盛荣能源科技有限公司,江苏南京,211178;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京,211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京,211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京,211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京,211816;南京工业大学药学院,江苏南京,211816【正文语种】中文脂肪酶(Lipase， EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一类特殊的酯键水解酶，作为生物催化剂具有底物专一性好，立体选择性强和反应条件温和，产品易分离等优点[1]。
因此，利用脂肪酶作为催化剂进行高选择性和高效地有机合成是当今合成化学的热点，更因为其对环境友好和节约能源等特点，被人们称为“绿色化学”而备受瞩目。
枯草杆菌(Bacillus subtilis)脂肪酶LipA为分泌性蛋白，具有高度专一的立体选择性，是迄今为止发现的分子量最小的脂肪酶之一，这些特点使枯草杆菌脂肪酶近年来受到关注。
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
大肠杆菌高密度发酵中乙酸代谢
个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都没有增长，可以看得出没有乙酸
消耗的现象出现，在没有发生改变的情况下。
文献总结
• 内容总结 • 在大肠杆菌发酵培养过程中，有氧和糖的消耗
以及二氧化碳的排放量暂时下降50%-80%的现象 发生，并伴有排泄物被利用的现象发生。 • 相对于营养物确定的培养基，在营养物富集的 培养基中，大肠杆菌会缓慢生长，并且会产生乙 酸。乙酸在培养基中的存在多方面影响细胞的生 理特性，浓度升高的乙酸溶液限制培养物的生长 速率，其对复杂培养基的影响比确定培养基大多 了，在分批补料培养中，乙酸的产生明显高于批 发酵所产生的，这是因为在延伸生长阶段大肠杆 菌使得乙酸达到最高浓度。
文献介绍
• 发酵过程概述
•
在葡萄糖体和乙酸都消耗的时期，大约在6.5小时，异柠檬酸盐裂
解酶的特殊活性大约增加了4倍，可以观察到最初的乙醛酸旁路途径。
转换之后，这种酶活性的增加与乙酸的消耗直接相关。
• PH6.5、糖功率2.0 g/L发酵简述
•
最初 5 h发酵，初期的生长率是0.985 h-1,与0.5 g/L葡萄糖发酵的
E：两者的大概生长曲线基本相似
PH6.5，糖浓度2.0g/L的培养曲线
三条培养曲线的对比分析
• 发酵过程中控制PH在 6.5，葡萄糖 的浓度被控制在 2.0 g/L时。最初 5 h发酵，初期的生长率是0.985 h-1,与0.5 g/L葡萄糖发酵的非常相似（图5）.在发酵6 h 前不久，当 乙酸浓度达到 7.2g/L时，葡萄糖消耗急剧的减少（ 10 分 钟减少40% ）与上面描述的0.5 g/L观察到的内容相似。 在发酵过程中控制葡萄糖浓度为2.0 g/L，当葡萄糖消耗下 降时，培养物并不消耗乙酸。在 40 分钟之后，培养基浓 度恢复，葡萄糖消耗的持续增加，乙酸产生的增加。在葡 萄糖消耗量减少的整个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都 没有增长，可以看得出没有乙酸消耗的现象出现 。此时， 乙酸没有消耗与PH7.0、PH6.5，补糖量0.5 g/L不同。
代谢工程大肠杆菌高效利用甘油合成丁二酸
代谢工程大肠杆菌高效利用甘油合成丁二酸李卓亚;王杰;田康明;董自星;金鹏;刘晓光;王正祥【摘要】为了构建高产丁二酸的重组大肠杆菌,以删除了乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因(ackA-pta)、乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的大肠杆菌CICIM B0013-025为出发菌株,将其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子替换为温度诱导的λ噬菌体启动子PC-PR,获得温度调控型的丁二酸合成菌株B0013-026.继而通过发酵条件优化,建立了两阶段发酵法:菌株的生长温度和诱导温度分别为37和42℃,以甘油为碳源并添加入5 g/L蛋白胨,发酵产酸阶段在微供氧(100 r/min)条件下进行.在5L发酵罐中采用最优条件进行发酵,丁二酸的产量、生产强度和甘油转化率分别为62.5g/L、1.04g/(L·h)和64.2％,而且发酵液中仅有少量的α-酮戊二酸(3.0g/L)和乙酸(1.8 g/L)等副产物积累,实现了以甘油为唯一碳源高效合成丁二酸,为其工业化生产提供了重要参考.%To construct a high-yield succinate producing strain,the recombinant strain Escherichia coli CICIMB0013-025 lacking genes ackA-pta,ldhA and pflB served as the starting strain.The promoter of phosphoenolpyruvate carboxylase in this bacterium was then replaced by the temperature-inducible promoter PL and PR of lambda phage,generating the thermoregulatory succinic acid-producing strain B0013-026.After optimization,a dual-phase fermentation process was established as follows:the temperature used for cell growth and induction was 37 ℃ and 42 ℃,respectively;succinic acid was produced under micro-aerobic condition,with glycerol and 5 g/L of tryptone as the sole carbon source and organic nitrogen,respectively.After cultured in a 5 L fermentor under optimal conditions,the succinate titer,overall productivityand conversion rate of glycerol reached 62.5 g/L,1.04 g/(L· h) and64.2％,with only small amounts of α-ketoglutaric acid (3.0 g/L) and acetate(1.8 g/L) accumulated.Therefore,using glycerol as the sole carbon source,we achieved the efficient production of succinic acid,providing an important reference for its industrial production.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】7页(P94-100)【关键词】丁二酸;大肠杆菌;温敏型启动子;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;两阶段发酵法【作者】李卓亚;王杰;田康明;董自星;金鹏;刘晓光;王正祥【作者单位】天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津300457;天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津300457;天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津300457;天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津300457;天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津300457【正文语种】中文【中图分类】TS201.1丁二酸,又称为琥珀酸(Succinic acid),是一种重要的“C4平台化合物”,在食品、化学、农业、医药以及其它领域有着广泛的应用[1-3]。
代谢工程大肠杆菌高效利用甘油合成丁二酸
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酶法测定发酵液中甘油含量方法的研究
酶法测定发酵液中甘油含量方法的研究
周泽林;王柱;王宪斌
【期刊名称】《食品与发酵科技》
【年(卷),期】2014(050)004
【摘要】微生物发酵转化生成甘油的过程中,发酵液成分复杂,传统检测方法受发酵液中杂质干扰大;酶法检测发酵液中甘油含量准确度高、精密度好、专一性强、简单快捷,可同时检测大批量样品并且分析仪器简单,价廉,特别适用于甘油菌种选育工作.本文建立的分析方法,甘油浓度显色线性范围0.1-0.9g/L,甘油含量检测平均相对偏差2.02％,RSD为3.11％小于5％,检测方法的线性范围、准确度、精密度满足甘油菌种选育工作的要求,甘油含量检测结果不受发酵液中杂质的影响,是一种理想的测定发酵液中甘油含量的方法.
【总页数】3页(P71-73)
【作者】周泽林;王柱;王宪斌
【作者单位】四川省食品发酵工业研究设计院,四川成都611130;四川省食品发酵工业研究设计院,四川成都611130;四川省微生物资源平台菌种保藏中心,四川成都611130;四川省食品发酵工业研究设计院,四川成都611130;四川省微生物资源平台菌种保藏中心,四川成都611130
【正文语种】中文
【中图分类】TS207.3;TQ920.6
【相关文献】
1.发酵液中透明质酸含量快速检测方法研究 [J], 陈永浩;王强
2.甘油发酵液中甘油含量的快速测定方法 [J], 诸葛斌;钱秀梅;方慧英;诸葛健
3.腺苷蛋氨酸发酵液中甲醇含量测定方法研究 [J], 张建勇;王水莲;郭雅妹
4.甘油果糖注射液中氯化钠含量检测方法的研究--滴定法与高效液相法的研究比较[J], 高婕;齐雷;曲荣广
5.发酵液中甘油和丁醇含量的近红外快速检测方法 [J], 赵昇; 王晓荣; 张进明
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大肠杆菌高密度发酵中乙酸代谢
文献介绍
• 发酵仪器（附图介绍）
实验培养曲线对比
PH7.0、6.5培养曲线对比分析
A：PH：PH7.0时，PH相对稳定，6小时后有一个上升过程，直到7.5小时 恢复正常。 PH6.5时，PH变化较大，6小时后上升，接近6.5小时下降、稳定，大 概在8.5小时，再次上升，30分钟后下降，直到10小时才稳定。
非常相似（图5）.在发酵6 h 前不久，当乙酸浓度达到 7.2g/L时，葡
萄糖消耗急剧的减少（ 10 分钟减少40% ）与上面描述的0.5 g/L观察
到的内容相似。在发酵过程中控制葡萄糖浓度为2.0 g/L，当葡萄糖消
耗下降时，培养物并不消耗乙酸。在 40 分钟之后，培养基浓度恢复，
葡萄糖消耗的持续增加，乙酸产生的增加。在葡萄糖消耗量减少的整
个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都没有增长，可以看得出没有乙酸
消耗的现象出现，在没有发生改变的情况下。
文献总结
• 内容总结 • 在大肠杆菌发酵培养过程中，有氧和糖的消耗
以及二氧化碳的排放量暂时下降50%-80%的现象 发生，并伴有排泄物被利用的现象发生。 • 相对于营养物确定的培养基，在营养物富集的 培养基中，大肠杆菌会缓慢生长，并且会产生乙 酸。乙酸在培养基中的存在多方面影响细胞的生 理特性，浓度升高的乙酸溶液限制培养物的生长 速率，其对复杂培养基的影响比确定培养基大多 了，在分批补料培养中，乙酸的产生明显高于批 发酵所产生的，这是因为在延伸生长阶段大肠杆 菌使得乙酸达到最高浓度。
文献介绍
• 试验内容 通过14L发酵罐进行大肠杆菌高密度培养，分别以PH
为7.5、7.0、6.5、6.0，葡萄糖浓度为0.5g/L进行培养。 PH6.0，葡萄糖浓度为2.0g/L进行培养。
离子排斥色谱法分析发酵液中甘油酸等代谢产物
离子排斥色谱法分析发酵液中甘油酸等代谢产物方亚坤;靳魁奇;刘宇鹏【摘要】A method using a refractive index detector to detect glyceric acid and other metabolites in the fermentation broth was described.Glyceric acid,glycerol and dihydroxyacetone were successfully separated by a sulfonated polystyrene divinyl benzene column (Aminex HPX-87H) with a refractive index detector.It is found that the optimal conditions were as follows:column temperature was 60 ℃,and 5 mmol/L sulfuric acid containing 20％ acetonitrile was used as mobile phase.These conditions were applied to the quantification.The linear range for glycericacid,glycerol and dihydroxyacetone were 0.2 ～ 1 g/L and the correlation coefficient of them were 0.999,0.992,and 0.994,respectively.Recoveries of glyceric acid,glycerol and dihydroxyacetone added to culture were (99.52 ± 1.30) ％,(97.61 ± 1.33) ％,and (98.52 ± 1.58) ％,respectively.The method was accurate,rapid and suitable for routine analysis.%建立了一个利用示差折光检测器检测发酵液中甘油酸等代谢产物的方法.利用磺化的苯乙烯-二乙烯共聚物作为固定相的Aminex HPX-87H离子色谱柱为分析柱,利用示差折光检测器对发酵液中的产物甘油酸、副产物二羟基丙酮和残余底物甘油进行了成功的分离检测.经过色谱条件优化后选择了柱温60℃,含有20％乙腈的5 mmol/L的H2SO4为流动相.实验室条件下分离检测效果良好.甘油酸、二羟基丙酮和甘油的浓度线性范围和相关系数分别为:甘油酸为0.2 ～l.0 g/L(R2=0.999);二羟基丙酮为0.2～1.0 g/L(R2=0.994);甘油为0.2～1.0g/L(R2=0.992),平均回收率分别为(99.52±1.30)％,(97.61±1.33)％,(98.52±1.58)％.该方法简便、灵敏、准确度高.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2015(041)007【总页数】4页(P171-174)【关键词】高效液相色谱;甘油酸;二羟基丙酮;示差折光检测器【作者】方亚坤;靳魁奇;刘宇鹏【作者单位】河南大学生命科学学院生物工程研究所,河南开封,475004;河南大学生命科学学院生物工程研究所,河南开封,475004;河南大学生命科学学院生物工程研究所,河南开封,475004【正文语种】中文甘油是一种多羟基化合物，为甘油三脂的骨架成分，是脂肪分解和生物柴油燃料生产(这一过程会产生约10%～14%左右的甘油)［1］过程中的一种副产品。
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小组成员：赵鑫、尹静、张文倩 王 冠一、徐 志博、杨晓娜、袁倩倩 、 贾斌 报告人—袁倩倩
2012-6-21
主要内容
一.研究背景 二.动力学理论和模型构建 三.模型模拟 四.实验验证
一、研究背景
甘油是生物柴油、油脂化合物、生物乙醇 等工业生产的副产物，因此它容易获得， 价格便宜，另外甘油具有较高的还原度。 基于以上优点，甘油成为具有吸引力的燃 料和化学品合成碳源。
表一中的质量平衡方程（包括胞外代谢物甘油、乙醇、 生物量和11种胞内代谢物）是14个常微分方程。 ——Matlab ode23t 。 主要步骤为： 1.在Matlab中编写函数名为model的m文件 2.在Command Window (命令窗口)中输入： X0=[11.07*1000/92,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0.1623]; [t X]= ode23t(@model,[0 360000],X0);
本研究用野生型E. coli MG1655过 表达两种酶
单独过表达两种酶时，对甘油代谢只有微弱的影响， 但是同时过表达两种酶时效率提高了2.4倍。
总结：
大肠杆菌中甘油发酵代谢的定量分析利用动力学 模型和代谢控制分析揭示了甘油脱氢酶（glyDH） 和二羟基丙酮激酶（DHAK）是控制甘油代谢酶。 过表达两种酶显著提高了甘油利用率和乙醇生成 率。
本文进一步证实了过表达glpF 、 tpiA 、pflB、 adhE对于甘油利用没有显著地改善。
这一研究可以改善代谢工程策略，从而提高乙醇 的产率。通过过表达这两种酶可以将甘油生产乙 醇的效率提高到20g/L,是理论最大产率的92%。
模拟了233个时间点：
弹性系数：
弹性系数：
代谢通量控制分析 通量控制连接定理： 通量控制加和定理：
环路的通量控制连接定理：
E1
X
A
Q
E3
E2
R
E4 P
B E5 Y
四.实验证实
基于以上模拟结果，过表达甘油脱 氢酶（glyDH）和二羟基丙酮激酶 （DHAK）应该能够显著地增加甘 油利用和乙醇合成的代谢通量。
本文通过构建动力学模型和利用MCA对 甘油在E.coli中的发酵代谢进行定量分析， 进而寻找基因操作的主要目标来提高产物 合成。
二.动力学理论和模型构建
代谢通量控制分析 通量控制系数： 弹性系数： 通量控制连接定理： 通量控制加和定理：
质量平衡方程
质量平衡方程：
反应动力学方程：
三.模型模拟