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荧光分光光度法.精选PPT
第八章荧光分光光度法
优选第八章荧光分光光度 法
§ 8- 1 概述
一、分，电子从基态跃迁到激发 态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分 子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析 法
较高激发态
吸收能
光辐射
量受激
退激
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激 返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激
2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的 能量以热的形式释放。包括：
内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换 S-S
系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换 S-T
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电
子自旋方向总是相反的 ，处于基态单重态。用 “S0”
表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强
振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级 的过程
外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光或磷光强度减弱或消灭
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部转换困难
VR
VR：振动驰豫
S2
IC：内部转换
IC
ISC：系间窜跃
VR 计算 I前/I后
T1
优选第八章荧光分光光度 法
§ 8- 1 概述
一、分，电子从基态跃迁到激发 态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分 子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析 法
较高激发态
吸收能
光辐射
量受激
退激
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激 返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激
2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的 能量以热的形式释放。包括：
内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换 S-S
系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换 S-T
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电
子自旋方向总是相反的 ，处于基态单重态。用 “S0”
表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强
振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级 的过程
外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光或磷光强度减弱或消灭
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部转换困难
VR
VR：振动驰豫
S2
IC：内部转换
IC
ISC：系间窜跃
VR 计算 I前/I后
T1
《分子荧光分析法》PPT课件
• 磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过 程所伴随的发光现象，发光过程的速率常 数小，激发寿命相比照较长。
16
复习： 荧光的产生
hv
基态分子
激发态
回到基态，如何回去？
17
分子的吸收情况 S2
T1 S1
S0
l2
l1
18
S2
S0 l2
振动弛豫：在同一电子能级〔激发态〕… T1
S1 特点：无辐射；速率快 〔10-14～10-12 s内完成〕
O Mg N
8-羟基喹啉镁
45
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸 盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没 有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反 式有强烈荧光，而顺式无荧光。
• 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
12
➢无辐射失活
a.振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的 较高振动能级转至较低振动能级的过程，其 效率较高
b.内转换：当两个电子能级非常接近以致其振 动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级 的过程。
13
➢无辐射失活
c.外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间 发生相互碰撞而失去能量的过程。
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
32
2. 刚性构造和共平面效应
-O
O -O
C COO-
O
O
C COO-
酚酞(无荧光)
荧光黄
N O-
16
复习： 荧光的产生
hv
基态分子
激发态
回到基态，如何回去？
17
分子的吸收情况 S2
T1 S1
S0
l2
l1
18
S2
S0 l2
振动弛豫：在同一电子能级〔激发态〕… T1
S1 特点：无辐射；速率快 〔10-14～10-12 s内完成〕
O Mg N
8-羟基喹啉镁
45
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸 盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没 有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反 式有强烈荧光，而顺式无荧光。
• 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
12
➢无辐射失活
a.振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的 较高振动能级转至较低振动能级的过程，其 效率较高
b.内转换：当两个电子能级非常接近以致其振 动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级 的过程。
13
➢无辐射失活
c.外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间 发生相互碰撞而失去能量的过程。
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
32
2. 刚性构造和共平面效应
-O
O -O
C COO-
O
O
C COO-
酚酞(无荧光)
荧光黄
N O-
第四章 分子荧光光度法
分子荧光的产生
激发态分子从较高的电子能级转换至较低的电子能级
受激分子从激发单重态转至能量
较低的激发三重态的过程称为系 间窜跃 溶液中分子之间通过碰撞，受激 溶质分子向溶剂分子转移过剩的 振动能量，通过非辐射跃迁而降 至同一电子能级的最低振动能级 处于激发三重态的分子继续通 过辐射光能而回到基态单重态 的各振动能级所发出的辐射
∴
F=2.303I0bc
I0一定，并且浓度c很小时，F=K·c
4.3 影响荧光强度的因素
激发光的照射 某些物质受光照后,所吸收的能量使分子内的一个或几
个键发生断裂使之分解，而引起荧光强度急剧降低。
例如：硫酸奎宁溶液的浓度在1 g/mL以上时，长时间经紫外 光照射，其F值没有显著变化；但如果溶液的浓度在0.02
电子在跃迁过程 中，不发生自旋 方向的变化， M=1
电子在跃迁过程 中伴随着自旋方 向的变化，分子 中具有两个自旋 不配对的电子， S=1,M=3
荧光磷光体系能级
荧 光 和 磷 光 体 系 能 级 图 激发
吸收一定频率的电磁辐射后电子 从基态发生能级跃迁至第一激发 单重态(S1)
去活化
辐射跃迁：荧光，或磷光的发射； 无辐射跃迁：包括振动弛豫、内转换、系 间窜越及外转换等过程
影响荧光强度的因素
溶液pH值
如果荧光物质本身为弱酸或弱碱时，由于分子和离子的电子
构型不同，溶液pH值的改变对溶液荧光强度有很大的影响。
例如：
pH值的变化一方面影响配合物的形成，另一方面也影响配合
物的组成，从而影响化合物荧光强度。
产生荧光。但在pH6∼7的溶液中则形成1:2配合物，不产生荧光。
第4章 分子荧光光度法
分子荧光基本原理
分子荧光光度法PPT21页
45、自己的饭量自己知道。——苏联
分子荧光光度法
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
分子荧光光度法
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
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分子荧光光度法
分子荧光光度法
第一节 概 述
一、光致发光
物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至 激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通 过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由 激发态重新回到基态。物质分子吸收外来光被激发后 所产生的发光现象，叫光致发光。
荧光 10-9~10-6s 实用 磷光 10-3~10s 不实用
二、荧光光度法
利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含 量的分析方法，称为荧光光度法，即荧光法。
优点：灵敏度高，10-7~10-9g/ml，比紫外分光光度法 灵敏度高10~1000倍。
第二节 基本原理
一、荧光的产生
基态 激发光 激发态 去激发 基态
（一）激发 处于基态的物质分子吸收光能时，其电子 对中的一个电子被激发到某一较高能级。
2、内转移 两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级 重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时 将能量以热的形式传递给溶剂分子。
意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单 重态（如S1、S2、S3……)，它都能通过内转移和振动 驰豫到达S1的最低振动能级上。
一般情况下，S1与S0之间很难发生内转移；T1与S0之 间发生内转移的几率要大些。
第三节 荧光光度计
原理图
荧光测量应在垂直激发光方向上 进行。
一、光源
特点：光强度大，适用范围宽。
常用：高压汞灯，氙灯，溴钨 灯，激光，脉冲激光
二、单色器 干涉滤光片，光栅
三、样品池 石英杯 四、检测器 光电倍增管
日立850型荧光分光光度计
第四节 定量分析方法
原理：一定条件下，荧光强度（If)与浓度(c)呈线性关系。
(4)取代基效应：斥电子基→ψf↑ 吸电子基 →ψf↓ 重原子→ψf↓
2、环境因素 (1)温度 温度↑→荧光效率↓ (2)溶剂 极性↑→ 荧光↑ (3)溶液pH值 影响荧光物质存在形式。因此要严格 控制溶液pH值。
(4)荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等） 3、荧光物质浓度
自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间 碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。
3、体系间跨越
电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为 体系间跨越。常见于含重原子(I、Br)的有机分子中。
4、外转移
激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热 的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的 外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失， 称“猝灭”或“熄灭”。磷光寿命长，发生外转移机 率大，所以室温下很难见到磷光。
If = Kc 定量分析的依据
方法：标准曲线法和标准对比法
第五节 分析条件的选择
线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除
一、线性范围的选择
荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性 关系。
二、选择激发波长和荧光波长
1、激发波长的选择 激发光谱： 将光源发射的激发光用单色器单色后照射物
质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定 相应的荧光强度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激 发光谱。
二、影响荧光的因素
荧光效率： 光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。
1、分子结构
(1)π→π*跃迁能产生较强荧光。——产生荧光的主要 跃迁类型
(2)含π-π共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大， 荧光效率越大。
(3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面 性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。
基态单重态 所有电子都自旋配对的分子电子态。
激发态 激发单重态 S1 S2 …… 激发三重态 T1 T2 ……
(二)去激发 指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐 射方式回到基态的过程。
辐射跃迁 荧光
去激发
磷光
振动驰豫
无辐射跃迁 内转移
（热的形式） 体系间跨越
外转移
1、振动驰豫
同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动 能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过 程称振动驰豫。
一般选择最大激发波长作为激发光波长。
2、荧光波长的选择 荧光光谱：用最大激发波长的激发光照射荧光物质
时，依次测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光 强度-荧光波长图谱，称为荧光光谱。
一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。
三、散射光干扰的排除
1、散射光 当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，
还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种 光称散射光。
瑞利散射光 波长与激发光波长一样
拉曼散射光 波长比激发光波长长
2、消除方法 （1）选择适宜的激发光波长
用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的 荧光峰位波长相同 ，但产生的拉曼散射光峰位各不相 同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生 的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。
5、荧光发射 电子由第一激发单重态S1（最低振动能级）跃迁至基
态S0而发射的光叫荧光。 6、磷光发射
电子由第一激发三重态T1跃迁至基态S0而发射的光叫 磷光。
跃迁方式 振动驰豫 内转移 荧光 磷光
时间 10-12 ~ 10-14 S 10-11 ~ 10-13 S 10-6 ~ 10-9 S 10-4 ~ 10 S
45、自己的饭量自己知道。——苏联
返回
1、2
返回
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
（2）选择合适的溶剂
拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼 散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光 波长远离荧光波长，而消除其干扰作用。
第六节 应 用
因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量 少等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环 境监测和卫生防疫等领域。
4 、 5 、 6
分子荧光光度法
第一节 概 述
一、光致发光
物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至 激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通 过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由 激发态重新回到基态。物质分子吸收外来光被激发后 所产生的发光现象，叫光致发光。
荧光 10-9~10-6s 实用 磷光 10-3~10s 不实用
二、荧光光度法
利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含 量的分析方法，称为荧光光度法，即荧光法。
优点：灵敏度高，10-7~10-9g/ml，比紫外分光光度法 灵敏度高10~1000倍。
第二节 基本原理
一、荧光的产生
基态 激发光 激发态 去激发 基态
（一）激发 处于基态的物质分子吸收光能时，其电子 对中的一个电子被激发到某一较高能级。
2、内转移 两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级 重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时 将能量以热的形式传递给溶剂分子。
意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单 重态（如S1、S2、S3……)，它都能通过内转移和振动 驰豫到达S1的最低振动能级上。
一般情况下，S1与S0之间很难发生内转移；T1与S0之 间发生内转移的几率要大些。
第三节 荧光光度计
原理图
荧光测量应在垂直激发光方向上 进行。
一、光源
特点：光强度大，适用范围宽。
常用：高压汞灯，氙灯，溴钨 灯，激光，脉冲激光
二、单色器 干涉滤光片，光栅
三、样品池 石英杯 四、检测器 光电倍增管
日立850型荧光分光光度计
第四节 定量分析方法
原理：一定条件下，荧光强度（If)与浓度(c)呈线性关系。
(4)取代基效应：斥电子基→ψf↑ 吸电子基 →ψf↓ 重原子→ψf↓
2、环境因素 (1)温度 温度↑→荧光效率↓ (2)溶剂 极性↑→ 荧光↑ (3)溶液pH值 影响荧光物质存在形式。因此要严格 控制溶液pH值。
(4)荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等） 3、荧光物质浓度
自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间 碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。
3、体系间跨越
电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为 体系间跨越。常见于含重原子(I、Br)的有机分子中。
4、外转移
激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热 的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的 外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失， 称“猝灭”或“熄灭”。磷光寿命长，发生外转移机 率大，所以室温下很难见到磷光。
If = Kc 定量分析的依据
方法：标准曲线法和标准对比法
第五节 分析条件的选择
线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除
一、线性范围的选择
荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性 关系。
二、选择激发波长和荧光波长
1、激发波长的选择 激发光谱： 将光源发射的激发光用单色器单色后照射物
质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定 相应的荧光强度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激 发光谱。
二、影响荧光的因素
荧光效率： 光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。
1、分子结构
(1)π→π*跃迁能产生较强荧光。——产生荧光的主要 跃迁类型
(2)含π-π共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大， 荧光效率越大。
(3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面 性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。
基态单重态 所有电子都自旋配对的分子电子态。
激发态 激发单重态 S1 S2 …… 激发三重态 T1 T2 ……
(二)去激发 指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐 射方式回到基态的过程。
辐射跃迁 荧光
去激发
磷光
振动驰豫
无辐射跃迁 内转移
（热的形式） 体系间跨越
外转移
1、振动驰豫
同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动 能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过 程称振动驰豫。
一般选择最大激发波长作为激发光波长。
2、荧光波长的选择 荧光光谱：用最大激发波长的激发光照射荧光物质
时，依次测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光 强度-荧光波长图谱，称为荧光光谱。
一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。
三、散射光干扰的排除
1、散射光 当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，
还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种 光称散射光。
瑞利散射光 波长与激发光波长一样
拉曼散射光 波长比激发光波长长
2、消除方法 （1）选择适宜的激发光波长
用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的 荧光峰位波长相同 ，但产生的拉曼散射光峰位各不相 同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生 的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。
5、荧光发射 电子由第一激发单重态S1（最低振动能级）跃迁至基
态S0而发射的光叫荧光。 6、磷光发射
电子由第一激发三重态T1跃迁至基态S0而发射的光叫 磷光。
跃迁方式 振动驰豫 内转移 荧光 磷光
时间 10-12 ~ 10-14 S 10-11 ~ 10-13 S 10-6 ~ 10-9 S 10-4 ~ 10 S
45、自己的饭量自己知道。——苏联
返回
1、2
返回
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
（2）选择合适的溶剂
拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼 散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光 波长远离荧光波长，而消除其干扰作用。
第六节 应 用
因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量 少等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环 境监测和卫生防疫等领域。
4 、 5 、 6