实验二 粗蛋白的测定
粗蛋白的检测
实验步骤⑴消化称取经粉碎通过（40－60）目式样（0.5－1）g(视含氮量而定)无损地置入已洗涤烘干的试管中加催化剂一片和10ml硫酸。
将消化管分别放入消化架各个孔内，然后置于消化炉上，然后开启抽吸泵水阀，使抽吸泵处于抽吸状态。
接通电源，在加热初始阶段，须注意观察，防止式样因急沸而飞溅。
（电压调至180V－200V温度不宜太高）。
消化反应过程主要如下：(蛋白质)R·C·H·NH2·COOH+H2SO4→CO2+SO2+NH3+H2O2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4⑵蒸馏分别用橡皮管与各进出水连接，出水口，排水口用橡胶管连接后置入水池中。
冷却水接口与自来水龙头连接，H2O、NaOH输入接口与橡胶管连接后分别置入蒸馏水、氢氧化钠盛器桶内，并关闭开关阀门。
打开电源开关，H2O开关，蒸馏水即自动进入发生炉内，达到一定液位高度，受液位控制器控制停止进水，进入电加热状态。
在250ml锥形瓶中加入2％的硼酸，50ml和（2－3）滴混合指示剂1，将该瓶套在接收管上，并让管口浸没在硼酸溶液液面以下。
取消化冷却后的消化试管置入适量的H2O后，扳动蒸馏消化管托盘架，使消化管固定在蒸馏器托盘架上，开启NaOH开关，注入50ml氢氧化钠溶液。
蒸馏器内冷却水经稳压器流入蒸汽发生炉内，炉内因水位上升使电极圈产生电流，炉内蒸馏水经（1－2）min加热后，水被煮沸产生的蒸汽进入消化管内，对以消煮的样品进行蒸馏，将消化过程中产生的硫酸铵转化成氨并与接收瓶里的硼酸溶液反应生成硼酸氢铵，待接收瓶液面高于150ml时，将接收瓶下移，使接收管离开液面，用蒸馏水冲洗出气口，取下接收瓶待滴定。
蒸馏过程的主要反应如下：（NH4）2SO4+2NaOH→Na2SO4+2NH4OH2NH4OH→2NH3+2H2ONH3+4H3BO3→NH4HB4O7+5H2O⑶滴定用0.1mol/l的标准盐酸溶液滴定吸收，溶液有蓝绿色变成紫红色为滴定终点。
(完整版)实验二粗蛋白的测定
实验二饲料粗蛋白的测定一、实验目的通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。
二、实验原理各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2 ↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。
消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。
其主要化学反应如下：1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸）2、（NH4）2SO4 +2NaOH→2NH 3+3H2O+2Na2SO43、4H3BO3+ NH 3→NH4HB4O7+5H2O4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。
在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质表示之。
三、实验设备1、实验室用样品粉碎机或研钵；2、分析筛：孔径0.45mm(40目)；3、分析天平：感量0.0001g；4、消煮炉或电炉；5、滴定管：酸式，25或50ml；6、凯式烧瓶：100或500m1；7、凯氏蔗馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；8、锥形瓶，150或250m1；9、容量瓶：100ml。
三、实验内容1、称取0.5～1g 试样（含氮量5～80mg ）准确至0.0002g ，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g ，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g ，与试样混合均匀，再加硫酸25ml 和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min 。
粗蛋白测定方法
粗蛋白测定方法一凯式定氮法粗蛋白crude protein ；crude matter (DM)食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物(氮化物)。
换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。
所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。
然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。
总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16% (这已通过多次试验得出)，再用凯氏法测出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。
一、实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。
这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50〜55%、氢6〜8%、氧20〜23%、氮15〜17% 和硫〜％。
此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15〜17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。
所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。
含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
由大分子分解成小分子的过程通常称为”肖化”为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290C-400C )，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。
反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3) 在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。
由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。
粗蛋白的测定方法原理及操作探讨
(8) 硫酸铵：分析纯，干燥；
(9) 硼酸吸收液。
3 仪器
• 实验用样品粉碎机或研钵；
• 40目（0.45 mm）分析筛；
• 分析天平； • 消化装置；
• 酸式滴定管；
• 凯氏定氮蒸馏装置。
4 操作步骤:
①磨样 ④消化 ②称样 ⑤蒸馏 ③加入催化剂和浓硫酸 ⑥滴定
4.1 磨样
确保样品均匀，颗粒细度（<1 mm）。
首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳 化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫 酸铵，这一过程称为有机物的消化。
消化：蛋白质 + H2SO4 →（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2↑+ H2O
•
1、消化 样品中的有机物和含N有机化合物，经浓H2SO4加热消化，H2SO4使有机物脱 水，炭化为碳；碳将H2SO4还原为SO2，而本身则变为CO2；SO2使N还原为NH3， 而本身则氧化为SO3，而消化过程中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在 反应中生成物CO2、H2O和SO2、SO3逸去，而NH3与H2SO4结合生成（NH4） 2SO4留在消化液中。 蛋白质+H2SO4 ——→ C C+H2SO4 ——→ SO2+CO2↑ SO2+[N] ——→ NH3+SO3↑ NH3+H2SO4 ——→（NH4）2SO4 2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑ ∣ NH2 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性， 使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫： 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成 硫酸铵留在酸性溶液：NH3+H2SO4——→（NH4）2SO4
粗蛋白的测定原理
粗蛋白的测定原理
粗蛋白的测定原理是基于蛋白质与某种试剂发生特定的化学反应而产生可测定的信号。
一种常用的测定方法是利用布拉德福法。
该方法利用染料结合蛋白质产生颜色变化的特性，通过比色反应来测定粗蛋白的含量。
具体操作步骤如下：
1. 准备一系列标准溶液，其中含有已知浓度的蛋白质。
2. 取一定体积的待测样品，加入定量的试剂。
常用的试剂是科氏试剂，它与蛋白质能够在一定条件下形成稳定的配合物。
3. 将混合溶液在适当的条件下孵育一段时间，使蛋白质与试剂充分反应。
孵育过程中，蛋白质与试剂发生结合并形成沉淀。
4. 用离心或者过滤的方法将溶液与沉淀分离，并采集沉淀物。
5. 加入某种试剂，使沉淀溶解或产生颜色变化。
这些试剂可以与蛋白质产生特定的反应，例如与杜仲酚蓝形成蓝色的复合物。
6. 通过分光光度计或者其他测定仪器，测定复合物的光吸收值。
7. 将待测样品的吸光值与已知标准溶液的吸光值进行比较，以确定蛋白质的浓度。
通过以上步骤，可以利用布拉德福法测定粗蛋白的含量。
需要注意的是，不同的试剂和条件可能对蛋白质的提取和测定结果产生影响，因此在进行测定时需要严格控制实验条件。
此外，布拉德福法对于某些特殊蛋白质的测定可能不够准确，需要配合其他方法进行确认。
粗蛋白的测定
成品料及原料中粗蛋白质的测定原料与成品中蛋白质的测定是饲料化验中特别重要的一项，目前国家标准中用于检测饲料中蛋白质的方法共有三种：1、凯氏定氮法；2、乙酰丙酮分光光度法；3、燃烧法。
其中凯氏定氮法在饲料的蛋白质的测定中应用最广泛。
下面主要介绍凯氏定氮法。
凯氏定氮方法简介：凯氏定氮法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，后来由Gunning加入改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍在使用。
凯氏定氮法所测得的含氮量为物质的总氮量，其中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等，因此由凯氏定氮法测得的蛋白质称为粗蛋白质。
原理：原料或成品与催化剂和硫酸一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
其反应方程式如下：蛋白质+ H2SO4 →（NH4）2SO4（NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4NH4OH →H2O + NH3 →NH4OHNH3+(标准) HCL→NH4CL试剂和材料：蒸馏水，硫酸铜，硫酸钾，硫酸，硼酸，甲基红指示剂（C15H15N3O2），溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S），氢氧化钠，95%乙醇（C2H5OH），硼酸溶液，40%氢氧化钠溶液，盐酸标准滴定溶液（0.1mol/L），消化炉，凯氏定氮仪。
步骤：1、消化，2、蒸馏，3、滴定，4、计算。
1．消化过程：称取充分混匀的固体试样0.2g精确至0.001 g，移入干燥的消化管中，加入3.2 g 催化剂及7mL 浓硫酸，放在消化炉上打开开关，整个消化过程需要2.5h。
在此过程中混合指示剂是硫酸钾与硫酸铜以15:1的质量比混合的，其中硫酸钾的作用是可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程；硫酸铜的作用是在蒸馏过程中与氢氧化钠反应指示其加入量；硫酸起到强氧化剂的作用，与蛋白质反应生成硫酸铵，与蛋白质中的有机物反应生成CO2，SO2，H2O。
粗蛋白测定
1.2.4 粗蛋白含量的测定—凯氏定氮法(1)原理样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮。
碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，结果乘以蛋白质换算系数6.25，即为粗蛋白质含量。
(2)仪器设备研钵、分析天平(感量为0.0001g)、消煮炉、半自动定氮蒸馏装置、酸式滴定管、锥形瓶(容积150ml）、量筒(量程10mL）、移液管(10mL）(3)试剂配制10mol·L-1NaOH溶液：NaOH420g+1L H2O；甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；20g·L-1 H2BO3指示剂：20g H2BO3(化学纯）溶于1L水中；混合加速剂：K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100g K2SO4(化学纯）、10g CuSO4 ·5H2O(化学纯）、和1gSe粉混合研磨，充分混匀(注意戴口罩），贮于具塞瓶中；0.01mol·L-1(1/2 H2SO4）标准液：量取H2SO4(化学纯、无氮、ρ=1.84g·mL-1）0.3mL，加水稀释至1000mL。
(4)操作步骤样品消煮：将样品0.4g置于干燥的消煮管底部，加3g混合加速剂和浓硫酸10mL，消煮30分钟左右。
同时，做一份空白测定，除不加样品外，其他操作皆与测定样品相同。
蒸馏：消煮管内10 mol·L-1NaOH溶液10mL于半自动定氮仪上蒸馏。
用装有30mL 20g·L-1 H2BO3－指示剂的锥形瓶收集蒸馏液，自溶液变为蓝色计时4min 后停止蒸馏。
滴定：用0.01 mol·L-1(1/2 H2SO4）标准液滴定馏出液，馏出液由蓝色至刚变为红色，记录所用酸标准溶液的体积(mL）。
计算：式中:X-样品中粗蛋白质的含量，%V1-样品消耗盐酸标准溶液的体积，mLV2-试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，mLN-盐酸标准溶液的当量浓度0.014-1N盐酸标准溶液Im L相当于氮的克数m-样品的质量(或体积)，g(或mL)F-蛋白质换算系数，6.25。
粗蛋白测定方法
粗蛋白测定方法—凯式定氮法粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。
换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。
所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。
然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。
总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以6.25就可求得粗蛋白的含量。
一、实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。
这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。
此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。
所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。
含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。
为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。
反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。
由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。
粗蛋白测定方法
粗蛋白测定方法粗蛋白测定方法什么是粗蛋白，粗蛋白跟蛋白质又有什么区别，如何测量饲料中粗蛋白的含量，粗蛋白的含量高是不是一定代表着蛋白质的含量高。
我想，当你看到这个题目时，肯定会联想到这一连串的问题中的其中几个。
那么接下来，我就来详细介绍下粗蛋白的概念、粗蛋白测量和其他关于饲料中粗蛋白含量的问题。
粗蛋白概念：粗蛋白不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质。
包括真蛋白质和含氮物(氨化物)。
食物中粗蛋白含量以大豆最高,肉类次之。
粗蛋白英文为crude protein。
粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
由于一般蛋白质中含氮量约为16%，故在概略分析中，常用凯氏(Kjeldahl)法测出总氮量，再乘以系数6.25来求得。
实际上，它是食品、饲料中含氮化合物的总称，既包括真蛋白又包括非蛋白含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、嘌呤、吡啶、尿素、硝酸盐和氨等。
此外，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同，如小麦和多数谷物的换算系数为5.80，水稻5.95，大豆5.7，多数食用豆和坚果5.3，牛奶6.38等。
粗蛋白只是一个粗略的概念。
粗蛋白含量：下面我介绍几种常见物质的粗蛋白含量，仅供大家参考。
薏苡仁粗蛋白含量：13%-14%棉粕粗蛋白含量：可达40%以上农大白早糯玉米粗蛋白含量：3.41%蠡玉168 粗蛋白含量：9.63％台湾大青枣粗蛋白含量：0.86%上文介绍了几种农产品或水果的粗蛋白含量情况，如果需要更多的资料，大家可自己查阅。
粗蛋白测定：方法一：最简便也是最快键的方法，就是用蛋白质测定仪来测量。
本标准参照采用ISO 5983—1979 《动物饲料──氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。
1 主题内容与适用范围本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。
2 引用标准GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备3 原理凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。
饲料中粗蛋白测定
• 9 标准滴定溶液的浓度小于或等于0.02mol/L时(除0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠、 氯化锌标准滴定溶液外),应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释 (不含非水溶剂的标准滴定溶液),必要时重新标定。当需用本标准规定浓度以外的标 准滴定溶液时,可参考本标准中相应标准滴定溶液的制备方法进行配制和标定。 • 10 贮存: • a) 除另有规定外,标准滴定溶液在10℃~30 ℃下,密封保存时间一般不超过6个月;碘 标准滴定溶液、亚硝酸钠标准滴定溶液[c(NaNO2)=0.1mol/L]密封保存时间为4个 月;高氯酸标准滴定溶液、氢氧化钾-乙醇标准滴定溶液、硫酸铁(Ⅲ)铵标准滴定溶液 密封保存时间为2个月。超过保存时间的标准滴定溶液进行复标定后可以继续使用。 • b) 标准滴定溶液在10℃~30℃下,开封使用过的标准滴定溶液保存时间一般不超过2 个月(倾出溶液后立即盖紧);碘标准滴定溶液、氢氧化钾-乙醇标准滴定溶液一般不超 过1个月;亚硝酸钠标准滴定溶液[c(NaNO2)=0.1mol/L]一般不超过15d;高氯酸标准 滴定溶液开封后当天使用。
• NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3
仪器设备：
• 分析天平：感量0.0001g
• 消煮炉或电炉
• 酸式或通用滴定管：25mL，50mL
• 消化管或者凯氏烧瓶：250mL
• 开始蒸馏装置：常量直接蒸馏或半微量蒸馏式 • 三角瓶：150mL，250mL • 容量瓶：100mL • 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动和全自动蛋白质测 定仪。
测定原理：
• ① 样品消化 • ② 氮的蒸馏
浓硫酸的脱水 性与强氧化性
• 2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
粗蛋白分析
打 印 系 统
蒸 馏 管
比 色 滴 定 系 统
四、结果计算
14 6.25 1000
(V V0 ) C 1 粗蛋白%
V——
2
H 2 SO4
W
100
样品所耗标准酸体积(ml)
V0——空白所耗标准酸体积(ml)
**
样品处理注意事项
4.浓H2SO4的用量主要取决于称样的干物质的重量。 小于1g的干物质至少加3~8ml H2SO4，每增加1g干物 质需增加6~12ml H2SO4。
5.如果条件允许的话，样品加酸以后浸泡2小时或者
过夜更好。
三、测定步骤
2. 消解
将上述样品置红外消解炉 上200℃ 30分钟，直到样 品中没有大的结块，400℃ 30分钟，消解后溶液呈清 亮的蓝绿色 * 消煮的温度不能超过410℃，否则将剂。
**
样品处理注意事项
1.称样一定要精确，样品一定要均一，因为此方法用的是 半微量凯氏定氮法，样品用量较少。 2. 为防止样品粘在管壁上，应采用称量纸包样，直接将 投入消煮管底部，做空白时，带上称量纸，抵消其影响。
2.称样量大小决定于各类样品的含氮量。如健壮茎叶干样 含 氮 约 1~5% ， 称 样 应 为 0.2g ， 老 熟 秸 秆 干 样 含 氮 约 0.4~0.6%，称样量为0.5g，种子干样含氮约1~4%，称样 量应为0.2~0.5g，新鲜的茎叶样品可按干样称量的5倍称取。
蛋白质的常用定量法
物理法(折射率法、比浊法、放射性同位素法) 蛋 白 质 定 量 法
利用共性
凯氏法 双缩脲法 Lowry法 比 色 法
利用特定 氨基酸残基 紫外法 色素结合法
粗蛋白测定步骤讲解
注意事项
Hale Waihona Puke 1、样品称样量应根据其粗蛋白的含量适当调整，含 氮量高的称少量，含氮量低的称多点； 2、6.25为氮换成粗蛋白含量的平均系数，对郁闷蛋 白粉等原料值得商榷 。
空白测定和蒸馏步骤的检验
空白测定：称取蔗糖0.5g，代替试样，进行消煮、 蒸馏和滴定。 蒸馏步骤的检验：精确称取0.1-0.2g硫酸铵，代替试 样，进行消煮、蒸馏和滴定，测得硫酸铵含氮量为 21.19±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是 否正确。
重复性
每个试样的平行样进行测定，以其算术平均什为结 果。 当粗蛋白质在25%以上时，允许相对偏差为1%； 当粗蛋白质在10%~25%之间时，允许相对偏差为2%； 当粗蛋白质在10%以下时，允许相对偏差为3%。
粗蛋白测定
步骤解析
原理：
凯氏法测定试样中的含N量，即在催化剂作用下，用 H2SO4破坏有机物，使含N物转化成（NH4）2SO4， 加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用 酸滴定，测出N含量，将结果乘以换算系数6.25，计 算出CP含量。
使用的试剂和仪器
试剂：H2SO4：浓 混合催化剂：硫酸铜：硫酸钾=1:15 NaOH：40% 混合指示剂：0.1%甲基红和0.5%溴甲酚绿1:1混合(无水乙醇为 介质) HCl标准液：0.1mol/L 蔗糖 硫酸铵 硼酸吸 收液：2% 仪器：粉碎机、电子分析天平、消化炉、酸式（25ml）滴定管、 凯氏定氮仪、锥形瓶（250ml）、消化管
试样消煮
称取试样0.3g，准确至±0.0002g，放入盛有6.4g混 合催化剂的消化管中与试样混合均匀，再加入12ml H2SO4将消化管置于消化炉上加热，将温度调至 200℃消化半小时，然后设为420℃继续消化2h。
粗蛋白的测定方法
粗蛋白的测定方法
粗蛋白的测定可以使用以下几种方法：
1. Kjeldahl法：将样品中的蛋白质分解为氨基酸，然后用酸溶液将氨基酸转化为氨，再用碱滴定氨生成的酸，通过计算氨的含量来测定粗蛋白含量。
2. 比色法：利用蛋白质与某些特定试剂反应产生色素，通过测量产生的色素的吸光度来测定粗蛋白含量。
常用的试剂有布鲁斯试剂、费氏试剂等。
3. 紫外吸收法：通过测量蛋白质在特定波长下的紫外吸光度来测定粗蛋白含量。
蛋白质在280 nm处有吸光峰，可以利用这个波长进行测定。
4. 生物传感器法：利用特殊的生物传感器，如免疫传感器或酶传感器，通过与蛋白质特异性结合或酶催化反应来测定粗蛋白含量。
这种方法具有高灵敏度和高选择性。
需要注意的是，不同的测定方法适用于不同类型的样品和需要测定的蛋白质组分，选择合适的方法根据实际情况进行。
粗蛋白含量的测定
c-----盐酸标准溶液浓度，mol/L；
m------试样的质量，g；
V------试样分解液总体积，mL；
V′---试样分解液蒸馏用体积，mL；
0.0140-----与1.00mL盐酸标准溶液「c（HCl）＝1.000mol/L」相当的以克表示的氮的质量。
油脂的检验与分析
粗蛋白质的测定（凯氏半微量定氮法）
测定原理凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解，其中氮元素变成铵盐。再经浓碱液作用，放出的氨气经硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收的氨。计算出试样含氮量，乘以相关的蛋白质换算系数，即得打蛋白质的含量。
消化：蛋白质与浓硫酸混合加热，蛋白质被炭化分解，其中碳被氧化成二氧化碳，所含的氮则转变成硫酸铵残留于消化液中。
蒸馏。凯氏微量蒸馏装置它是由蒸汽发生器、反应瓶、及冷凝管等组成，在大烧瓶8（容量1000mL）中加入蒸馏水400mL和少量碎玻璃片，加5滴混合指示剂，加几滴酸液，使水呈紫红色，盖紧瓶塞，连接4、1、2并检查有无漏气。量取30mL2％硼酸溶液，注入（100mL）三角瓶3内，作为承接器，加混合指示剂1～2滴（溶液呈紫红色），置于冷凝管2下面，使管尖端插入硼酸溶液1cm深处。用5mL移液管吸取5mL（V）试样稀释液，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再倒入蒸馏水10mL冲洗漏斗5。接着量取40g/100mL氢氧化钠溶液10mL，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再用2～5mL水冲洗漏斗5，旋紧活塞，此时蒸馏瓶1内溶液总体积应不超过容积的一半。
由于各种蛋白质的含氮量通常为16％左右，将含氮量乘以蛋白质系数，即为粗蛋白质含量。
试剂浓硫酸—过氧化氢—水混合液（2＋3＋1）。在100mL水中缓慢加入浓硫酸200mL，冷却后Байду номын сангаас入30％过氧化氢300mL，混匀备用，此液存放阴凉处可保存一个月。混合催化剂。10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）、100g硫酸钾、0.2g硒粉，在研钵中研细，通过孔径0.45mm筛，混匀后备用。40g/100mL氢氧化钠溶液、2％硼酸溶液、0.01mol/L盐酸溶液。甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红置于研钵中，加入少许95％乙醇，研磨溶解后加入75mL95％乙醇。次甲基蓝乙醇溶液：0.1g次甲基蓝溶于80mL95％乙醇中，临用时将以上两液按2：1比例混合即成。在酸域呈紫红色，PH＝5.5时无色，在碱域呈绿色。
粗蛋白的测定 凯氏定氮法
蛋白质含量测定（凯氏定氮法）1 原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂及其配制硫酸钾（分析纯）、五水硫酸铜（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、40%NaoH溶液（400g/L）、蒸馏水0.1N盐酸标准溶液：量取9mL盐酸加适量水稀释至1000mL。
4%硼酸：取40g硼酸加水适量溶解后，定容至1000mL容量瓶中。
指示剂:甲基红0.1g，溴甲酚绿0.1g，混合定容至100ml 95%乙醇中，在滴定中加2~3滴于硼酸中。
3 仪器消化炉、半自动凯氏定氮仪、天平（0.1mg、0.1g）4 分析步骤4.1 称1g(精确至0.1mmg)左右样品于消化管中；4.2 加7g硫酸钾和0.8g五水硫酸铜；4.3 加12mL浓硫酸，慢慢地摇动，将样品用酸浸湿；4.4 将涤气装置接在支架中的消化管上，将水抽气泵水龙头全开；4.5 将装有涤气装置的消化管连支架放入消化器中；4.6 5min后调小抽气泵水流，使酸恰好吸入涤气罩头；4.7 继续消化直至全部样品变为透明的蓝绿色澄清液体，根据样品种类，消化时间大约在30～60min之间（将温度升到420℃时开始计时）；4.8消化完毕，将装有涤气装置的消化管连支架一起从消化器中取出冷却15-20min；4.9 在每个消化管中加入25mL蒸馏水；4.10 将30mL接受液加入锥形瓶再加2滴甲基红-溴酚绿指示剂，放入蒸馏器升起持瓶台后，使馏出液出口浸入接受液；4.11 将消化管放入蒸馏器，关上安全门；4.12 加60mL 40% NaoH加入消化管后进行蒸馏；4.13 接受瓶中的溶液呈绿色，表示有碱-氨存在。
4.14用标准盐酸溶液滴定馏出液至蓝/灰色为滴定终点，记录盐酸溶液用量，同时做试剂空白试验。
除不加样品外，从消化开始操作完全相同，记录空白试验消耗盐酸标准溶液的体积。
粗蛋白测定
粗蛋白测定：
原理：饲草中的有机物质在催化剂的帮助下，用浓硫酸进行硝化作用，使蛋白质和氨态氮都转变成氨，并被浓硫酸吸收变为硫酸铵；而非含氮物质，则以二氧化碳、水、二氧化硫的气体状态逸出。
消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的氨，随汽水顺着冷凝管流入硼酸吸收液中，并与其结合成硼酸铵，然后以甲基红-溴甲酚绿作混合指示剂，用盐酸标准滴定溶液滴定，求出氮的含量，再乘以一定的换算系数，即得出试样中粗蛋白质的含量。
方法：
（1）试样的消化：称取0.5~1 g试样，无损地放入消化管中，加入硫酸铜0.4g，无水硫酸钾（或硫酸钠）6 g，与试样混合均匀，再加浓硫
酸10 mL。
于420℃下在消煮炉上消化1 h。
取出放凉后加入30 mL
水。
（2）氨的蒸馏：采用全自动定氮分析仪，按仪器本身测量程序进行测定。
（3）滴定：用0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液滴定，溶液有蓝绿色变为灰红色为终点。
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实验二饲料粗蛋白的测定
一、实验目的
通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。
二、实验原理
各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2 ↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。
消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。
其主要化学反应如下：
1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸）
2、（NH4）2SO4 +2NaOH→2NH 3+3H2O+2Na2SO4
3、4H3BO3+ NH 3→NH4HB4O7+5H2O
4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3
本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。
在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质表示之。
三、实验设备
1、实验室用样品粉碎机或研钵；
2、分析筛：孔径0.45mm(40目)；
3、分析天平：感量0.0001g；
4、消煮炉或电炉；
5、滴定管：酸式，25或50ml；
6、凯式烧瓶：100或500m1；
7、凯氏蔗馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；
8、锥形瓶，150或250m1；
9、容量瓶：100ml。
三、实验内容
1、称取0.5～1g 试样（含氮量5～80mg ）准确至0.0002g ，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g ，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g ，与试样混合均匀，再加硫酸25ml 和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min 。
2、氨的蒸馏
（1）常量直接茂馏法 将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml ，摇匀，冷却。
沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100ml ，立即与蒸馏装置相连．蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml 硼酸吸收液lcm 。
加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml 。
先将吸收液取下，再停止加热。
（2）半微量水蒸汽蒸馏法 上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml 容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。
取2％硼酸溶液20ml ，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。
准确移取试样分解液10～20ml 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min ，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
3、滴定 用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L 的HCI 标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。
在测定饲料样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L 盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。
4、空白测定 称取蔗糖0.0lg ，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L 盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml 。
5、计算
每m1的lmol/L 盐酸标准溶液相当于0.0140g 的N 。
因此，
10025.60140.0)((%)25.6%'12⨯⨯⨯⨯⨯-==⨯v
v m c v v N 粗蛋白质 式中：v 2—试样滴定时所需酸标准溶液的体积（m1）；
v 1—空白滴定时所需酸标准溶液的体积(m1)；
c —盐酸标准溶液的浓度(mol/L)；
m 一试样的质量（g ）；
v —试样的分解液总体积（ml ）；
v ’—试样分解液蒸馏用体积（m1）；
0.0140—每ml HCl 标准溶液相当于N 的克数； 6.25一氮换算成蛋白质的平均系数。
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。
当粗蛋质含量在25％以。
上，允许相对偏差为1％；当粗蛋白质含量在l0％～25％时，允许相对偏差为2％；当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。
测定步骤的检验精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按测定步骤文字中的各步骤操作，并按公式计算（但不乘系数6.25），测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2％，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。
试样消煮时，加入硫酸铜0.2g，无水硫酸钠2g，与试样混合均匀，再加硫酸10ml，仍可使饲料试样分解完全,只是试样焦化再变为澄清所需时间要略长些。