柱层析原理详解课件
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离子交换柱层析法分离氨基酸(共19张PPT)
管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
加样示意图
6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为 与的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个 烧杯中。其中的加入到直接输出溶液的那个池， 如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，管×50。
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度， 一个同学一手手同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很 小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放 水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂， 但也不能溢出。
18cm
端倒 面好 高平 的 整层 ，析 无管 气 泡 ， 约
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠 离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出 液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的 液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管
内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时 进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流 出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
加样示意图
6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为 与的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个 烧杯中。其中的加入到直接输出溶液的那个池， 如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，管×50。
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度， 一个同学一手手同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很 小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放 水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂， 但也不能溢出。
18cm
端倒 面好 高平 的 整层 ，析 无管 气 泡 ， 约
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠 离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出 液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的 液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管
内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时 进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流 出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其
硅胶柱层析技术 ppt课件
ppt课件 9
3、色谱柱的选择 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常 压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的 分离，一个柱子几个月也是有的。 ①减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更 多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在 柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能 得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而 且时间长）。 ②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加 压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双 连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分 解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太 ppt课件 10
ppt课件 8
2.6 合并 根据上面薄层检测的结果 , 我们可以将具有相同 Rf 值的 部分进行合并,然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸 发,最后得到我们需要的目标产物.
2.7色谱柱的洗涤 在绝大多数情况下,硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用 , 但在使用后的色谱柱中由于还含有冲洗溶剂,所以要将里面 的硅胶到出是比较困难的.取出硅胶的一种方法是将该柱放 置一段时间,让溶剂自然挥发完后,倒出硅胶.但这种方法既 费时又污染环境.第二种方法可以用一根比色谱柱稍长的木 杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出,但这种办法
硅胶柱层析技术
ppt课件
1
常说 的 过 柱 子 应 该 叫 柱 层 析分离，也叫柱色谱。我们常用的 是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附 柱。 其实 硅 胶 柱 层 析 技 术 也 可 以称作硅胶吸附柱色谱技术
ppt课件
2
色谱法，又称层析法。是一种以分配平衡为机理的 分配方法。色谱体系包含两个相，一个是固定相， 一个是流动相。当两相相对运动时，反复多次的利 用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异，最后 达到彼此分离的目的。 色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、平板色谱和 棒色谱三种，而实验室中最常用的是柱层析和薄层 层析，以及它们之间的配合应用。
3、色谱柱的选择 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常 压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的 分离，一个柱子几个月也是有的。 ①减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更 多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在 柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能 得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而 且时间长）。 ②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加 压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双 连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分 解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太 ppt课件 10
ppt课件 8
2.6 合并 根据上面薄层检测的结果 , 我们可以将具有相同 Rf 值的 部分进行合并,然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸 发,最后得到我们需要的目标产物.
2.7色谱柱的洗涤 在绝大多数情况下,硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用 , 但在使用后的色谱柱中由于还含有冲洗溶剂,所以要将里面 的硅胶到出是比较困难的.取出硅胶的一种方法是将该柱放 置一段时间,让溶剂自然挥发完后,倒出硅胶.但这种方法既 费时又污染环境.第二种方法可以用一根比色谱柱稍长的木 杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出,但这种办法
硅胶柱层析技术
ppt课件
1
常说 的 过 柱 子 应 该 叫 柱 层 析分离，也叫柱色谱。我们常用的 是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附 柱。 其实 硅 胶 柱 层 析 技 术 也 可 以称作硅胶吸附柱色谱技术
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2
色谱法，又称层析法。是一种以分配平衡为机理的 分配方法。色谱体系包含两个相，一个是固定相， 一个是流动相。当两相相对运动时，反复多次的利 用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异，最后 达到彼此分离的目的。 色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、平板色谱和 棒色谱三种，而实验室中最常用的是柱层析和薄层 层析，以及它们之间的配合应用。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
实验三葡聚糖凝胶柱 层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机 械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分 离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以 进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流 动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量 大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋 白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱 液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中 蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包 括电泳法、质谱法、免疫学检测法和 光谱分析法等。电泳法是最常用的方 法之一，可以通过观察电泳图谱来判 断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一 的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高 ；而模糊的、多条带则表明蛋白质中 含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国 际蛋白质协会制定，分为一级、二级 和三级纯度标准。一级纯度标准要求 蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不 含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋 白质中主要含有一种单体蛋白质，其 他杂质含量不得超过5%；三级纯度标 准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋 白质，其他杂质含量不得超过10%。
柱层析原理详解课件
溶剂 + 氧化铝
(氧化铝• 溶剂) + 热
往往能在局部地方生成足能使溶剂蒸发的热量. 蒸气的产生造成了气泡, 气泡又 把柱内填充料挤开, 这就是所谓的缝隙 .
溶剂
• 使用氧化铝或硅胶时, 要避免使用某些溶剂, 特别是酸性的, 碱性的和高活性形 式的溶剂. 举例来说, 丙酮会与任何一个这样的吸附剂通过醇醛缩合作用二聚 成乙酰丙酮. 当用乙酸乙酯或醇类作为洗脱液时, 会使酯类的混合物发生酯交 换作用. 最后, 更活泼的溶剂(吡啶, 甲醇, 水和乙酸) 会溶解和洗脱一部分吸附 剂本身.
B 干法
• 方法一: 用溶剂将柱子充满并让它缓缓流出. 在按上述方法不停地轻敲柱子的 同时, 每次少量地把干的吸附剂加入柱中. 此法也可得到装得很均匀的柱. 同上 法一样, 每次使用前应将溶剂反复循环通过几次.
• 方法二: 先将干的吸附剂装入柱中, 硅胶面压实顶部水平后将溶剂缓慢渗沥穿 过柱子, 直至柱子全被浸润. 但此法容易造成柱子不匀, 空气泡和缝隙, 尤其是 使用在溶剂化过程中有高度放热的溶剂时, 这些问题尤为突出.
➢ 所有层析法所根据的工作原理都是凭借于欲待分离的几种物质在将它们进 行分配的两相之间的溶解度(或吸附度) 上的差别.
❖吸附剂 • 柱层析法是以吸附度和溶解度这两者为根据的一种技术, 它是一种固-液相间
进行分配的技术. 其中的固体几乎可以是任何物料, 只要不溶解于附着的液相 中即行. 但最常用的一些固体是硅胶(SiO2 xH2O) 也叫做硅酸, 和氧化铝 (Al2O3 xH2O). 这些化合物均用其粉状或磨细的形式(通常为200至400目) 层析 法中所用的极大多数氧化铝系从粗的铝矿石(Al2O3 xH2O + Fe2O3) 制得.将铝 土矿石溶于热氢氧化钠溶液中, 过滤除去不溶的氧化铁; 矿石中的氧化铝则成 为可溶性的两性氢氧化物 Al(OH)4-. 这个氢氧化物用CO2(它能降低PH) 使沉淀 成为 Al(OH)3 , 在加热时, 此Al(OH)3失水成为纯的 Al2O3.
柱层析法的原理和方法ppt课件
实验案例讨论与经验分享
案例介绍
介绍几个典型的柱层析法应用案例，包括实验设 计、操作过程、结果分析等。
经验分享
分享实验过程中积累的操作技巧、注意事项、故 障排除等方面的经验。
互动交流
鼓励与会者提问、分享自己的实验经验和心得， 进行深入的讨论和交流。
总结与展望
06
柱层析法原理与方法的总结回顾
柱层析法原理
方法 调整流动相的组成和pH值
优化柱温和流速
参数优化的方法和原则
• 选择合适的色谱柱和填料
参数优化的方法和原则
原则 通过实验确定最佳参数组合
根据目标物质的性质和分离要求进行参数优化 注意避免参数变化过大，以免对分离效果造成不利影响
结果分析方法和技术
方法 峰面积和峰高比较法
标准曲线法
结果分析方法和技术
离、纯化和鉴定。
生物样品分析
柱层析法可用于生物样品中痕量 物质的分离和分析，如生物碱、 氨基酸等，提高分析的灵敏度和
准确性。
柱层析法在食品安全检测中的应用实例
01
农药残留检测
柱层析法可用于食品中农药残留的分离和检测，通过合适的填料和洗脱
条件，将农药与食品中的其他成分分离，提高检测的准确性和可靠性。
发展历程
自20世纪初开始，柱层析法逐渐从基础的实验室技术发展为高效、自动化的现 代分离分析方法。
柱层析法的重要性和应用
重要性
柱层析法在化学、生物、医药、环境等领域发挥着重要作用 ，为复杂混合物的分离和纯化提供了有效手段。
应用
药物研发、天然产物提取、环境监测、食品安全等领域广泛 应用柱层析法。
柱层析法的基本原理
实验操作和案例分
05
析
柱层析(原理与装置)
柱层析（原理与装置）柱层析技术是化学分析中重要的分离技术。
它是一种基于不同成分在固定相（称为柱填充物）上的不同分布系数的分离方法。
柱层析方法主要分为液相层析和气相层析。
1. 原理柱层析技术利用了不同成分在柱填充物上的不同亲和性的原理。
填充柱由一个非极性性固体样品填充而成，样品通常被溶解在一个称为流动相或移动相的液体或气体中。
样品在柱中移动时，它的成分随着柱填充物的性质不同而在柱中停留的时间不同。
这些成分会因为与固定相有不同的亲和性而被分离开来。
在柱层析中，样品必须在流动相中溶解，然后在柱的填充中进行分离。
因此，选择适当的流动相是非常关键的。
柱层析的另一个重要方面是填充物的选择。
填充物的表面粗糙程度、孔径大小和化学性质会影响到分离物质的迁移速率。
柱填充物的分离效果取决于其孔径大小和表面活性，因为这些特征决定了化学物质相互作用的强度和种类。
通常，小孔径填充物用于分离大分子种类，而大孔径填充物用于分离小分子。
2. 装置柱层析器是由填充柱、进样装置、分离槽、检测器和数据处理器组成的。
填充柱完成了分离陈述的过程，而进样装置将样品引入柱中。
分离槽按顺序装有各种柱，以实现复杂的分离过程。
检测器记录分离物质，而数据处理器则负责管理数据和计算分离效率等参数。
柱层析技术用于快速自动化分离有机和无机化合物，可以应用于很多科学领域。
在医疗行业中，柱层析技术用于检测和分离人体液体中的生化成分。
在环境科学和工业中，柱层析技术可以用于处理废水和污染物质。
在生物技术中，柱层析技术用于制备重要的生物分子如酶和分离蛋白质复合物等。
色谱分析—柱色谱(分析化学课件)
柱色谱应用
（五）分子排斥色谱 （size- exclusion chromatography） 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝
胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通 过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外 ，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按 质量分离。
柱色谱应用
（三）离子交换色谱（ion-exchange chromatography） 原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应； 固定相：阴离子或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子 交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 阳离子交换：R-SO3H+M+ =R-SO3 M+H + 阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4 X+OH应用：离子、可离解的化合物、氨基酸和核酸等。
柱色谱应用
1.吸附剂 吸附剂为多孔性微粒物质。常用的有硅胶、氧化铝、聚酰胺和大孔吸附树脂等。 需满足以下条件： ❖具有较大的吸附表面和吸附中心； ❖与样品、溶剂和洗脱剂均不发生化学反应； ❖不能被溶剂或洗脱剂溶解； ❖粒度均匀，且有一定的粒度。
柱色谱应用
（1）硅胶 适用于酸性或中性物质 （2）氧化铝 碱性氧化铝 pH 9.0～10.0 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4.0～5.0 适于分析酸性、中性物质 （3）聚酰胺 氢键作用，氢键能力↑强，组分越后出柱。 注：吸附剂含水量越大，活性级别越高，吸附活性越低，吸附能力越弱。
柱色谱应用
A
B
C
D
柱色谱应用
薄层色谱和柱层析ppt课件
氧化铝呈碱性，适用于碱性和中性物质的分离。
硅胶和氧化铝1：1量掺和使用，得中性吸附剂，或在制板 时加入稀酸或稀碱使其变性，或用酸性或碱性展开剂展开， 以改变硅胶或氧化铝原来的性质。
2021/8/9
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9
（Ⅲ）样品的极性
物质的极性愈大，氧化铝和硅胶吸附愈牢，物质极性大小 如下：
饱和烃 < 不饱和烃 < 醚 < 酯 < 醛 < 酮 < 胺< 羟基化合物 < 酸和碱
性炭因吸附性太强和黑色，使应用受到限制。
（2）分配色谱对载体的要求
（Ⅰ）表面积大
（Ⅱ）在展开剂中不溶，与展开剂和样品组分不起化学反应或 分解作用
（Ⅲ）对样品组分无吸附性或吸附性弱
（Ⅳ）对固定液是惰性的
2021/8/9
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8
常用的有纤维素和硅藻土。
实际工作中，吸附剂、载体等的选择，首先决定于样品成
（c）酸碱薄层板和pH缓冲薄层板：有些化合物在普通板上分 离不好时，可通过改变原来吸附剂的酸碱性，改善分离效果。 如在铺层时用稀酸（一般用1～4%的盐酸或0.1～0.25mol/L草 酸溶液）代替水制成酸性板，使生物碱形成离子对而分离。
（d）混合薄层板：两种不同吸附剂按一定比例混合，制板， 也可分段铺板，前段预处理，以吸附杂质，后段分离。
2021/8/9
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14
（e）径向薄层板：径向板铺法与一般板不同，点样前按下法 处理：
刮去
刮去
用此板展开，可使Rf值相近的化合物得到较好的分离，且 灵敏度高。 （f）梯度薄层板：梯度是指由一种性质到另一种性质的变化。 梯度薄层与常规薄层不同，它显示出具有渐变的分离性能，如
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
硅胶柱层析技术(共32张PPT)
▪ 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 ①干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活
塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附
层柱。子可以分为：加压，常▪ 压，极减压性。较大的用甲醇：氯仿系统
匀浆法
1、称量
200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量 的 硅 胶 H 。 干 硅 胶 的 视 密 度 在 左 右 ， 所 以 要 称 40g 硅 胶 ， 用 烧 杯 量 100ml也可以。
2、搅成匀浆
加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/ 乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就 用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸 乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸 钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸 敏感，不能用氯仿体系过柱。
②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
③常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点 是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不 需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本 低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学 实验室中至今仍被广泛应用。
4.2 展开 展开剂选择
选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.
塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附
层柱。子可以分为：加压，常▪ 压，极减压性。较大的用甲醇：氯仿系统
匀浆法
1、称量
200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量 的 硅 胶 H 。 干 硅 胶 的 视 密 度 在 左 右 ， 所 以 要 称 40g 硅 胶 ， 用 烧 杯 量 100ml也可以。
2、搅成匀浆
加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/ 乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就 用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸 乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸 钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸 敏感，不能用氯仿体系过柱。
②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
③常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点 是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不 需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本 低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学 实验室中至今仍被广泛应用。
4.2 展开 展开剂选择
选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.
柱层析
柱层析（原理与装置）利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。
柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析(原理见第97～100页和第101～102页)、分配柱层析(原理见第91～92及94～95页)和离子交换柱层析等。
其中以吸附柱层析应用最广。
以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。
1.吸附柱层析的器材(1)层析柱图3-35 层析柱实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，如图3-35a所示，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。
如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。
另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。
这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。
用一只螺旋夹控制流速，如图3-35b所示。
此外，薄膜塑料柱如图3-35c，因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。
薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。
使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。
将这段玻璃管穿过一个单孔塞。
然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。
用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。
待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。
层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。
柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。
如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。
最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。
葡聚糖凝胶柱层析ppt课件
分离 范围 <700 <1500 1000~5000 1000~5 000 1000~5000 1000~5000 1500~30000
三、实验步骤：
1、准备好电泳槽，向二边槽内加入柠檬酸缓冲液(pH3. 5)，使两 边等高。 2、醋酸纤维素薄膜裁成2×8cm，先在蒸馏水润湿，然后凉干。 在粗糙面距一端1.5cm画一条线，标出点样点。 3、点样：用毛细管在点样点处点样2-3次， 注意斑点直径2～ 3mm。 4、在电泳槽的阳极和阴极放入滤纸，使其下端浸入电泳缓冲液 中。 5、粗糙面朝上，将醋酸纤维膜平稳地放在电泳槽的滤纸架上， 注意二点：点样点在负极。滤纸桥与醋酸纤维膜贴紧。
今天的上样量（0.5ml）约为1%柱床体积。
2.2、层析柱： ①柱长：组别分离时，5－30厘米； 分级分离时，可长至100厘米； ②柱径：分析分离时，由于样品量少，常使用1厘米 直径的层析柱，若制备分离时样品量大，最好使用 直径2－3厘米的层析柱。 今天选用的是2cm ×50cm的层析柱。
2.3、洗脱液的离子强度和pH值： 多糖类：水是最佳洗脱剂。 蛋 白 类 ： 离 子 强 度 ＞ 0.02M 的 盐 溶 液 作 洗 脱 剂 ， 以消除凝胶的吸附作用。 pH＞7时，酸性物质易被洗脱。 pH＜7时，碱性物质易被洗脱。
1、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，其原理是分子筛效应。 根据不同分子的分配系数不同而分离。
当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程 长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短， 流动快。这样，就可使大小不同的分子分开。
层析的几个主要参数：
总体积： Vt(total volume)， 外水体积：Vo(outer volume) 内水体积： Vi(inner volume) 洗脱体积： Ve(elution volume) 干胶体积： Vg(gel volume) Vt（床体积）= Vo + Vi + Vg , Ve（洗脱体积 = Vo + Kd×Vi。
7.实验七 柱层析
边装边敲打
装柱注意事项
在加入氧化铝之前先加入5ml石 油醚。
装至柱高1/4即可，保持氧 化铝上液面在1cm以上， 静置，待氧化铝完全沉降。 决不可干柱
用滴管将氧化铝混匀，均 匀缓慢的加入到层析柱中， 边加边敲击柱壁
装柱完成后柱子内壁不能 有残留氧化铝，用石油醚 冲洗干净。
装柱完成后，把石油醚浸泡的氧化铝用封口膜盖好，放好。
1 剪刀剪碎置于研钵中，加入无水乙醇15mL，
研钵中研磨捣碎，约10min.
将乙醇液直接过滤到分液漏斗中，用6mL
石油醚萃取色素，分离下层液后，用20mL 饱和氯化钠溶液分两次洗涤石油醚提取液，
2
每次10mL
分取石油醚层于烧杯中，加入无水硫酸钠
0.1-0.5g，振摇，静置5min，以除去石油
3
醚层中的水分
实验十六--柱层析
Column Chromatography
化学教研室
实验目的
了解
A
1. 柱层析法分离有机物的基本原理。 2．固定相和流动相的选择原则。
掌握
B
1. 色谱柱的填充方法。 2．柱色谱分离的基本操作。
色谱法分类
固定相、流动相 的物理状态
液—固色谱法 气—固色谱法 气—液色谱法 液—液色谱法
B •分离出现色带即可，不洗脱成分。
•分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置， C 用吸耳球从活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱
顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。
D
•实验完成后，清洗器材，全部拿到烘箱烘干， 尤其是层析柱，
E 实验台上和柜子里所有的东西，放回原处。
ห้องสมุดไป่ตู้
思考题
1 为什么极性较大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？
装柱注意事项
在加入氧化铝之前先加入5ml石 油醚。
装至柱高1/4即可，保持氧 化铝上液面在1cm以上， 静置，待氧化铝完全沉降。 决不可干柱
用滴管将氧化铝混匀，均 匀缓慢的加入到层析柱中， 边加边敲击柱壁
装柱完成后柱子内壁不能 有残留氧化铝，用石油醚 冲洗干净。
装柱完成后，把石油醚浸泡的氧化铝用封口膜盖好，放好。
1 剪刀剪碎置于研钵中，加入无水乙醇15mL，
研钵中研磨捣碎，约10min.
将乙醇液直接过滤到分液漏斗中，用6mL
石油醚萃取色素，分离下层液后，用20mL 饱和氯化钠溶液分两次洗涤石油醚提取液，
2
每次10mL
分取石油醚层于烧杯中，加入无水硫酸钠
0.1-0.5g，振摇，静置5min，以除去石油
3
醚层中的水分
实验十六--柱层析
Column Chromatography
化学教研室
实验目的
了解
A
1. 柱层析法分离有机物的基本原理。 2．固定相和流动相的选择原则。
掌握
B
1. 色谱柱的填充方法。 2．柱色谱分离的基本操作。
色谱法分类
固定相、流动相 的物理状态
液—固色谱法 气—固色谱法 气—液色谱法 液—液色谱法
B •分离出现色带即可，不洗脱成分。
•分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置， C 用吸耳球从活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱
顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。
D
•实验完成后，清洗器材，全部拿到烘箱烘干， 尤其是层析柱，
E 实验台上和柜子里所有的东西，放回原处。
ห้องสมุดไป่ตู้
思考题
1 为什么极性较大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？
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吸附剂
氧化铝: 分为酸性(PH=4), 中性, 碱性(PH=10). 这种吸附剂特别适用于分离象羧
酸和氨基酸之类的酸性物质. 碱性氧化铝的PH约为10, 故适用于分离胺. 中性
氧化铝可用于分离各种非酸性和非碱性物质.
纤维素 淀粉 糖类 硅酸镁 硫酸钙 与极性化合物发生结合作用的能力递增次序 硅酸 硅胶 人造硅酸镁 氧化镁 氧化铝 活性炭（Norit)
B 干法
• 方法一: 用溶剂将柱子充满并让它缓缓流出入柱中. 此法也可得到装得很均匀的柱. 同上 法一样, 每次使用前应将溶剂反复循环通过几次.
• 方法二: 先将干的吸附剂装入柱中, 硅胶面压实顶部水平后将溶剂缓慢渗沥穿
过柱子, 直至柱子全被浸润. 但此法容易造成柱子不匀, 空气泡和缝隙, 尤其是
流动或称沟流.
造成这种现象的原因主要是吸附剂表面不平整或在填料中有任何不平整性或
气泡.
装柱
A 湿法(浆液法)
即吸附剂以浆液状态被装入管内. 浆液是一种溶剂和一种不溶解的固体的混 合物. 操作方法是将固体吸附剂慢慢加入盛有大量溶剂的容器中. 注意要严格 遵守这种加料次序(加吸附剂至溶剂), 因为吸附剂在加入到溶剂中时会因溶剂 化效应而放热. 若向吸附剂内加溶剂, 由於发热会使溶剂几乎与加入速率一样 快地气化逸出, 使最终的混合物不均匀或结块. 因此通常的做法是将吸附剂加 入溶剂中, 边加边旋摇, 使其形成一种稠厚但能流动的浆液. 浆液应不断旋摇直 至已呈均匀状态且相对地不再含有空气泡为宜.
2. 选定的溶剂极性
3. 相对于需待分离的物料量的柱子尺寸(长度和直径)
4. 洗脱(或流动) 的速率
A.吸附剂
• 吸附剂的选择通常要根据需待分离的化合物的类型而定. 主要有: 纤维素, 淀粉和糖类: 用于对酸碱相互作用非常敏感的多官能团的动, 植物性化 合物(天然产物) 硅酸镁: 分离乙酰化的糖类, 甾体化合物和香精油. 硅胶和合成硅酸镁载体(Florisil): 对大多数化合物来说相对地比较温和, 故可 广泛适用于种种官能团—烃, 醇, 酮, 酯, 羧酸, 偶氮化合物, 胺.
溶剂
供层析用的溶剂（洗脱剂） 烃 最快（可用非极性溶剂洗脱） 烯烃 醚 卤代烃 芳香族化合物 酮 洗脱的次序 醛 酯 醇 胺 酰胺 酸，强碱 最慢（必须用极性溶剂）
溶剂
• 一般来说, 各类化合物被洗脱时, 非极性化合物最先洗脱, 极性化合物最后洗脱.
可是, 分子量也是一个决定洗脱次序的因素. 高分子量的非极性化合物将比低
装柱
装柱时, 先向柱内充入溶剂至约半满, 然后开启活塞让溶剂慢慢流下, 借助旋 摇动作使浆液混合, 然后慢慢倾入正在流出溶剂的柱子的顶部. 同时要不断轻 轻地敲击柱壁, 促进均匀沉降和混合, 避免空气泡的形成. 同时在所有物料沉降 好之前要持续轻敲柱壁, 这样可以使柱顶形成一个非常合格的水平面. 另外如果浆液有时因变得太厚而无法倾倒, 可将收集在烧杯中的溶剂重新加至 浆液内. 然后将收集到的溶剂在柱内反复循环几次以保证沉降完全及柱子的紧 实.
在溶剂极性相同的情况下, 溶剂的流速一般而言（HPLC，MPLC除外），
流速均以越快越好，因为一般而言流动相流速与板高成反比，而板高越
小越好，所以流动相流速越快越好。所以快速
流速
（加压）柱层析的效果比一般重力柱层析好。
装柱
• 柱层析法中最关键性的操作是装柱. 柱子在用吸附剂填充时必须装得非常均匀, 如果装得不整齐, 出现气泡, 缝隙等会明显影响分离效率. 主要存在两种情况: • 一: 谱带的最前面的边缘或称前沿不水平, 如果两条谱带紧靠在一起而又无水
相互作用
• 对於溶解度来说, 也有类似的法则. 极性溶剂对极性化合物的溶解比非极性溶 剂更为有效; 非极性化合物则最易被非极性溶剂所溶解. 因此任何一个给定溶 剂洗下吸附在氧化铝或硅胶上的化合物的能力大小几乎直接决定于该溶剂的
相对极性. 对於每一被吸附着的物料来说, 可以想象它们在吸附剂和溶剂之间
吸附剂
• 按此方法制得的氧化铝称为碱性氧化铝. 因为它仍旧含一些氢氧化物. 碱性氧 化铝不能用于对碱敏感的化合物的层析分离. 因此, 要用酸加以洗涤以便将碱 中和, 这样便得到酸性氧化铝. 这种物料仍然不能令人满意, 除非经过足够的水
洗以除去所有的酸, 才能获得最适用于柱层析的物料, 称为中性氧化铝. 如果化
使用在溶剂化过程中有高度放热的溶剂时, 这些问题尤为突出.
上样
分为以下几个步骤:
A.
将固体样品溶于极少量适宜的极性溶剂中, 溶剂的极性应比样品的极性小一
些, 否则样品不易被吸附. 溶剂对样品的溶解度也不宜过大.
B.
C.
通过排液, 使溶剂的水平面刚好低于吸附剂的顶部.
将待分离的溶液用移液管(或长滴管) 加入柱顶. 注意要接触柱的内壁慢慢
waals) 力与氧化铝结合. 这种力较弱, 故非极性化合物不能结合得很牢除非它
们的分子量非常大. 极性有机化合物所用的相互作用力则较为重要,此中所用
• 之力或为 偶极-偶极相互作用力, 或为某种 直接的相互作用力(配位作用, 氢键,
或盐的形成等).
相互作用
• 这些相互作用的强度变化次序大致是: 盐的形成>配位作用>氢键>偶极-偶极相 互作用力>范德华力
往往能在局部地方生成足能使溶剂蒸发的热量. 蒸气的产生造成了气泡, 气泡又 把柱内填充料挤开, 这就是所谓的缝隙 .
溶剂
• 使用氧化铝或硅胶时, 要避免使用某些溶剂, 特别是酸性的, 碱性的和高活性形 式的溶剂. 举例来说, 丙酮会与任何一个这样的吸附剂通过醇醛缩合作用二聚 成乙酰丙酮. 当用乙酸乙酯或醇类作为洗脱液时, 会使酯类的混合物发生酯交 换作用. 最后, 更活泼的溶剂(吡啶, 甲醇, 水和乙酸) 会溶解和洗脱一部分吸附 剂本身.
沿柱壁散布放样使其慢慢下降. 从而使整个吸附剂表面都被其均匀地盖住.
同时要注意尽量使移液管贴近吸附剂表面.
上样
D 让这一薄层液体进入柱内, 直至柱顶表面恰好开始沥干为止.
E: 小心用移液管加入一薄层层析分离溶剂, 小心不要搅动表面, 让这一薄层溶剂
排入柱中直至这段柱正好沥干, 目的是洗涤柱壁上附着的样品. 如样品有色,
30g
300.0g
16.0mm
35.0mm
D 流速
溶剂流经柱子的速率对於决定一个分离能进行得多好也起着作用. 一般来 说, 需待分离的化合物在柱上逗留愈久, 其在固定相和移动相之间的平衡 愈广泛. 结果可以使较为相似的化合物得到分离. 然而如果流速过慢, 则混 合物中各个物质到了溶剂中后其在溶剂中的扩散速率可能变得大於这些 物质沿柱下行速率. 在这种情况下谱带变宽, 反而使分离效果变差. 事实上,
A Introduction to Chromatography
• Column chromatography • Pre TLC
2006.07
Column Chromatography
柱层
原理 吸附剂 相互作用 影响分离的参数 装柱 上样 洗脱技术 柱的监控
原理
有机化学家能用的最现代化和尖端的方法全部包括某种类型的层析法. 层析 法的定义是, 通过在两相之间的分配, 使一个由两种或多种不同化合物(有时 是离子) 组成的混合物得到分离, 这两相中一相是固定的, 另一相则是移动的. 根据所包括的两个相的性质, 可有各种可能形式的层析法; 供普通使用的有 固-液(柱, 薄层和纸), 液-液和气-液(蒸气相) 层析法. 所有层析法所根据的工作原理都是凭借于欲待分离的几种物质在将它们进 行分配的两相之间的溶解度(或吸附度) 上的差别.
所用柱子的高度和直径之比应大约为8:1.
• 但要注意的一点是, 柱的尺寸和长度及需用吸附剂的量还决定于分离的困难程
度. 不易分离的化合物可能需要更长的柱子和更多的用量.
柱的尺寸和吸附剂量
某些典型样品量适用的柱尺寸和吸附剂数量 样品量 0.01g 30mm 0.1g 60mm 1.00g 130mm 10.00g 280mm 吸附剂量 0.3g 3g 柱直径 3.5mm 7.5mm 柱高
则可从新鲜溶剂层上有没有这种样品的颜色来判断样品有没有被完全吸附.
F: 向柱顶加入石英砂并注入溶剂.
上样
* 在开始洗脱之前让样品在柱中停留一段短时间往往可以得到较好的分离, 这样
做可以建立起一个真正的平衡. 然而, 必须指出, 在一个经过长时期放置的柱中,
是吸附剂需要避免的, 因为这种高活性会使得吸附剂和待分离的化合物发生某 些形式的破坏作用和分解作用, 往往能引起某些类型的溶质化合物发生分子重 排反应.
B 溶剂
各类溶剂的极性次序如下表:
供层析用的溶剂 石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 二氯甲烷 氯仿 二乙醚 乙酸乙酯 吡啶 丙酮 乙醇 甲醇 水 乙酸
法中所用的极大多数氧化铝系从粗的铝矿石(Al2O3 xH2O + Fe2O3) 制得.将铝
土矿石溶于热氢氧化钠溶液中, 过滤除去不溶的氧化铁; 矿石中的氧化铝则成
为可溶性的两性氢氧化物 Al(OH)4-. 这个氢氧化物用CO2(它能降低PH) 使沉 淀成为 Al(OH)3 , 在加热时, 此Al(OH)3失水成为纯的 Al2O3.
合物是酸敏感的, 必须使用碱性或中性氧化铝, 必须仔细的弄清你在层析法中
所用的氧化铝属於哪一类型. 硅胶除了以适用于层析法的形式供应外别无任何
其他类型.
相互作用
• 若将粉末状或磨细的氧化铝(或硅胶) 加入至含有一种有机化合物的溶液中时, 一部分有机物将会吸附或黏在氧化铝细粒上, 使有机分子和氧化铝结合的力有 好几种. 这些力按其种类不同, 强度不一. 非极性化合物只用范德华( Van der
都有一种分配平衡, 即不断地从溶液中吸附分子又不断地向溶液中解吸分子.