分子生物学实验技术

DNA Replication and Repair_Lei Shi

1、DNA损伤修复的类型、来源。

⑴细胞内源性的损伤—复制错误,碱基脱氨氧化；

⑵外源型-环境因素造成的损伤—辐射（TT）致癌物质（烷化剂、EB亚硝酸等）如碱基的损伤、

错配,碱基的缺失,碱基的交联等.

2、男性谱系和女性谱系鉴定的机理。

⑴男性谱系：Y染色体，Y-STR（short tandem repeat）是Y染色体上的短串联重复序列。Y-STR经常用于法医学，亲子鉴定和家谱DNA测试。Y-STR特异性地从雄性Y染色体获得。Y染色体上的基因只能由亲代中的雄性传递给子代中的雄性（即由父亲传递给儿子），因此在Y染色体上留下了基因的族谱，Y-DNA 分析现在已应用于家族历史的研究。

⑵女性谱系：线粒体DNA。线粒体DNA（mtDNA）是DNA的一部分，是母系遗传的，通过卵子传递，且一般很难发生改变。mtDNA存在于双膜细胞器内。每个细胞中有许多线粒体DNA拷贝。•如果样本有限，mtDNA可以获得更多的DNA,

•可以从高度降解的来源获得DNA

3、基因操作的载体必须具备的特征是什么？常用的载体有哪些？

⑴克隆载体应具备的主要特点：

至少有一个复制起点（origin of replication, ori）

至少有一个选择性标志（selection marker）

有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）应有较高的拷贝数。

⑵表达载体：原核表达载体：除了具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。

⑶真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。真核表达载体中还具有：

①真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A 加尾信号等

②真核细胞复制起始序列

③真核细胞药物抗性基因

目前应用最广泛的原核表达载体是大肠杆菌表达载体。

常用载体：质粒载体：pBR322质粒

噬菌体载体：λ噬菌体、M13噬菌体

病毒载体：反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等

4、如何分离蛋白质（分离方法及步骤）

蛋白质分离主要根据五种原理：分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物学亲和力等。分离方法有透析与超滤、凝胶过滤法、离子交换层析法、低温有机溶剂沉淀法等。

5、蛋白质鉴定的常用方法（质谱鉴定）

用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要部分，1）样品入机的离子源，2）测量被介入离子的分子量的装置。首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）为一脉冲式的离子化技术。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。其次是电喷雾质谱（ESI-MS），是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。

在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器和延迟提取，可达相当精确的分子量。在ESI-MS中，纳米级电雾源的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。

目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。

(1)肽质指纹术（peptide mass fingerprint， PMF）

用酶（最常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS），这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的）。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。

(2)肽片段（peptide fragment）的部分测序

肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。或者，在质谱仪内应用源后衰变（post-source decay，PSD）和碰撞诱导解离（collision-induced dissociation， CID），目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。因此，允许推断肽片段序列。肽片段PSD的分析在MALDI 反应器上能产生部分序列信息。首先进行肽质指纹鉴定。之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。但经常产生不完全的片段。现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。在ESI-MS 中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。与MALDI-PSD相比，CID 稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。由此，序列可被推测。由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。

它的基本原理是蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（即质荷比，M/Z）的肽段离子分离开来，经过检测器收集分离的离子，确定每个离子的M/Z值。经过质量分析器可分析出每个肽段的M/Z，得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱，即蛋白质的一级质谱峰图。离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析，输出选取肽段的二级质谱峰图，通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。

一开始，蛋白质谱通过离子化（Electrospray Ionization，ESI）或者基质辅助激光解吸电离（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）的方法对完整的蛋白质进行离子化后进