DNA的酶切与连接
DNA体外酶切连接
3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ P OH nick
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，
完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量
DNA连接酶
平头双链DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连 接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括：
酶切效率1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小
时，完全 水解 1 mg 标准DNA所需的酶量
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
DNA片段的连接、转化和酶切鉴定是基因工程中常用的实验
技术。
下面是这些步骤的详细描述：
1. DNA片段的连接（Ligation）：将两个或多个DNA片段连
接在一起。
这通常使用DNA连接酶（ligase）来催化连接反应，其中DNA连接酶通过形成磷酸二酯键将DNA片段连接起来。
2. DNA转化（Transformation）：将连接好的DNA片段转化
进入宿主细胞。
转化是通过加入特定的化学物质（例如钙离子和热激冷冻）或基因枪等方法，使细胞质膜对DNA片段通透，使其能够进入细胞内。
3. 酶切（Enzyme Digestion）：使用限制性内切酶（restriction enzyme）对转化后的DNA进行酶切，以确认连接是否成功。
限制性内切酶具有特异性，能够识别特定的DNA序列并在其
附近切割DNA链。
4. 鉴定（Identification）：通过凝胶电泳（gel electrophoresis）等方法对酶切后的DNA进行分离和鉴定。
凝胶电泳是一种基
于DNA分子的大小和电荷的分离方法，可以将DNA分子按
照大小分开，并可根据标准样品和分子量标记DNA片段等进
行鉴定。
通过上述步骤，可以实现DNA片段的连接、转化和酶切鉴定，从而用于基因工程研究和应用中。
实验DNA酶切连接及电泳检测
1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定； 2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 连接反应： λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成：
19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 酶切反应： 标准pUC19(2686bp) EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液
检测：
0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
(1)
实 验 原 理 – 连接
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的 。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或 NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一 DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必 须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶 除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。
实验结果分析
关于OD值分析
一40个ugO/mDl2单60n链m单DN位A相或当R于NA于50ug/ml 双链DNA 或 OD260/280: 1.8-2.0 DNA: 1.8 (RNA: 2.0) 比值<1.8：蛋白质污染 比值>2.0: RNA污染
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
DNA连接反应的步骤及说明
DNA连接反应的步骤及说明1.DNA片段的准备：首先，需要准备待连接的DNA片段。
这些片段可以通过PCR扩增、酶切、化学合成等方法获得。
通常情况下，需要使用DNA电泳等方法对所得片段进行纯化。
2.酶切：对于需要连接的DNA片段，通常需要进行酶切。
酶切是通过特定的限制性内切酶作用于DNA分子的特定位点将其切割为片段。
酶切的目的是使得两个相互连接的DNA片段具有互补的黏性末端，为连接反应提供条件。
3.连接反应的混合：将需要连接的DNA片段以及连接酶和相应的缓冲液混合。
连接酶通常是DNA连接酶，可以将DNA分子连接在一起。
4. 连接反应的条件：连接反应通常在适当的反应缓冲液中进行。
连接酶对于温度和pH值都有特定的要求，因此在连接反应中必须保持恰当的温度和缓冲液pH值。
例如，常用的DNA连接酶T4 DNA Ligase在适宜的pH值和温度下具有最佳的酶活性。
5.连接反应的时间：连接反应的时间取决于所使用的连接酶的速度以及连接反应的目的。
一般情况下，连接反应通常需要在4°C至37°C下进行数分钟至几小时。
6.连接反应的酶切：连接反应结束后，需要用限制性内切酶对连接的DNA分子进行酶切。
这一步是为了去除未连接的DNA分子以及连接酶，以提高连接反应的准确性。
7.DNA连接酶的去除：连接酶在连接反应结束后需要被去除，一般常用热灭活法或化学去除法。
热灭活法是将连接反应体系加热至70°C一段时间（如10分钟），高温可使连接酶失活。
化学去除法是通过柱等手段，利用一些物质能够与连接酶结合并使其失活的性质，达到去除目的。
8.电泳鉴定：连接反应后的DNA片段可以通过电泳进行鉴定。
通过与大小标准品进行比较，可以确定连接反应是否成功。
连接反应成功后，DNA片段的大小会发生改变，从而可以通过电泳图谱来观察。
DNA连接反应是分子生物学中重要的技术，可以实现基因克隆、构建重组融合表达载体等应用。
连接反应的成功与否对后续实验结果的可靠性至关重要，因此在每一步操作中需仔细操作，确保反应条件的正确性，以及对连接酶的适当去除等。
酶切和连接
双酶切：载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。
我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。
我的酶切体系如下：质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng）(NEBlack Eye SfiⅠ1ul(NEBlack Eye BssHⅡ1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul水14.8ul总体积20ul50度，2小时。
切出了370bp左右的片段，回收载体。
然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。
证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。
50度3小时我试过，但是质粒有降解。
酶量应该说是过量的。
请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。
如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。
但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。
在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。
相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。
实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。
这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。
ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。
不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。
现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。
在瓜作用的底物。
如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。
DNA的酶切与连接1.实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用...
DNA的酶切与连接1. 实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用原理，学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA 消化和片段的方法和技术。
2. 实验原理DNA限制性内切酶和连接酶是遗传工程中实现DNA的切割和重组的重要工具酶，也是基因工程技术赖以生存的基础。
1970年Smith H·O等从流感病毒中提取了第一个限制性内切酶Hind II，其作用于外源DNA后，切割产生平末端。
人们经过研究发现，限制性内切酶可以识别双链DNA分子上的特异序列，通常识别区具有回纹结构，并使两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
目前已经从微生物中发现了200多种限制性内切酶，其中大部分可以切割DNA形成粘性末端。
如EcoR I，可以识别6个碱基的序列：▼5’ ――――――GA TTC――――――3’3’ ――――――CTTAAG――――――5’▲切割后形成的片段5’――――――G AA TTC――――――3’3’――――――CTTAA G――――――５’当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为：片段数目= 切点数+1 （线状DNA）片段数目= 切点数（环状DNA）切点出现的频率为1/4s（S为识别顺序所含的碱基数目）DNA连接酶则可以将切开的DNA片段连接起来，此时需要接口两端具有磷酸根。
对粘性末端的单链可以进行点接，对于平末端来说也可以进行连接，但是需要较多的酶。
在基因工程中，可以利用同一种限制性内切酶分别切割目标DNA和运载体，然后利用T4DNA 连接酶将目标序列整合到运载体中，使DNA中的3’-OH与5’-P生成磷酸二酯键。
3. 实验用具及材料电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、微量移液器、Eppendorf离心管10×酶切反应缓冲液、T4DNA连接酶缓冲液、溴酚蓝指示液、EB电泳缓冲液、PBR322质粒DNA、pXZ6质粒DNA，λphage DNA、DNA Marker EcoRI Hind III。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。
根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。
关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。
限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。
影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。
DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。
T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。
影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。
第四讲 DNA分子的酶切
酶切产生5’突出黏性末端
5’ -C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-
-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T- 3’
EcoRI 37℃
P-A-A-T-T-C-G-A-’ 5’-C-T-G-OHG … 3’ -G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T3’
酶切产生3’突出黏性末端
-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 5’ …-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 3’
II型
单一条肽链构成， 单 功 能 ， 活 性 仅 需 Mg2+。
III型
二亚基蛋白质， 双功能：既有内切酶 活性，又有修饰酶活 性。 切断位点在识别序列 周围25-30bp范围内，
特 异 性 识 别 并 切 割 DNA 。切割位点位于 识别位点序列范围内。
应用最广的限制性内 切酶，通常重组 DNA 操作中内切酶即指此。
DNA甲基化程度
大肠杆菌DNA腺嘌呤甲基化酶（dam）， 在GATC序列中腺嘌呤N6位引入甲基， 使用甲基化酶 影响BclI、MboI等的活性。 缺失的菌株制 大肠杆菌DNA胞嘧啶甲基化酶（dcm）， 备质粒DNA 在CCAGG或CCTGG序列中胞嘧啶C5 位引入甲基，影响EcoRII等的活性。
种 类 型 切 割 方 式
5’突出黏性末端
3’突出黏性末端
酶切产生平头末端
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C… 5’
PvuII 37℃
5’ … G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C… 5’
DNA的限制性酶切胶回收与连接
DNA的重组连接的原理
DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA， 通过DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸 与3’端羟基之间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。
本实验利用T4DNA连接酶，有Mg2+、ATP存在的连接反 应体系中，将载体puc18与目的基因sod连接起来。
连接体系（10ul）：
琼脂糖凝胶回收的原理：
不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中泳动速度不一样 而分离。
NaI存在条件下，加热至55℃，含有DNA片段的琼脂糖凝胶就 会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分子，从而得到纯净 的DNA片段。
硅胶树脂在酸性高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA， 通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐浓度下其与 DNA的结合能力会急剧降低，如使用弱碱溶液如TE(pH8.0)就 可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段。
它能够识别并结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列，在 该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二酯键，切断DNA 双链结构。
限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸， 具有回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列，或 称为反向重复序列 ）特征。
在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是HindⅢ和 EcoRⅠ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可 以保证酶切产物与载体正确的连接。
注意事项：
溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故切胶时应使 用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。
切胶时，尽量沿目的片段边缘切下，使其所带的琼脂糖 尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。
将目的DNA吸附在Genclean柱上，要重复回收一次，以 提高目的DNA的回收效率。
DNA的酶切与连接(一)
实验七DNA的酶切与连接（一）一、实验目的1.掌握限制性内切酶的特性和酶切的目的和原理2.掌握限制性内切酶酶解体系的建立及酶切样品的检测2.掌握PCR试剂盒回收PCR酶切样品的方法二、实验原理1.通过DNA重组技术构建DNA重组子利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。
成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。
2.酶切限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为I型、II型和III型三类。
DNA重组技术中最常用的是II型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。
II型酶的主要特点是识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。
这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端和平头末端。
限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，一个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37度下反应60min，完全酶切1ug的纯DNA所用的酶量。
三、材料、试剂及器具1.材料与试剂酶切反应：质粒pGEX-4T-2EcoRIXhol酶切缓冲液DNA回收：PCR回收试剂盒检测：1X TAE电泳缓冲液Gel Red琼脂糖2.仪器电泳仪，离心机，移液枪，Hema凝胶成像仪三、实验步骤1.质粒DNA酶切①在PCR管中，按照下表加入试剂（单位：ul）EcoRI1保温2h进行酶切反应。
③反应结束后，65度保温20min使酶失活。
2.酶切产物的回收a)将PCR反应产物或其它酶促反应物移入1.5ml离心管中。
质粒DNA的酶切和连接
华南师范大学实验报告学生姓名闫红博学号 20122501108专业生物科学年级、班级 12级生科三班课程名称分子生物学实验实验项目：质粒DNA酶切、连接、电泳检测实验类型□验证□设计□综合实验时间 2015年4月21日实验指导老师实验评分一、实验目的1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；2、了解影响酶切的因素；3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；4、了解影响连接反应的因素。
二、实验原理1、限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
2、限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
3、DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。
它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
4、常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。
二者的作用机理类似。
三、实验试剂和材料1、材料与试剂酶切反应：标准pUC19(2686bp)EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液检测：0.5×TBE电泳缓冲液6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖四、实验步骤（一）质粒DNA酶切在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）↓混匀；点动离心将反应液甩至管底。
DNA酶切与连接反应
实验四：DNA酶切与连接反应1. 实验原理1.1 DNA酶切限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。
DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。
II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。
限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
1.2 DNA连接核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。
DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。
一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，在含有Mg2+,ATP的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。
常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。
2. 实验材料、试剂及仪器2.1 实验材料与试剂标准pUC19(2686bp) 、EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液、λDNA/EcoT14 I片段（50ng/μl）、T4 DNA连接酶及其配套的10×连接缓冲液、0.5×TBE电泳缓冲液、6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖。
2.2 实验仪器水平式电泳装置、台式高速离心机、恒温水浴锅、PCR仪、微量移液枪、微波炉、凝胶成像仪。
3. 实验步骤3.1 质粒DNA酶切在200μl 的薄壁离心管中，按照下表1加入试剂，混匀。
点动离心将反应液甩至管底。
37℃(水浴)保温1h进行酶切反应。
表1：质粒DNA酶切反应加样成分及用量样品代号成份反应1用量（标准pUC19)H 无菌水7.0μlP 质粒(500ng/u稀释10倍) 10μlB 酶切缓冲液 2.0μlE EcoRI酶 1.0μl3.2 DNA片段的连接取200 μl的离心管按下表2加入试剂，混匀。
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
dna片段的连接,转化及酶切鉴定DNA片段的连接、转化和酶切鉴定是现代分子生物学中常用的重要技术。
这些技术的应用范围非常广泛，从基因工程领域到基因组学研究都离不开它们的支持。
本文将详细介绍这三个步骤的原理、操作流程和研究中的指导意义。
首先，我们来了解DNA片段的连接技术。
DNA片段的连接是指将两个或多个不同的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
这种技术常用于构建重组DNA分子，如表达载体、敲除载体等。
连接的原理是利用DNA内切酶切割DNA片段的特定酶切位点，然后利用DNA连接酶将两个切割的DNA片段连接起来。
连接前需要将DNA片段与连接载体（如质粒）进行预处理，使其具有互补的黏性末端，以利于连接的进行。
连接后的DNA分子可以通过转化技术导入宿主细胞，实现在细胞中的复制和表达。
接下来是DNA片段的转化技术。
转化指的是将外源DNA分子引入到细胞内，使其在细胞中进行复制和表达。
常用的转化方法有化学转化和电转化。
化学转化利用化学物质（如钙离子）破坏细菌细胞壁的完整性，使外源DNA能够进入细胞质，并通过复制酶在细胞内复制。
电转化则利用高压电场瞬间改变细胞壁的通透性，使外源DNA能够进入细胞内。
转化后，细胞将外源DNA与自身的染色体一起复制和分裂，并表达外源DNA所携带的基因。
这种技术在基因工程和基因组学研究中应用广泛，如构建转基因植物、基因敲除实验等。
最后是DNA片段的酶切鉴定技术。
酶切鉴定是通过利用DNA内切酶切割DNA片段的特异性特点，检验DNA分子是否具有所需的序列。
酶切鉴定可用于检测构建的重组DNA是否成功、确认基因敲除是否有效等。
酶切鉴定的步骤包括DNA片段的提取和纯化、酶切反应和电泳分析。
DNA片段的提取和纯化可以通过常规方法，如碱解法和柱层析法等进行。
酶切反应是将DNA与特定的酶切酶一起孵育，在适当的反应条件下进行酶切。
然后，利用琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的大小和数量。
通过与理论预期的DNA片段大小进行比较，可以确定所需的DNA 片段是否存在。
酶切酶连原理
酶切酶连原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：酶切酶连是一种利用特定酶将DNA切割成片段的技术，常被用于DNA重组、基因克隆、DNA测序等实验中。
酶切酶切原理基于DNA 和酶之间的特异性相互作用，通过将DNA暴露给特定的酶，可实现对DNA进行精确的切割。
本文将详细介绍酶切酶连原理以及其在生物学研究中的应用。
酶切酶是一类可以识别特定DNA序列并切割这些序列的酶。
常用的酶切酶包括EcoRI、HindIII、BamHI等。
这些酶通常都是细菌产生的，用于细菌自我保护机制中。
酶切酶在体外环境下可以识别特定的DNA序列，然后将DNA切割成两段或多段。
这些切割点通常在特定序列的周围，形成粘性末端或平滑末端切口。
酶切酶的切割原理是基于DNA的序列特征。
DNA是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶）组成的核苷酸序列。
当酶与DNA序列匹配时，它会识别并结合到特定的序列上。
酶切酶通常识别4~8个碱基组成的特定序列，被称为酶切位点。
一旦酶与DNA结合，它会切割DNA链，形成特定的切口。
酶切酶的切口可以是粘性末端切口或平滑末端切口。
粘性末端切口是指在切口的两端形成单链突出的DNA片段，这种切口有助于DNA重组。
平滑末端切口是指在切口的两端形成平滑的DNA片段，这种切口适合进行DNA连接反应。
利用酶切酶可以实现对DNA的精确切割，进而实现多种生物学实验，如基因克隆、DNA测序、PCR扩增等。
在基因克隆中，酶切酶被用来将感兴趣的DNA序列切割成片段，然后将片段插入质粒中。
在DNA测序中，酶切酶用来切割DNA，生成不同长度的片段，有助于测序。
在PCR扩增中，酶切酶可以用来切除重复序列，避免扩增产物出现。
酶切酶连原理是一种基于DNA序列特异性的技术，可以实现对DNA的精确切割。
通过利用酶切酶，我们可以在实验室中对DNA进行定制处理，满足各种生物学实验的需要。
酶切酶连技术的发展为生物学研究提供了强大的工具，带来了许多创新和突破。
DNA重组技术：酶切、连接
DNA重组技术：酶切、连接实验原理:DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5’…G↓AATTC…3’ →5’… G AATTC…3’3’…CTTAA↑G …5’ →3’… CTTAA G…5’构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。
通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。
酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
限制性内切酶的一个活性单位U理论上， 1hr,切1ug DNA 样品中所有专一位点的所用酶量实际反应，1U酶：能完全切割1ul λDNA的一个位点不能完全切割1ug 带有4个酶切位点的样品和不纯的样品.如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
限制性内切酶的使用注意事项：10x bf o 无盐注意混匀 L 低盐H 高盐一.仪器水浴锅(37℃，65℃) 凝胶电泳灭菌锅紫外检测离心机二.试剂及溶液λ DNA EcoR IpUC18 无菌水终止液 (40%蔗糖) 70％，100％酒精3Mol/L KAc(pH5.2) ice琼脂糖溴酚蓝TE TAEEB marker三. 用品移液器20ul 一次性手套tip 20ul 防护镜离心管0.5ml 吸水纸胶带浮子PUC 18/19, λDNA2人／组，一人做 PUC18 酶切（20ug） Takara 25ug/个一人作λDNA 酶切（15ug）EcoR1 1ul/人（10 u） (20ul) Takara 4000u/个四：酶切反应:DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
酶切连接的原理
酶切连接的原理
酶切连接是一种常用的分子生物学技术，用于将DNA片段连接到载体DNA上或两个DNA片段连接起来。
酶切连接的原理基于DNA酶切和DNA连接两个主要步骤。
酶切是指利用特定的限制性内切酶酶切DNA分子，将DNA 分子切割成特定的碎片。
限制性内切酶能够识别DNA的特定序列，将该序列切割成特定的酶切位点。
每个限制性内切酶都有自己特定的酶切位点，例如EcoRI酶切位点为5'-GAATTC-3'，BamHI酶切位点为5'-GGATCC-3'。
通过选择合适的限制性内切酶，可以将DNA切割成特定长度的碎片。
连接是指将两个DNA片段联接在一起。
连接需要使用DNA 连接酶，该酶能够在两个DNA片段的断裂末端引入磷酸二酯键，将两个片段连接起来形成一个连续的DNA分子。
DNA连接酶通常需要一个活性磷酸基团和一个OH基团来实施连接。
在连接过程中，两个断裂末端的OH基团与连接酶的活性磷酸基团形成磷酸二酯键，连接酶同时被释放。
在酶切连接过程中，首先将目标DNA与限制性内切酶在适宜条件下反应，使DNA被切割成合适长度的碎片。
然后，利用DNA连接酶将切割后的DNA片段连接至载体DNA上或其他DNA片段上，形成目标DNA的完整结构。
连接后的DNA可以经过序列验证和进一步的应用，如基因克隆、基因工程等。
总之，酶切连接技术通过酶切和连接两个关键步骤，使得
DNA片段可以被精确地切割和连接成特定结构。
这种技术在分子生物学研究和基因工程领域有着广泛的应用。
实验7 DNA的酶切与连接
实验七、DNA的酶切、连接限制性核酸内切酶可以识别并附着特定的DNA序列，并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割，使DNA双链产生平末端或黏性末端。
DNA连接酶能连接DNA链中3’-OH末端和5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
DNA连接酶的催化作用需要消耗能量。
1、酶切反应DNA样品：PCR纯化产物、空载体pQE30； 内切酶：Bam HⅠ、Hin dⅢ；反应体系：50μL。
酶活性1 μl Bam HⅠ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在30℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。
37℃反应也表现出相同的酶活性，但不如30℃时稳定。
1 μl Hin dⅢ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在37℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。
50μL反应体系ddH2O补至50μl10×QuickCut Green5uLBufferDNA（pQE30、EGFP）200ngQuickCut Bam H I1uLQuickCut Hin dⅢ1uL注：本实验消化约5μg DNA样品，按实际浓度计算所用的体积。
分别对空质粒、EGFP进行酶切。
操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在37℃保湿孵育30min；4. 1.2%琼脂糖凝胶电泳20min，使用QuickCut GreenBuffer可直接上样；5.进行胶回收，回收产物置于-20℃冰箱保存，用于连接反应。
2、连接反应DNA样品：目的基因片段、空载体pQE30；（经双酶切并回收纯化）连接酶：T4 DNA连接酶；反应体系：20μL。
20μL反应体系ddH2O补至20μL 10×ligation buffer2uL载体DNA（pQE30）50ng目的DNA片段（EGFP）33ngT4 DNA Ligase (350U/μl)1uL注：载体和目的基因的摩尔比为1:3，50ng/3.4kb : 33ng/0.72kb = 14.7 : 45.8 ≈ 1:3操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在16℃保湿孵育3h；（可在PCR仪里进行）4.连接产物由值日生放置于-20℃冰箱保存，用于转化实验。
酶切、连接与转化
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性， 但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件 下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异 性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改 变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改 变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因 此第二活性又称星号活性。概括起来，诱导星号的 因素有以下几种： 1,高甘油含量(>5%,v/v);2,限制性内切酶用量过 高(100u/ug DNA)；3,低离子强度 (<25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有机溶剂， 如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二价阳离子存 在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）
限制性酶切 (修饰 DNA 末端) 连接载体与插入片段 转化 (将重组质粒导入宿主细胞) 分析重组子
谢谢
限制性内切酶的特点
1. 2. 3. 4. 高度特异性 商业化生产 反应需要Mg2+ 不同的内切酶可能产生相同的末端
4. 影响核酸限制性内切酶活性的因素
（1）DNA 纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液
5、限制性内切酶的星号活性
3’ 突出末端
p -GGG-3’ OH-CCC-5’
平末端
+
粘性末端: DNA片段经限制性内切酶切割后, 在切割 位点处所产生突出的5’-或3’-单链末端.
识别序列
识别 4-8 bp 的回文序列. 常用的酶识别 6 bp 发生的概 率为 46=4096 bp/每次. (44=256 bp; 48=65536 bp) 5’ GAATTC 3’ 如 EcoRI 识别序列: 3’ CTTAAG 5’
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材料、试剂及器具
1、材料与试剂 酶切反应： 标准pUC19(2686bp) EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液 连接反应： λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成：
19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
用量（μl） 6.0 10.0 2.0 2.0 20
（三）质粒及质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测
1、琼脂糖凝胶的制备：制备2%琼脂糖凝胶（0.4g/20ml）。 （注：2 人一组制胶板一块，8个加样孔）
2、加样：
（1）酶切样品的检测
酶切阴性对照：pUC19标样 10μl + 10X的loading buffer 2μl 酶切样品：标准pUC19酶切样品 10μl+ 10X的loading buffer 2μl
通过DNA重组技术构建DNA重组子
利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶 连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的 酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行 表达提供了有效的实验材料。
酶切
连接
实 验 原 理 – 酶切
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性 酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上， 并切割双链DNA。
主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。
（二）DNA片段的连接(注：以2人为一组）
取200 μl的离心管按下表加入试剂。
↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底
↓ 置于已调好温度为12℃-14℃PCR仪中
↓ 保温2h后取出
↓ 电泳检测
样品代号 H I f T
成分 ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修 饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技 术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或 平末端的线性DNA。
II型限制性内切酶： 由两种酶分子组成的复合体，一种具有 限制性内切酶功能，另一种为独立的甲 基化酶功能，它们具有识别同一序列的 能力，但却发挥不同的作用。
实 验 原 理 – 连接
核酸片段可以通过连接酶的作用 连接起来而获得重组分子。
DNA连接酶催化双链DNA分子中 相邻碱基的5’- P末端与3’-OH 间形成3’,5’-磷酸二酯键。
一个DNA片段的5’-P末端与另一 个3’-OH末端相互靠近时，在 DNA连接酶的作用下，有Mg2+, ATP存在的缓冲系统中可以被 连接起来而形成重组分子。
实验五 DNA的酶切与连接
E-mail: huanglh@ 本节课讲义请到如下网址下载： /blog/insecthuang.htm
实验目的
基本原理： 1、掌握限制性内切酶的特性和酶切的目的和原理 2、掌握DNA连接酶的一般性质和作用机制 基本操作： 1、掌握限制性内切酶酶解体系的建立及酶切样品的检测 2、掌握DNA连接体系的建立以及连接样品的检测
实验预期结果
质粒及酶切样品电泳预期结果
1
23
线型 DNA
质粒不同构型的电泳行为
从左至右：
1. λ/EcoT14 I DNA Marker 2. pUC19质粒 3. pUC19质粒酶切样品
超螺旋 DNA
DNA片段的连接样品电泳预期结果
1： λDNA/Eco14Ⅰ酶切片段 2-3：λDNA/Eco14Ⅰ 酶切片段 的连接 产物
思考题
1. 用提取的一种质粒作电泳分析，可能会出现一条或二条 或三条带型，该如何判断它们的构型？
2. 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？ 3. DNA完全酶切所具备的条件？ 4. 如果一种DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为
是什么原因？ 5. T4DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，为什么实验中
DNA连接酶作用机制
常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底 物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子， 可以连接粘性末端、平末端。
T4 DNA连接酶的活性用Weiss单位表示。
1 Weiss单位是指在37℃下20min内催化1nmol 32P从焦磷酸根置换到 [γ,β-32P] ATP所 需的酶量。
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
实验步骤
（一）质粒DNA酶切(注：以2人为一组）
在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）
↓ 混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温2h进行酶切反应。
↓ 反应结束后，加入2μl 10×loading buffer 钝化酶活性；
（或：65℃，保温20min使酶失活） ↓
电泳检测
样品代号 H P b E
成份 无菌水(μl)
质粒(μl) 酶切缓冲液(μl)
EcoRI酶(μl) Total(μl)
反应1（标准pUC19) 2.5 10 1.5 1.0 15
实验报告
按规范的实验报告格式完成本节内容的实 验报告，要求记录电泳图谱，说明带型含义并 与标准质粒pUC19(浓度：25ng/ μl ）和 λDNA/Eco14ⅠDNA Marker比较。如未能得到预 期结果，请分析失败原因。
本节回顾
z 酶切的原理和实验体系的建立 z 连接反应的原理和实验体系的建立 z 质粒DNA三种构型的电泳速率差异
（2）连接样品检测：
λ/EcoT14 I 样品 10μl（兼作 DNA Marker）+ 10X的loading buffer 2μl
DNA连接样品：10 μl + 10X的loading buffer 2μl
3、恒压电泳: 130V 电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm处，大约30分钟 4、观察:紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。
采用１２～14℃？（1.粘性末端形成的氢键在低温下更 稳定；2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活） 6. 如何确定连接反应中各成分的用量（优化连接反应条 件）？（参考实验指导P.169）
如: EcoRI的识别顺序为：
5’…… G A A T T C ……3’ 3’…….C T T A A G …单位表示，1个酶单位 （1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完 全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液 中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增 加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应 该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异 性的酶切(星号活性)。图:构建DNA重组子