DNA的酶切与连接

实验预期结果
质粒及酶切样品电泳预期结果
1
23
线型 DNA
质粒不同构型的电泳行为
从左至右：
1. λ/EcoT14 I DNA Marker 2. pUC19质粒 3. pUC19质粒酶切样品
超螺旋 DNA
DNA片段的连接样品电泳预期结果
1： λDNA/Eco14Ⅰ酶切片段 2-3：λDNA/Eco14Ⅰ 酶切片段 的连接 产物
实 验 原 理 – 连接
核酸片段可以通过连接酶的作用 连接起来而获得重组分子。
DNA连接酶催化双链DNA分子中 相邻Hale Waihona Puke Baidu基的5’- P末端与3’-OH 间形成3’,5’-磷酸二酯键。
一个DNA片段的5’-P末端与另一 个3’-OH末端相互靠近时，在 DNA连接酶的作用下，有Mg2+, ATP存在的缓冲系统中可以被 连接起来而形成重组分子。
实验报告
按规范的实验报告格式完成本节内容的实 验报告，要求记录电泳图谱，说明带型含义并 与标准质粒pUC19(浓度：25ng/ μl ）和 λDNA/Eco14ⅠDNA Marker比较。如未能得到预 期结果，请分析失败原因。
本节回顾
z 酶切的原理和实验体系的建立 z 连接反应的原理和实验体系的建立 z 质粒DNA三种构型的电泳速率差异
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修 饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技 术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或 平末端的线性DNA。
II型限制性内切酶： 由两种酶分子组成的复合体，一种具有 限制性内切酶功能，另一种为独立的甲 基化酶功能，它们具有识别同一序列的 能力，但却发挥不同的作用。
实验五 DNA的酶切与连接
E-mail: huanglh@scnu.edu.cn 本节课讲义请到如下网址下载： http://www.sciencenet.cn/blog/insecthuang.htm
实验目的
基本原理： 1、掌握限制性内切酶的特性和酶切的目的和原理 2、掌握DNA连接酶的一般性质和作用机制 基本操作： 1、掌握限制性内切酶酶解体系的建立及酶切样品的检测 2、掌握DNA连接体系的建立以及连接样品的检测
用量（μl） 6.0 10.0 2.0 2.0 20
（三）质粒及质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测
1、琼脂糖凝胶的制备：制备2%琼脂糖凝胶（0.4g/20ml）。 （注：2 人一组制胶板一块，8个加样孔）
2、加样：
（1）酶切样品的检测
酶切阴性对照：pUC19标样 10μl + 10X的loading buffer 2μl 酶切样品：标准pUC19酶切样品 10μl+ 10X的loading buffer 2μl
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
实验步骤
（一）质粒DNA酶切(注：以2人为一组）
在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）
↓ 混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温2h进行酶切反应。
↓ 反应结束后，加入2μl 10×loading buffer 钝化酶活性；
（或：65℃，保温20min使酶失活） ↓
电泳检测
样品代号 H P b E
成份 无菌水(μl)
质粒(μl) 酶切缓冲液(μl)
EcoRI酶(μl) Total(μl)
反应1（标准pUC19) 2.5 10 1.5 1.0 15
通过DNA重组技术构建DNA重组子
利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶 连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的 酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行 表达提供了有效的实验材料。
酶切
连接
实 验 原 理 – 酶切
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性 酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上， 并切割双链DNA。
（二）DNA片段的连接(注：以2人为一组）
取200 μl的离心管按下表加入试剂。
↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底
↓ 置于已调好温度为12℃-14℃PCR仪中
↓ 保温2h后取出
↓ 电泳检测
样品代号 H I f T
成分 ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积
思考题
1. 用提取的一种质粒作电泳分析，可能会出现一条或二条 或三条带型，该如何判断它们的构型？
2. 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？ 3. DNA完全酶切所具备的条件？ 4. 如果一种DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为
是什么原因？ 5. T4DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，为什么实验中
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 酶切反应： 标准pUC19(2686bp) EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液 连接反应： λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成：
19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
如: EcoRI的识别顺序为：
5’…… G A A T T C ……3’ 3’…….C T T A A G …… 5’
回文结构的对称轴
限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位 （1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完 全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液 中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增 加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应 该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异 性的酶切(星号活性)。图:构建DNA重组子
DNA连接酶作用机制
常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底 物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子， 可以连接粘性末端、平末端。
T4 DNA连接酶的活性用Weiss单位表示。
1 Weiss单位是指在37℃下20min内催化1nmol 32P从焦磷酸根置换到 [γ,β-32P] ATP所 需的酶量。
主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。
（2）连接样品检测：
λ/EcoT14 I 样品 10μl（兼作 DNA Marker）+ 10X的loading buffer 2μl
DNA连接样品：10 μl + 10X的loading buffer 2μl
3、恒压电泳: 130V 电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm处，大约30分钟 4、观察:紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。
采用１２～14℃？（1.粘性末端形成的氢键在低温下更 稳定；2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活） 6. 如何确定连接反应中各成分的用量（优化连接反应条 件）？（参考实验指导P.169）