分子生物学10

第一节 生物大分子的分离
一、凝胶电泳
凝胶电泳在分子生物学研究中分离蛋白质和 核酸是很常见的。 核酸是很常见的。
凝胶电泳（gel electrophoresis）是一大类技 凝胶电泳 术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如 大小、形状、等电点等）的分子。凝胶电泳常 用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 两种。
琼脂糖凝胶电泳
DNA凝胶电泳。由于DNA带有磷酸基团， DNA通常带有负电荷，所以DNA在凝胶中是 从负极向正极移动的。由于DNA分子大小不 同，小分子DNA在凝胶中移动时受到的阻力 要比大分子DNA小，所以电泳结果DNA按其 分子大小分布。通过荧光染料将DNA染色， 就可以在紫外光照射下观察凝胶上DNA的分 布情况。 未知分子量大小的DNA通过和已知标准分子量 大小的DNA一起凝胶电泳，然后观察比较它 们在凝胶上的位置就可以判断未知DNA分子 量大小。同样的凝胶电泳分离原理也适用于 RNA。
• 离子交换剂是通过化学反应将带电基团引人到惰 性支持物上而形成的，如带电基团呈正电，则能 结合阴离子，称为阴离子交换剂 阴离子交换剂(anion 阴离子交换剂 exchanger)。由于被分离的各种离子所带电荷的 多少不同，它们对交换剂的亲和力就有差异，因 此经过不同浓度离子的交换与洗脱过程，使不同 的离子依先后顺序被洗脱下来，从而达到分离目 的。 • 同样原理，也可以用带有负电荷的离子交换树脂 来对包括蛋白质在内的带有正电荷的物质进行分 离。离子交换层析中，基质上带有负电荷的基团， 称之阳离子交换剂 阳离子交换剂（cation exchanger）。 阳离子交换剂
四、非放射性示踪
• 放射性示踪剂最大的优点就是灵敏度高， 不过现在很多非放射性示踪剂 non非放射性示踪剂( 非放射性示踪剂 radioactive tracer) 也有了很高的灵敏度， 而且免除了放射性示踪剂造成的放射性污 染和对人体的危害。目前最常用的非放射 性示踪剂是生物素和地高辛
Detecting nucleic acids with a nonradioactive probe.
五、定点突变
• 定点突变 定点突变（site-directed gene mutagenesis）是 指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的 DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引 入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包 括碱基的添加、删除、点突变等。 • 定点突变 定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的 蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常 有用的手段。
• 放射自显影 放射自显影（radioautography； autoradiography）的原理是利用放射 性同位素所发射出来的带电离子(α或β 粒子)作用于感光材料的卤化银晶体， 从而产生潜影，这种潜影可用显影液 显示，成为可见的"像"，因此，它是利 用卤化银乳胶显像检查和测量放射性 的一种方法。分子生物学家用得最多 的乳胶胶片是X光片。
四、原位杂交
• 原位杂交（(in situ hybridization, ISH）是 原位杂交（ ） 让细胞中的染色体扩散，使DNA部分变性 产生能与标记探针杂交的单链，通过染色 确定染色体所在，而通过放射自显影确定 目的基因所在，从而确定目的基因在哪一 条染色体上。
• 将DNA探针用能被荧光 抗体检测的二硝基酚标记， 可以确定肝糖磷酸化酶基 因位于人11号染色体上， 染色体用碘化丙啶（PI） 染色，发出红色荧光；而 以红色为背景，位于11 号染色体上的抗体探针的 黄色是很明显的。这种使 用荧光标记探针的技术就 是荧光原位杂交 （Fluorescence in situ hybridization FISH）。
• S1 mapping the 5′-end of a transcript.
三、离子交换层析
• 离子交换层析 离子交换层析（ion exchange chromatography, IEC）是 根据物质自身所带电荷的不同进行分离的层析技术。如二 乙基氨基乙基－交联葡聚糖（DEAE-Sephadex）层析就 是使用带有正电荷的二乙基氨基乙基（DEAE）的带电基 团作为树脂填料来分离物质。这些带有正电荷的DEAESephadex吸附带有负电荷的物质如蛋白质并与之相结合。 这些带有负电荷的物质所带的负电荷越多，它们之间的结 合也就越紧密。
第十章 分子生物学的研究方法
• 本章概要： 本章概要： • 生物大分子的分离 ， 标记示踪剂 ， 核酸杂 生物大分子的分离， 标记示踪剂， 转录子的作图和定量分析， 交 ， 转录子的作图和定量分析 ， 体内测定 转录速率， DNA和蛋白质的相互作用 和蛋白质的相互作用， 转录速率 ， DNA 和蛋白质的相互作用 ， 基 因工程的基础和原理。 因工程的基础和原理。
DNA分型（DNA typing）技术，又称 分型（ 指纹技术， 分型 ）技术，Βιβλιοθήκη Baidu称DNA指纹技术，是对人类基因 指纹技术 组中具有多态性的重复序列进行基因分型的技术。 组中具有多态性的重复序列进行基因分型的技术。
三、RNA印迹杂交 印迹杂交
• Northern blot用于判断完整RNA的量和大小，这 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素 膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年 创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正 好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交 印迹杂交， 印迹杂交 与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot。
• 只有一条带，说明DNA样品中只有一个基 因有与cDNA探针互补的序列，当然，这个 基因可能有多个拷贝，但每个拷贝只有一 个所用酶的酶切位点，只是产生的条带颜 色比较深而已。但是如果有多条带，就可 能有多个基因有与cDNA探针互补的序列， 但并不能确定有多少个。因为如果一个基 因有多个酶切位点，也会产生多条带。
三、液体闪烁计数
• 液体闪烁计数 液体闪烁计数（liquid scintillation counting , LSC）就是利用放射性同 位素发出的射线与物质相互作用， 从而直接或间接地产生电离和激发 等效应，产生能被光电倍增管检测 到的光子。
闪烁体是一类能吸收能量，并能在大约一 微秒或更短的时间内把所吸收的一部分能 量以光的形式再发射出来的物质。液体闪 烁计数所用的闪烁体是液态，即将闪烁体 溶解在适当的溶液中，配制成为闪烁液， 并将待测放射性物质放在闪烁液中进行测 量。
第四节 转录子的作图和定量分析
分子生物学的一个任务是转录子 转录子（mRNA） 转录子 的作图（定位起点和终点）与定量分析 （测定一定时间内的转录数量）。除了 Northern blot以外，还有多种方法进行酶 切作图和定量分析。
一、S1作图 作图
• S1作图 作图（S1 mapping）是采用S1核酸酶对RNA 作图 进行作图的方法，用于定位RNA的5’-和3’-末端以 及定量分析一定时间内细胞中的某种RNA。 • 原理：标记一条能够和目的转录产物杂交的单链 DNA探针，而不是标记转录产物本身，探针必须 包含转录产物起点或终点的序列。探针与转录产 物杂交后，使用S1核酸酶消化单链DNA和RNA。 因此，转录产物保护探针的一部分不被降解。
二、双向凝胶电泳
• 双向凝胶电泳 双向凝胶电泳（two dimensional gel electrophoresis, 2DE）可以提高单向变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析能力。 • 双向电泳由于具有高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋 白混合物的基本工具。双向电泳的第一向电泳是等电聚焦 等电聚焦 电泳(isoelectricfocusing，IEF)，然后通过十二烷基磺酸 电泳 钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE) 对蛋白质进行第二 向电泳；在IEF中，蛋白质因等电点不同而被分离；在 SDS－PAGE中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开， 再用考马斯亮兰或银染进行检测，经Pdquest等软件对结 果进行比对、解析。
指纹和DNA分型 二、DNA指纹和 指纹和 分型
• 这种DNA分型的方法是由Alec Jefferys和他的同 事们在1985年发现的，他们在研究一段来源于α 球蛋白基因的DNA片段时发现这个片段含有一段 重复多次的序列，这种重复的DNA被称为微卫星 微卫星 DNA（microsatellite DNA）。 • 每一个人的这些序列的重复方式都是不一样的， 两个人有相同序列重复方式的几率是极微的，它 们像指纹一样具有唯一性，因而又称为DNA指纹 指纹 （DNA finger print）。
四、凝胶过滤层析
• 凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography) 又称排阻 排阻 层析（molecular-exclusion 层析 chromatography）或分子 筛方法，主要是根据蛋白质 的大小和形状，即蛋白质的 质量进行分离和纯化。
第二节 标记示踪剂
一、放射自显影
• 凝胶电泳能测定这部分的大小，通过被保护部分的范围 就能确定转录产物的起点和终点。 • 与转录产物杂交的DNA探针部位被保护，包括末端标记。 探针被保护部分的大小可根据凝胶电泳已知片段大小的 marker DNA来判断。探针的右末端（标记的BamHI） 位置已清楚，被保护的探针长度就能说明左末端的位置， 即转录起始位点。 • S1作图同样可以用于定位转录产物的3’-末端。 • S1作图不仅可以定位转录末端，还可测定转录浓度。
精确检测DNA片段中放射性的量
• 通过观察放射 自显影条带的 深浅来粗略估 计，也可以用 光密度计扫描 放射自显影条 带进行准确估 计。
二、磷光成像
• 磷光成像 (phosphorescence imaging) 的工 作原理在于：同位素标记的杂交结果在磷屏 上曝光，曝光是32P等核素核衰变同时发射β 射线，首先激发磷屏上分子，使磷屏吸收能 量分子发生氧化反应，以高能氧化态形式储 存在磷屏分子中。激光扫描磷屏，对于激发 态高能氧化态磷屏分子发生还原反应，即从 激发态回到基态时多余的能量以光子形式释 放，从而被探测器捕获进行光电转换，磷屏 分子回到还原态。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 在蛋白质的分离中，电泳所用的凝胶通常是聚丙 在蛋白质的分离中， 烯酰胺。 烯酰胺。
如果要测定某一个酶的组成多肽， 如果要测定某一个酶的组成多肽，就需要用某种方 法将这个酶的组成多肽（也称为亚基） 法将这个酶的组成多肽（也称为亚基）分开再进行 电泳。通常使用去垢剂（十二烷基磺酸钠， 电泳。通常使用去垢剂（十二烷基磺酸钠，SDS） ） 使这个酶变性从而将其亚基彼此分开。 使这个酶变性从而将其亚基彼此分开。
第三节 核酸杂交
一、DNA 印迹杂交
• Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，用 于基因组DNA特定序列定位。Southern印迹杂交 基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后， 经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变 性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将 DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固 定后即可用于杂交。
• 计算机接受电信号， 经处理形成屏幕图 像这是一个伪彩色 图，不同颜色代表 不同的放射性强度， 从最低的黄色到最 高的黑色。磷光成 像灵敏度较X光片 高数十倍，可以检 测最弱的信号。
X 光 片 的 最 大 饱 和 度 在 10, 000dpm （ disintegrations per minute，射线每分 ， 钟衰变次数） ， 所以一条 钟衰变次数 ） 所以一条50, 000dpm的条 的条 带与一条10, 000dpm的条带看起来是没有 带与一条 的条带看起来是没有 差别的。而磷光成像检测的是放射性强度， 差别的。而磷光成像检测的是放射性强度， 所以10, 000dpm与50, 000dpm之间的差别 所以 与 之间的差别 是很明显的。 是很明显的。