PI染色检测细胞周期
2014-5-6 PI法细胞周期检测
细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。
一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。
因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。
通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。
PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。
PI染色法检测细胞周期
PI染色法检测细胞周期一．实验原理及试剂配置1.实验原理P I , 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA 消化后, 通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的P I 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同, 通常正常细胞的G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的DNA 含量( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量( 4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此，通过流式细胞术P I染色法对细胞内DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期，S 期和G 2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。
值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时, 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性, 才能使P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。
2.试剂配制RNase A，注意分装保存，防止反复冻融。
PI 购自Sigma公司货号P-4170，通常用过滤除菌的PBS配置成500μg/ml的储液避光保存备用，细胞染色时用PBS稀释到50μg/ml。
二．实验步骤1.细胞的收集：将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS终止消化后，200g离心3min沉淀细胞。
2.细胞的固定：将离心收集的细胞用500μL预冷的PBS悬起，200g离心3min沉淀细胞，弃上清，以充分去除残留的FBS和胰酶；加入-20℃预冷的70%乙醇500μL悬浮细胞，于4℃固定30min或-20℃固定过夜。
（此处，加乙醇时应注意边加入变吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测）3.RNA的去除：将固定好的细胞，200g离心5min沉淀细胞弃去上清液；500μL预冷的PBS悬浮细胞，200g离心3min沉淀细胞，弃去上清液；用500μL 100μg/ml的RNase A 在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。
细胞周期：PI染色
细胞周期：PI染色
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。
它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。
PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm。
实验方法：
取生长期的XXX细胞，加入3mL PBS，去掉液体加入1mL胰蛋白酶消化1~5min。
加入5mL PBS制成细胞悬液，移至15mL离心管中1500rpm离心5min，去上清液。
加入500μL PBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2 mL 20℃95%冷乙醇，混匀后固定30 min。
加入5mL PBS，1500 rpm离心5min，去上清液。
加入5mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。
加入800μL PI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min。
用流式细胞仪上机检测。
PI染色检测细胞周期实验步骤
PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是细胞分裂和增殖的过程，通常可以通过PI（propidium iodide）染色来检测。
PI是一种DNA结合染料，能够与DNA结合形成荧光化合物，通过检测荧光信号的强度可以推断细胞处于细胞周期的哪个阶段。
以下是PI染色检测细胞周期的实验步骤：材料和试剂：1.培养皿：可容纳细胞的培养皿。
2.培养基：细胞所需的培养基。
3. Propidium iodide（PI）：DNA结合染料。
4. RNase A：消化RNA的酶，可用于将RNA从细胞样品中降解。
5.细胞刮板：用于收集细胞。
6.离心管：用于离心细胞样品。
7.显微镜幻灯片：用于观察染色后的细胞。
步骤：1.准备培养皿：在培养皿中加入适量的培养基，使其能够完全覆盖细胞。
2.培养细胞：将需要检测细胞周期的细胞加入培养皿中，按照细胞的培养要求进行培养，培养至细胞密度适合进行实验。
3.收集细胞：用细胞刮板或其他方法，将细胞从培养皿中收集到离心管中。
4.细胞固定：将收集到的细胞进行固定，可以使用70%乙醇或其他细胞固定剂进行处理，固定时间通常为30分钟。
5.细胞孵育：将固定的细胞在4℃下孵育过夜，以保证细胞完全固定。
6. 细胞溶解：在离心管中加入RNase A（最终浓度一般为1mg/ml），以降解细胞中的RNA，避免对细胞周期分析结果的干扰。
7. 细胞染色：在离心管中加入适量的PI溶液（一般最终浓度为50μg/ml），将PI与DNA结合，产生荧光信号。
8.染色孵育：将含有PI的细胞溶液在4℃下孵育30分钟至1小时，使PI完全结合到DNA上。
9.细胞分析：将染色后的细胞用离心机离心，去除上清液，保留细胞沉淀。
10.流式细胞仪分析：将细胞沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中，使用流式细胞仪进行细胞周期分析，记录和分析PI的荧光信号的强度。
11.显微镜观察：将细胞沉淀取出，在显微镜幻灯片上制备细胞悬液，并使用荧光显微镜观察细胞的DNA染色情况。
PI染色检测细胞周期实验步骤
P I染色检测细胞周期实
验步骤
标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
p r o t o c o l：P I染色检测细胞周期1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。
2、用预冷的PBS清洗细胞两次。
3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。
4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8mL 的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入100μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30min （常温或4℃均可）
【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用PBS临时配好总量，其中PI50ug/ml、RNaseA100ug/mL、TritonX-10 00.2%）4℃避光染色30分钟】
5、流式分析
以标准程序用检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis) 本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。
基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。
由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。
由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。
另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。
Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。
它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。
所需试剂：1、PI染液：用于检测细胞周期的PI配制如下：方法一：10×PI配制方法,用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--EDTA10ml----PBS2、RNaseA——2mg方法二,直接配制PI工作液：PI -----5mgRNaseA——2mg1.0%Trition X-100——0.25ml枸椽酸钠——100mg生理盐水——65ml调pH值至7.2-7.5加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。
PI染色检测细胞周期实验步骤
PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是指细胞从一个开始时期，经过一系列的生长、分裂和分化过程后，再次回到原点开始的一个完整周期。
细胞周期是细胞生物学中一个重要的研究领域，对于理解细胞生物学的基本规律以及细胞增殖和分化过程具有重要意义。
其中，PI染色是一种常用来检测细胞周期的方法，下面将详细介绍PI染色检测细胞周期的实验步骤。
实验所需材料和仪器：1.细胞培养液2.细胞培养器具（细胞培养板、培养瓶等）3.离心机4. PI染色溶液（含有荧光染料Propidium Iodide的溶液）5.双色流式细胞仪6.PBS缓冲液实验步骤：1.细胞培养及处理a.选择需要研究的目标细胞，并进行适当的处理。
b.将目标细胞培养在合适的培养液中，并在37摄氏度、5%CO2的恒温培养箱中培养至所需的状态。
2.细胞收获和处理a.将细胞培养液转入培养细胞的容器中（如培养板、培养瓶等），通过离心机低速离心收集细胞。
b.将细胞沉淀在PBS缓冲液中，然后再次进行离心，去除上清液，并将细胞沉淀用PBS缓冲液进行重悬。
3.细胞固定a.用PBS缓冲液溶解适量的细胞固定剂（如乙醛或甲醛）制备1%细胞固定液。
b.向细胞悬液中加入1%细胞固定液并充分混合，使细胞固定。
4.细胞染色a.将固定的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除细胞固定剂。
b.向细胞悬液中加入适量的PI染色溶液，并在暗处孵育30分钟。
5.流式细胞仪检测a.将染色后的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除多余的染色剂。
b.将洗涤后的细胞悬液用PBS缓冲液进行重悬。
c.将细胞悬液转移到流式细胞仪的样品管中。
d.使用流式细胞仪进行细胞周期的检测，记录细胞的荧光强度和数量，得到细胞的周期分布。
6.数据分析a.使用流式细胞仪软件分析细胞周期的数据。
b.统计不同细胞周期阶段的细胞数量，并绘制相应的细胞周期分布图。
c.分析细胞周期分布的差异，并进一步探究细胞周期调控的机制。
需要注意的事项：1.在实验过程中，要保持实验环境的洁净和无菌，以避免细胞污染和结果失真。
PI染色法测细胞周期
PI染料与DNA结合
PI染料能够选择性地结合DNA，通过 荧光显微镜可以观察到染色后的细胞 核。
数据分析
通过特定的软件对数据进行处理和分 析，可以获得细胞周期的分布情况。
细胞周期分析
通过对染色后的细胞核进行荧光强度 和面积的测量，可以分析细胞的细胞 周期状态。
PI染色法的应用
肿瘤研究
通过PI染色法可以研究肿 瘤细胞的细胞周期变化， 为肿瘤的诊断和治疗提供 依据。
05
注意事项
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中进行，以减少有毒气体的吸入。
02
实验过程中应佩戴实验服和化学防护眼镜，以防止试剂溅到皮
肤或眼睛。
实验后应将废液倒入指定的废液收集容器中，不要随意倾倒。
03
实验操作注意事项
确保细胞浓度适中， 以保证计数准确性。
在洗涤过程中要彻底 去除多余的染料，以 免影响计数结果。
02
PI染色法原理
PI染料的特性
01
02
03
高荧光强度
PI染料具有高荧光强度， 能够有效地与DNA结合， 发出强烈的荧光信号。
专一性
PI染料只与DNA结合，不 与其他细胞成分结合，具 有专一性。
细胞膜通透性
PI染料能够透过细胞膜， 与细胞核中的DNA结合， 实现对细胞核的染色。
PI染色法的原理
干燥细胞
让涂片自然干燥，以便更好地观察染色效果。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察涂片，记录不同时期细胞的 染色情况。
04
结果分析
细胞周期各期的划分
G1期
细胞开始生长，DNA合成前期 ，细胞体积逐渐增大。
S期
DNA复制期，细胞核内DNA含 量加倍。
FACScalibur 检测PI法细胞周期的操作
细胞周期分析（PI染色）*以6孔板为例，每孔0.1-1X106细胞1.收集培养液; PBS洗一次并收集；胰酶消化后加入培养液，移液器吹打至单细胞悬液，收集细胞；置于冰上；(注意将培养液，PBS及消化后的细胞一并收集)2.低温4度300g离心5分钟；3.弃上清，加入2mL PBS重悬细胞，低温4度300g离心5分钟；4.弃上清，加入1mL PBS重悬细胞，移液器吹打均匀后，轻柔涡旋的同时缓慢加入3mL无水乙醇（预冷至-20度）；5.在4度或-20度至少固定2小时，过夜最好（>12小时）。
样品在这种情况下可保存数周；6.低温4度300g离心10分钟，弃去乙醇；7.用5mL PBS洗涤细胞，低温4度300g离心10分钟，弃去上清；8.加入0.5mL RNaseA 溶液（PBS，200ug/mL RNase A）重悬细胞；9.37度5-10分钟以去除RNA；10.加入0.5mL PI染色液（PBS，100ug/mL PI）；11.避光孵育，室温30分钟，或37度15分钟；12.过滤后置于冰上，避光，上机（BD FACScaliber）；13.设置机器，设置文件位于BD application/DNA quality control/FACScaliber inst settings；14.画FSC v SSC，FL2W v FL2A散点图，FL2A直方图；15.调节FL2电压，FL2A增益，使各族群很好地显示在FL2W v FL2A散点图上，FL2A直方图上第一个峰位于200道；16.在FL2W v FL2A散点图上，在FL2W较低的族群上画Region R1；17.为FSC v SSC设gate G1=R1；在FSC v SSC上画Region R2，以排除碎片；18.为FL2A直方图设gate G2=R2；19.收集数据，至少收集20000个细胞。
*若FSC v SSC散点图上并无明显细胞碎片，可省去15、16，直接为FL2A直方图设gate G1=R1。
2014-5-6 PI法细胞周期检测
细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。
一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。
因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。
通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。
PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。
PI染色法测细胞周期
进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA 的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成 为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合 成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从 DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发 生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或 者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0 期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。 因 此 ， 整 个 复 制 周 期 可 以 描 述 为 G0/G1 ， S ， G2/M期。
流式细胞术的应用cba细胞生理学研究细胞活力增殖能力的检测荧光信号的面积和宽度所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量一般对dna倍体测量时采用面积如fl2a这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映dna的含量当形状差异较大而dna含量相等的二个细胞得到的荧光脉冲高度是不等的经过对荧光信号积分后所得到的信号值就相等
3、荧光染料浓度：染料太少，结合不完 全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。
4、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染 料与核酸分子的结合，造成荧光发射强 度减弱。
什么是流式细胞仪
流式细胞仪(Flow Cytometer 简称FCM) 是一项集激光技术﹑电子物理技术﹑光 电测量技术﹑计算机技术以及细胞荧光 化学技术﹑单克隆抗体技术为一体的新 型高科技仪器。
什么是流式细胞术
简单说就是自动化的萤光显微镜 测定分析悬浮于液流中的颗粒在通过激
光束时发出的光学信号的一个系统
流式细胞仪特点及检测标本
特异性强，灵敏度高，速度快，并能实 现多参数分析；
可检测的样本种类多样
(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实 体组织，培养细胞
(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
PI染色检测细胞周期的方法
PI 染色检测细胞周期protocol1、 离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS 洗细胞两次。
2、 加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。
3、 细胞染色：离心收集细胞，以1mL 的PBS 洗细胞一次，加入500uLPBS 含50ug/mL 溴化乙锭（PI ）(1/100)，100ug/mL RNase A(1/1000)， 0.2% Triton X-100(1/500)， 4℃避光孵育30分钟（PI 我是直接用PBS 配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA 酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响） 。
4、 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit 分析。
分析时，使用FL2-w 和FL2-A 显示，去除联体细胞，具体如下图。
细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M 期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。
5、 结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76G2/M 期占13.07，峰位于横座标的91.43S 期占25.73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。
总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV 是变异系数。
一般CV 越小，峰形越好，越尖锐。
能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。
流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期(PI染色)操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定过夜。
4、离心,弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室温避光孵育30min。
9、混匀,过300目筛网,置流式管中,4℃冰箱保存,待测。
10、用流式细胞仪检测细胞周期
11、用Flowjo软件分析流式细胞仪检测数据,并导出细胞周期分析结果
备注:
1、RNase A:贮液浓度:1mg/ml ;
工作液配制:加1 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中,使终浓度为
20ug/ml。
2、PI:贮液浓度:2.5mg/ml;
工作液配制:加2.5 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中,使终浓度为50ug/ml。
4、检测样品细胞浓度1x106 /ml。
PI标记法检测细胞周期
PI标记法检测细胞周期1.实验原理：PI染料即碘化丙啶，是流式检测细胞周期应荣最为广泛的荧光染料。
PI能与细胞内的双链DNA和RNA结合，被488nm激光激发后发射红荧光，与核酸结合后其发射荧光信号的能力会提高20~30倍。
PI染料不能自由穿过活细胞完整的细胞膜，标记时需先用乙醇固定细胞，使细胞膜的通透性增加，这样PI染料就能通过细胞膜进入细胞内与核酸结合，标记时需同时加入RNA酶消化细胞内的RNA，使PI只能与细胞内的DNA 结合，反映细胞内DNA的含量，继而通过细胞内DNA的含量确定细胞周期。
后来发展了用低渗的柠檬酸溶液一步标记PI燃料法，细胞在低渗的条件下其细胞膜的通透性增加，PI染料就可以进入细胞膜如细胞内的DNA结合，此法简便，快捷，应用更为广泛。
2.试验步骤PI标记方法一（乙醇固定法）：（1）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取2x106细胞，离心沉淀，弃上清。
（2）200μl PBS重悬沉淀于1.5mlEppendorf管中，缓慢加入1ml预冷的（保存于4℃）的70%乙醇固定目标细胞。
充分混匀，4℃静置30min。
（3）离心沉淀，弃上清，200μl适当浓度的PI染液重悬细胞，同时加入RNA酶，充分混匀，4℃静置30min。
（4）离心沉淀，弃上清，200μl流式PBS重悬沉淀，流式上样分析。
PI标记方法二（低渗法）（1）低渗柠檬酸标记液配制：柠檬酸三钠0.25g，TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)0.75ml,PI 0.025g，RNA酶0.005g，用双蒸水补足至250ml。
（2）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取2x106细胞，离心沉淀，弃上清（3）1ml低渗柠檬酸标记液重悬沉淀，充分混匀，4℃静置30min.（4）离心沉淀，弃上清，200μl流式PBS重悬沉淀，流式上样分析。
3.注意事项检测细胞内DNA含量时必须保证样品内的细胞都是处于单细胞状态，但是在实际样品中经常会出现粘连的双细胞和多细胞团块，而流式细胞仪可能会将粘连在一起的两个二倍体细胞当作是一个四倍体的细胞，如果粘连的细胞较多而没有在分析时排除流式分析时就会得到比实际情况高很多的G2/M期细胞的比例，得到的流式结果就不准确。
PI染色法测细胞周期ppt课件
19
通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行 分析，可以得到细胞各个时期的分布状态， 计算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解细 胞的增殖能力；结合DNA指数分析，还可进行 凋亡、异倍体等检测。
20
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2 M
加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在 旋涡状态下逐滴加入2ml-20℃95%冷乙醇，混 匀后固定30min。
24
加入5mlPBS，1500rpm离心5min，去上清 液。
加入5mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min， 去上清液。
加入800ulPI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混 匀，室温避光染色30min
S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图
4
G2 M
G1
s
细胞周期
DNA分析
G0
G0G1
细 胞 数 量
s G2 M
2N
200
400
4N DNA含量
600
800
1000
5
6
肿瘤组织中的各种DNA倍体
2倍体
异倍体
4倍体
7
DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有 亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞 数。
11
12
13
R1
Fil e: 4
Acq ui si tion Date: 06- Mar -03
Quad Events % Gated X M ean Y M ean
UL
254
2.40 37.47 461.36
PI单染细胞周期检测-protocol(mo--new)
PI单染检测细胞周期操作步骤：1、铺板：5×105 cells/ml，六孔板，每孔1ml。
2、血清饥饿法进行细胞同步化处理：无血清培养基培养8-12h，然后才加药。
注意：实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。
自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。
周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其他阶段细胞增多。
3、收集细胞悬浮细胞：直接离心收集细胞，弃上清，在4 ℃、1200rpm用预冷的PBS洗细胞2次；贴壁细胞：a.将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞）b.PBS冲洗液c.不含EDTA的0.25%的胰酶消化1-5min后，将细胞吹打成单细胞悬液将a、b、c合并后1200rpm离心5min；弃上清；用PBS清洗一次，再次弃上清，加入1.5ml PBS重悬细胞；注：为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，可选用多孔培养板；在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。
4、固定：将细胞悬液加入预冷（-20℃）无水乙醇3.5ml，使乙醇终浓度为70%，4℃固定过夜。
注意：（1）加入无水乙醇的时候要逐滴、慢速；（2）不是向细胞中加70%乙醇，而是向细胞悬液中加无水乙醇，这样是为了减少细胞聚集；（3）在染色之前细胞4 ℃固定可保存3周；5、离心收集细胞：以预冷（4℃）PBS洗细胞一次，调整细胞浓度≧1.0×106；6、PI综合染液：弃上清，在106细胞中加入0.5ml综合染液，重悬细胞后37 ℃水浴30 min。
PI stocking solution:5mg PI+5ml PBS--------混匀于15ml避光离心管RNase A stocking solution: 10mg +1ml PBS--------混匀于1.5ml避光离心管Triton X-100:0.5ml+25ml PBS--------混匀于50ml避光离心管注：（1）RNase A于－20 ℃保存，其它4℃保存并避光；（2）Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核，提前两小时配，难溶；（3）在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI易透过细胞膜和核酸结合，为避免干扰染色前需用RNAse A降解RNA。
PI染色检测细胞周期试验步骤
.
染色检测细胞周期：protocolPI）消化收集对数生长期细胞（加热处含EDTA1、收集细胞：胰酶（*6个），吸取旧10理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×（根据培养皿大小决定量，PBS培养基到一个新离心管里；少量常温也要收集到上述离PBSPBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的然后胰酶消化心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；而不是成片脱落）显微镜下观察细胞呈单个，（注意一定要消化完全，后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。
PBS清洗细胞两次。
2、用预冷的重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮预冷的PBS3、固定细胞：用0.5ml乙醇终无水乙醇(1.2ml预冷的99.7%成单细胞，再将重悬细胞加入浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定至过夜。
2H1.84、细胞染色：离心（1000r/300g）收集固定的细胞，以5min才把细胞离mL的7000rpm(第一次实验时用PBS 洗细胞一次，离心1再次获取细胞沉淀后加入但最后流式结果显示细胞没有碎)心下来，30避光染色lPI，最后加入400μ30minlRNaseA00μ于37℃水浴℃均可）min（常温或4P用染色剂（据样本数，500uL 【有的试剂盒说明是：每个样本加入Triton 、A PI BS临时配好总量，其中50ug/ml、RNase 100ug/mL 染色30分钟】避光4）X-100
0.2% ℃、流式分析52
/ 1
.
结果用细胞万个细胞，2-3以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数
去FL2-A显示，和使用分析。
周期拟和软件ModFit分析时，FL2-w 除联体细胞。
2
/ 2。
PI染色检测细胞周期实验步骤
PI染色检测细胞周期实验步骤PI（Propidium Iodide）染色是一种常用的细胞周期分析方法，可用来定量分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。
下面是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤：实验步骤：1.细胞培养：将要进行细胞周期实验的细胞株在无菌条件下培养至富有活力的生长期，并确保细胞数目足够。
2.细胞收获：将培养皿中的细胞用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤2次，以去除残留的培养基和衰老细胞。
然后用细胞解离液将细胞从培养皿上彻底剥离。
3.细胞计数：采用显微镜或血球计算板等工具计数细胞数目。
确保每个实验条件下的细胞数相似。
4. 固定细胞：用70%（体积比）的乙醇在-20℃的环境中将细胞固定。
将乙醇均匀地加入细胞悬浮液中，一般细胞浓度为1×10^6/ml。
放置细胞悬液在-20℃的冰箱中固定1小时。
5.染色：将固定的细胞在室温下洗涤2次PBS。
制备PI染色液，可以选择适当的PI浓度（如50μg/mL）然后将染色液加入洗涤后的细胞悬液中，使之均匀包涵。
在黑暗中静置15分钟以便细胞充分染色。
6.流式细胞仪检测：使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测。
在流式细胞仪前，将细胞过滤，以去除聚团的细胞。
7.数据分析：使用流式细胞仪的软件或其他分析软件对所得数据进行细胞周期分析。
基于DNA含量，细胞可以被分为G0/G1、S和G2/M三个周期阶段，通过计算这些细胞的百分比可以得到细胞周期分布情况。
注意事项：1.实验要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.在染色时，应在黑暗的环境中操作，以避免PI受光照的影响。
3.使用流式细胞仪时，要注意正确设置仪器参数，以获取准确的测量结果。
4.实验前后仔细清洁工作区和实验设备，以防止交叉污染。
以上就是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤，根据实验的需求和细胞类型的不同，还可以对实验步骤进行适当的调整。
细胞周期检测
细胞周期
1、原理
碘化丙啶(Propidium Iodide，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。
碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
2、步骤
2.1细胞处理
悬浮细胞：收集悬浮细胞5~20×10⁵于离心管中，300 g/5min 离心，弃去培养液；
加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷) 洗涤一次，300 g/5min 离心，弃去上清，弹散
管底沉淀；
贴壁细胞：贴壁细胞弃去培养基，加入胰酶消化，待消化完全后，培养基终止消化，
吹散细胞，300 g/5min 离心，弃去培养液；加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷)洗涤
一次，300g/5min 离心，弃去上清，弹散管底沉淀；
2.2细胞固定
将用PBS洗涤好的细胞用250ul预冷的PBS重悬，吹打混匀，将预冷的750ul无水
乙醇缓缓滴入重悬的细胞内，混匀，-20℃固定过夜。
600 g/10min离心，沉淀细胞，
对于特定的细胞如果沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心
吸除上清，可以残留50μl左右的乙醇，以免吸走细胞。
加入约5ml冰浴预冷的PBS,
重悬细胞，离心收集细胞，小心吸除上清，可以预留50μl的PBS，以免吸走细胞。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2.3细胞染色
加入500ul FxCycle™ PI/RNase 染色溶液，混匀，室温孵育30min，上机检测。
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PI染色检测细胞周期
1)细胞样品的准备：
（1）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。
用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集
的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
再次收集到
离心管内。
1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果
细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除
上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约1毫升
冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。
再次离心沉淀
细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
（2）对于悬浮细胞：1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心
吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约1
毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。
再次离心
沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走
细胞。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2)细胞固定：将细胞加入到1毫升冰浴预冷70%乙醇中，快速轻轻吹打混匀，4℃
固定2小时或更长时间。
固定12-24小时可能效果更佳。
1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。
加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。
再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
3)碘化丙啶染色液的配制
4)染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉
淀，37℃避光温浴30分钟。
随后可以4℃或冰浴避光存放。
染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。
5)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同
时检测光散射情况。
采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
注意：
1.细胞个数在105到106之间。
2.细胞经乙醇固定后密度可能降低，所以沉淀细胞的离心力不能太低。