两种脲酶活性定性测定方法及比较
脲酶的测定方法
一、脲酶测定（比色法）脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6。
7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液）,保存于冰箱中.使用前,取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1。
9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0。
4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0。
1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理，加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7），仔细混匀.在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上)，摇荡，将悬液过滤.取滤液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10mL，然后加入4mL苯酚钠溶液，并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后，立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值.脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀，20min后显色,定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
大豆制品脲酶活性测定
（2）仪器与器皿
酸度计（pH计）：具有玻璃电极、 甘汞电极
恒温水浴：须能保持温度30±0.5℃ 试管：20×150mm并配有橡皮塞
（50mL）
（3）试剂
磷酸缓冲液0.05mol/L：称取 3.403gKH2PO4溶于100mL蒸馏水中。 再称取4.355gK2HPO4溶于100mL蒸馏 水中，合并两者并配成1000mL，用 强酸或强碱调节pH=7.0。
此时溶液应具有明亮的琥珀色； （过 段时间溶液会变为深橘红色，
可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶 液再次变为琥珀色）
（3）方法：
将一满匙样品放入表面皿中， 摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴 入表面皿中的样品上，直至完全浸 湿，停留5min，观察样品的颜色反 应。
如果红斑面积多于20%，则认为 该样品脲酶活性超标，为不合格产 品。
三、测定原理： 脲酶活性测定实际上是在一定条件
下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试 样、每分钟分解尿素所产生的氨的 量。
脲酶 NH2CONH2→→2NH3↑+CO2
•
四、测定方法： （一）定性法： 1、酚红法 （1）原理：
酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变 红，大豆制品中所含的脲酶pH=7.0， T=30℃时可将尿素水解产生氨，释 放的氨可使酚红指示剂变红，根据 变红的时间长短来判断脲酶活性的 大小。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）；
•1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
（4）注意事项： • 1.粉碎样品时，不应产生大量热，
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
大豆脲酶活性的两种不同测定方法的研究
万方数据
１．３．２滴定法（国标：标准编号Ｇ１３ｆＩ＇１３５６７８７—１９９７）嗍 ①实验原理：将粉碎的大豆样品与中性尿素缓
冲液混合，在（３０±０．５）ｏＣ下保持３０ ｒａｉｎ，样品中的脲 酶催化尿素分解产生氨，用过量的盐酸中和吸收氨。 再用氢氧化钠标准溶液回滴到溶液ｐＨ值为４．７０。
摘 要 将大豆粉在１４０℃温度下热处理不同时间，用滴定法和ｐＨ增值法测定了其中脲酶活 性。结果表明，同一样品用滴定法和ｐＨ增值法测得的脲酶活性在数值上不相等，不能直接互用，但在 一定条件下可以进行数值的相互代换。
关键词大豆；脲酶活性；滴定法；ｐＨ增值法 中图分类号￥８１６．４２
大豆是优质的植物性蛋白质饲料．它含有３５％。 ４０％的蛋白质、１５％。２０％的脂肪和２０％。３０％的碳 水化合物，并含有丰富的矿物质与维生素，因此素有 “植物肉”、“绿色的牛乳”之美誉，是目前世界范围内 动物饲料原料中最常用的植物性蛋白质类饲料【ｌ】。但 同时．大豆中也含有影响动物对饲料中营养物质的消 化、吸收和利用的抗营养因子，如脲酶、胰蛋白酶抑制 因子等。并且当抗营养因子的含量超过动物的耐受范 围时还会影响到动物的健康和生产性能。为此，我国 制定了专门的国家标准，如我国《饲料用大豆》标准 （ＧＢｌ０３８４—８９）规定：“饲料用大豆需加热后使用，脲 酶活性不得超过０．４ ＮＨ３ｍｇ／（ｇ·ｍｉｎ）”；我国《饲料用 大豆饼》标准（ＧＢｌ０３７９－－８９）和《饲料用大豆粕》标准 （ＧＢｌ０３８０－－８９）规定：“大豆饼和大豆粕的脲酶活性都 不得超过０．４ ＮＨｃｎｇ／（ｇ·ｍｉｎ）”。目前，在我国较广泛 使用的脲酶活性的测定方法主要有滴定法和ｐＨ增 值法，其中，滴定法是国家标准方法（标准编号ＧＢ／Ｔ １３５６７８７－－１９９７），具有仲裁性。但是由于滴定法要求 精度高，所用试剂品种较多，且配制复杂，测定过程中 操作时间较长，操作步骤较严格，给检测人员的批次 测定带来不便，难以迅速地指导生产。所以在实际生 产中，一般多用ｐＨ增值法测定脲酶活性。ｐＨ增值法 由于测定结果的准确度和精确度都不高，因此，不具 有仲裁性。为了更好的了解两种方法的利与弊．本文
脲酶的测定方法
脲酶的测定方法一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)
实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。
反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。
反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。
按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。
三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。
4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。
此溶液含NH3为40μmol·mL-1。
7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。
不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究
不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究杨奇慧舒璐钟剑锋摘要：用滴定法和增值法测定大豆粉在85℃和140℃下分别热处理0、45、90、135、180min的脲酶活性，并用0.2%KOH溶解法测定大豆粉在不同热处理下的蛋白质溶解度。
结果表明：在85℃条件下，处理0～180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着时间延长无明显变化；而在140℃条件下，大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着处理时间的延长显著降低。
通过测定结果可见，同一样品用滴定法和增值法测得的脲酶活性在数值上不相等，不能互用，但蛋白质溶解度更能反映大豆粉受热过度的程度。
关键词：大豆粉；脲酶活性；蛋白质溶解度；pH增值法；滴定法众所周知，大豆含有较丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等，是饲料生产中主要的植物蛋白质源之一，具有较高营养价值。
但是，大豆中含有多种抗营养因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃肠胀气因子、抗维生素因子、抗原蛋白等，这些抗营养因子阻碍营养物质在动物体内的利用，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不仅会降低饲料营养成分的消化率和适口性，而且也会影响动物对蛋白质的消化吸收，对动物生长发育也产生不良的影响。
但是，胰蛋白酶抑制因子的测定较困难，而豆粕中脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子活性呈正相关，所以通常通过测定脲酶活性来反映蛋白酶抑制因子的活性。
目前，脲酶活性的测定方法有滴定法（国标法）、pH增值法等，目前，对脲酶活性不同测定方法差异性的研究较少，本文拟对两种方法进行研究，以比较不同方法对测定结果的影响，为实际生产和理论研究提供依据和参考。
1 材料和方法1.1 实验材料大豆粉：将生大豆粉碎，过60目标准筛。
在85℃和140℃下分别处理0、45、90、135和180min冷却后装入封口袋保存备用。
1.2 化学试剂本实验所用试剂均为分析纯（AR），实验用水为蒸馏水。
1.3 测定方法1.3.1 pH增值法实验原理：将研细的试样与尿素缓冲液混合，尿素在尿素酶作用下水解产生氨，使溶液pH 值改变，改变的程度与脲酶活性大小相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低，单位为△pH值。
脲酶活性
随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。
判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。
脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。
脲酶活性没有负值，最低为0。
在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。
国内很多大企业一般均采用0.2。
实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。
目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。
一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
大豆制品脲酶活性测定解读
样品粉碎：至少60%通过400微米 试验筛。 （4）操作步骤 准确称取0.400±0.00lg样品2份， 分别置于2支试管中。一支试管加入 20mL磷酸缓冲液，作为空白试验（A 管），另一支加入20mL尿素缓冲液 （B管）。
盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准 确保持30min。在此期间，每隔5min 摇匀一次。取出立即在流水中冷却， 5min内测定溶液pH值。
（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品， 最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。
（二）定量法 1、 pH增值法 （1）原理： 脲酶水解尿素产生氨，使溶液的 pH值升高，通过测定样品溶液的pH 值和空白的pH值之差来计算脲酶的 活性。脲酶活性定义为：在30℃和 pH=7的条件下，每分钟每克大豆制 品分解尿素后所释放的氨态氮的毫 升数。
高温、高湿、高压，粒度小，时间 长脲酶活性低。但是，加工过度， 一些氨基酸会被豆制品质量较差。
三、测定原理： 脲酶活性测定实际上是在一定条件 下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试 样、每分钟分解尿素所产生的氨的 量。
脲酶 NH2CONH2→→2NH3↑+CO2
（5）计算 UA=pH(B管)-pH(A管)
2、滴定法 （1）原理： 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓 冲溶液混合，在30℃保持30min后， 尿素酶催化尿素水解产生氨，用过 量的盐酸溶液中和氨，再用氢氧化 钠标准溶液回滴。
（2）脲酶活性定义 在30℃和pH＝7的条件下，每分 钟每克大豆制品分解尿素后，所释 放的氨态氮的毫克数。
（3）方法： 粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
论文试验方法
脲酶测定方法（参考土壤脲酶活性两种测定方法的比较）比色法标准曲线：以尿素为基质，根据脲酶酶促产物氨在碱性介质中，与苯酚一次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂存在下)生成蓝色的靛酚来分析脲酶活性[6]。
精确称取0．471 7 g硫酸铵溶于水并稀释至1 000mL，则得含氮0．1 mg／mL的标准液。
绘制标准曲线时可再将此液稀释10倍供用。
吸取稀释的标准液1、3、5、7、9、11、13 mL，移于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至20 mL，再加4 mL 苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20 min后显色、定容。
1 h内在分光光度计上波长578 nm处比色。
以光密度值为纵坐标、以氨的浓度为横坐标绘制标准曲线。
步骤：取5 g风干土盛于50 mL三角瓶中，加入1 mL甲苯。
15 min 后加10 mL 10％尿素溶液和20 mL pH值6．7的柠檬酸盐缓冲液，摇匀，在37℃恒温箱中培养24 h。
过滤后取3 mL滤液注入50 mL容量瓶中，加蒸馏水至20 mL。
再加4 mL苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20 min后显色、定容。
l h内在分光光度计上波长578 nm处比色。
脲酶活性：以24 h后1 g土壤中含NH3一N的毫克数表示。
NH3一N(mg)=2a (1)式中：a为从标准曲线查得的NH3一N毫克数；2为换算成1 g土的系数。
脱氢酶活性测定（1）TPF标准曲线的绘制（2）与干净的20mL据塞试管中，依次加入2mL0.5MTris-HCL缓冲液（pH=7.6）、2mL蒸馏水和2mL不同浓度的TTC标准溶液（2、4、8、12、16、20、24mg/mL），然后加入0.1g低亚硫酸钠（保险粉），振荡摇匀。
待充分显色后，加入5mL甲苯，振荡萃取TPF，上清液于485nm处测定吸光度值。
以TPF的浓度为横坐标，以OD485值为纵坐标绘制标准曲线。
（3）操作步骤称取5g土壤样品，置于干净具塞试管中，每支试管加入2mL1%的TTC溶液，2mL蒸馏水，充分混匀。
脲酶定性的实验
脲酶定性的实验随着膨化技术在饲料工业中推广普及,越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉,与其它蛋白资源一样,大豆的适度熟化非常重要,熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子,熟化度过高又会导致氨基酸利用率低.判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性.脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下,每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数.脲酶本身无营养意义,但它与抗胰蛋白酶的含量接近,并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似,因此,尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标.脲酶活性没有负值,最低为0.在我国现行的国标推荐值为0.3,在美国一般认为以不超过0.2为宜,并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12,当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受.国内很多大企业一般均采用0.2.实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂,有滴定法和pH增值法两种,已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等.目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性,一般来说,主要有如下两种方法.一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1尿素:GB696,分析纯.2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红,加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液,在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀备用.3.操作方法3.1取0.2g粉末样品,置于25mL比色管中.3.2加0.02g尿素,加酚红指示剂2滴,再加水20mL,充分摇匀15s.3.3记录粉红色出现时间,并根据时间判断尿酶活性,颜色出现时间应少于15min. 颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验.样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品),只有上述空白正常时,即酚红指示剂不改变颜色,试验结果才是可靠的.一般企业认为7、8分钟变色较为合适.二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N.2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色.3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂,注意溶液必须呈明亮的琥珀色.若溶液已转变为深桔红色,滴人稀硫酸溶液并搅拌之,直至溶液再度呈琥珀色.3.2量一匙粉末样品,放置于培养皿中.3.在样品上加入两匙试剂,轻轻搅拌,将样品平铺于培养皿中.若仍有干样品斑点,则再加入试剂,直至将样品浸湿.4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟,若仍无红点出现,说明大豆粉过熟.b. 有少量红点：少量尿素酶活性,可用.c. 样品表面约有25％为红点覆盖：少量尿素酶活性,可用.d. 豆饼表面约有50％为红点覆盖：尿素酶活性较高,不可以使用.e. 豆饼表面的75％－100％为红点覆盖：尿素酶活性很高,样品过生,不能使用. 以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用,尤其是后者在膨化大豆粉生产的在线检测上很普遍.尽管这两种方法原理一样,但是,因其操作过程差异,所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同.三、液态法和半固态法之比较首先需要说明的是,这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称,笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法,对前者可以称之为“试管法”,后者称之为“表面皿法”,根据其实施的过程及样品的状态,笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”.从实施方法来看,液态法是过程检测,从开始一直到规定时间段结束,而半固态法属于断点检测,是5分钟后看结果；液态法通过控制各个体合格,总体自然合格,而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格,即允许部分个体不合格.简单地说,液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色,如果一个不合格,整个批次为不合格；而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色,部分不合格,总体可以是合格的.从这点上来说,液态法对膨化大豆粉的品质要求更高,控制更严格,不仅要求熟化,而且要均匀熟化.举例说明,如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量（可以是一粒）生大豆粉,液态法会立即变色从而判定为不合格,而半固态法只是增加了一个变色点,总体上仍是合格的.从上可以看出,这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的.半固态法反映的是产品符合统计学上的合格,而液态法反映的是完全合格.这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的,液态法要求设备能均匀熟化,而半固态法允许产品出现部分不合格,只要总体上符合就可以,对膨化设备的要求自然要低. 可能会有人疑问,膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗?其实不然,物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化,机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多,如果结构设计上缺陷或部件磨损,就会导致熟化不均匀.目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右（对家禽和猪要求可能低点）,六年前,笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度,用液态法检测仍不合格,出来的料有熟的,有褐变的,还有少许夹生的,如果用半固态法检测,估计就合格了.次年,一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉,因不熟被退货六十吨,根据大部分企业采用半固态法检测的情况,将其以一定比例掺入熟化料中,最终符合统计学上的合格.上述事件,大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧.脲酶urease（水解酶）：脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里.它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解.脲酶的作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和碳酸.土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关.根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤.人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况.土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得.本方法是测定生成的氨量.试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素,用水溶至100ml.3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水.将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升.4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用乙醇稀释至100毫升（A）,存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）.将AB溶液保存在冰箱中.使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升.5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定.6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml 含有0.1mg氮的标准液标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml,定容至100ml,即稀释了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠,仔细混合,加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度.将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图.取新鲜土壤7份,每份30g,装于棕色广口瓶中,先将1,3－二氯丙烯溶于丙酮（定量）,6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1,3－二氯丙烯,使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500µg/g,另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照,然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量,以便补充水分）.放置于25℃恒温培养箱,培养后第0d、1d,5d,10d（前10d密封,后来测定的敞口）、20d,30d,40d,50d分别取土样检测脲酶的活性.取样前,反复旋转广口瓶,混匀土样,一个处理随机取3个重复.1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中.2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7）,并仔细混合4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中,培养24h5) 培养结束后,用热至38摄氏度水稀释至刻度,仔细摇荡,并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中.6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中,加入10ml蒸馏水,充分震荡,然后加入4ml苯酚钠,仔细混合,再加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度,溶液呈现（青定）酚的蓝色.7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽,于578nm处将显色液进行比色测定.8) 无土对照：不加土样,其他操作与样品实验相同.以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照9)无基质对照：以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同.每个土样都设此对照.结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示.M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10式中：M－土壤脲酶活性值X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时,本法能获得可靠结果.当脲酶活性小于3微克NH3-N,培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示.NH3-N（mg）＝a*2A：从标准曲线查得NH3-N毫克数2 ：换算成1k土的系数.。
大豆脲酶活性的两种不同测定方法的研究
烈摇 动， 于（０ ０５ ）ｃ 置 ３ ± ． ｃ恒温水 浴中 ， ０ 每隔 ５ｍ ｎ振摇 ｉ
王忠艳 ， 单位及 通讯地址 同第一作者。
收稿 日期 ：０ ７ ２ ｌ ２ ｏ 一ｌ 一 ０
因子 等 ． 且 当 抗 营 养 因子 的 含 量 超 过 动 物 的 耐 受 范 并 围时 还 会 影 响 到 动 物 的 健 康 和 生 产 性 能 。 为 此 ． 国 我
１ 大 豆 粉 样 品 ． １将 普通 市售生 大豆粉 碎 （ 非强 热 ） ４ 过 ０目标 准分 析 筛 。在 １０ｃ 分 别 处 理 ０ ３ ６ ９ １ 、５ １ 、 １ ４ｃ下 、 、 、 、２ １ 、８ ２ 、
测定 ， 可及 时修 订配合 饲料生 产过程 中对大 豆及其 制
品 的正 确 加工 及使 用方 法 ． 经济 、 有效 地 消 除抗 营养
因 子 的 抗 营养 作 用 。
１ 材 料 与 方 法
同时 ， 大豆 中也含有 影响 动物对饲 料 中营养物 质的消 化、 吸收和利 用 的抗 营养 因子 ， 如脲 酶 、 蛋 白酶 抑制 胰
（ Ｂ１３ ４ ８ ） 定 ： 饲 料 用 大 豆 需 加 热 后 使 用 ， ６ 、２ ７ 、８ ８ 、４ ８ ｉ ， Ｇ ０ ８－ ９ 规 “ 脲 ９ ７ 、５ ７ 、 １８ 、７ｍ ｎ 冷却 后装入封 口袋备用 。
１２ 化 学 试 剂 ．
大豆 饼 》 准 （Ｂ ０ ７ － ８ ） 《 料用 大豆 粕 》 准 标 Ｇ １ ３９ ９和 饲 标 ｆ Ｂ ０ ８ － ８） Ｇ １３ ０ ：９规定 ：大 豆饼 和大 豆粕 的脲 酶活 性都 － － “
２ ２ ３ ３ ３ ３ ４２、 ５、 ８、 ４、 ７、 ０、 ３、 ６、 ９、 ４ ４ ５１、４ 、 ７、 ０、 ３、 ６、 ５ ５ ６ ６ ６
脲酶定性实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的催化特性，掌握脲酶催化反应的原理；2. 掌握脲酶定性实验的操作方法；3. 通过实验观察脲酶催化反应的现象，验证脲酶的催化活性。
二、实验原理脲酶是一种催化脲水解的酶，其催化反应的化学方程式为：脲+ H2O → CO2 + NH3在本实验中，我们利用脲酶催化脲水解产生CO2和NH3的特性，通过观察溶液pH 的变化来验证脲酶的催化活性。
当脲酶催化脲水解时，生成的NH3会与溶液中的酸反应，使溶液pH值升高，当溶液pH值达到一定范围时，指示剂会发生颜色变化，从而验证脲酶的催化活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）脲酶试剂；（2）脲标准溶液；（3）NaOH标准溶液；（4）酚酞指示剂；（5）pH计；（6）锥形瓶；（7）移液管；（8）烧杯。
2. 实验仪器：（1）分析天平；（2）滴定管；（3）水浴锅；（4）磁力搅拌器。
四、实验步骤1. 配制脲酶溶液：将脲酶试剂溶解于适量的去离子水中，配制成一定浓度的脲酶溶液。
2. 配制脲标准溶液：准确称取一定量的脲，溶解于去离子水中，配制成一定浓度的脲标准溶液。
3. pH计校准：将pH计置于水浴锅中，加入去离子水，用pH计测量水的pH值，根据测量结果校准pH计。
4. 取锥形瓶，加入一定量的脲标准溶液。
5. 用移液管加入一定量的脲酶溶液，使脲酶与脲反应。
6. 将锥形瓶放入水浴锅中，保持一定的温度，使反应进行。
7. 在反应过程中，用pH计测量溶液的pH值，观察pH值的变化。
8. 当溶液pH值达到一定范围时，加入酚酞指示剂，观察溶液颜色变化。
9. 记录实验数据，包括脲酶溶液浓度、脲标准溶液浓度、反应时间、溶液pH值等。
五、实验结果与分析1. 实验现象：在脲酶催化下，脲水解产生CO2和NH3，使溶液pH值升高，当溶液pH值达到一定范围时，加入酚酞指示剂，溶液颜色由无色变为粉红色。
2. 结果分析：通过实验观察到，脲酶催化脲水解反应具有明显的催化活性，能够使溶液pH值发生变化，且加入酚酞指示剂后溶液颜色发生变化，进一步验证了脲酶的催化活性。
两种脲酶活性定性测定方法及比较
两种脲酶活性定性测定方法及比较随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。
判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。
脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。
脲酶活性没有负值，最低为0。
在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。
国内很多大企业一般均采用0.2。
实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。
目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。
一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
土壤脲酶活性两种测定方法的比较
土壤脲酶活性两种测定方法的比较丰 骁1,段建平2,蒲小鹏1,邹 雨1,李春荣1(1.甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州 730070;2.清水县农牧局,甘肃天水 741400) 摘要:利用比色法和扩散法对金强河地区和甘肃农业大学校园内的土壤脲酶活性进行了分析。
结果表明:比色法和扩散法测定的土壤脲酶活性平均值分别为(0.531±0.207)mg/g和(0.446±0.204) mg/g,两种测定方法的结果和变异系数差异均不显著(P>0.05)。
但从试验操作方面考虑,扩散法操作比较简单、所用药品种类少、时间短,是一种比较可行的土壤脲酶活性测定方法。
关键词:脲酶活性;比色法;扩散法 中图分类号:S154.2 文献标识码:A 文章编号:100925500(2008)022******* 土壤酶是存在于土壤中的生物催化剂,土壤中所进行的一切生物化学过程都要经过酶的催化才能完成。
脲酶作用是极为专性的,它能水解土壤中的尿素,生成氨,二氧化碳和水[1-7],因此,脲酶测定可为退化草地生态评价提供参考。
土壤脲酶活泩的测定方法较多[6],常用的方法有比色法,扩散法和电极法等,根据试验仪器的普遍性和易操作性,分别用比色法和扩散法对土壤样品脲酶活性进行了对比分析。
1 材料和方法1.1 试验地概况 土壤采样地点2个,甘肃农业大学天祝高山草原定位试验站(样地Ⅰ)和甘肃农业大学牧草引种圃(样地Ⅱ)。
2007年4月中旬,分别在2个样地采集土样。
用五点混合采样法采集土样,均为0～20cm处表层土壤,采集后风干,弃去砂石和植物残体,过1mm筛后放在通风、干燥处待测。
1.1.1 甘肃农业大学天祝高山草原试验站概况 该试验站地处E102°23′～102°29′,N37°11′～37°13′,海拔2950～4300m;年均温-0.1℃,年降水量416 mm,年蒸发量1592mm,常发生春旱;无绝对无霜期; 收稿日期:2007209221;修回日期:2007211205 基金项目:草业生态系统教育部省部共建重点实验室项目资助 作者简介:丰骁(19822),男,江苏南通人,在读硕士。
土壤脲酶活性两种测定方法的比较
本文通过比色法和扩散法对金强河地区和甘肃农业大学校园内的土壤脲酶活性进行了测定和分析。结果表明，比色法和扩散法测定的土壤脲酶活性平均值分别为（0.3±0.027）mg/g和（0.4-0.024）mg/g，两种测定方法的结果和变异系数差异均不显著（P＞0.05）。从试验操作方面考虑，扩散法操作比较简单、用药品种类少、时间短，是一种比较可行的土壤脲酶活性测定方法。土壤酶是存在于土壤中的生物催化剂，对土壤中的生物化学过程起着催化作用。脲酶能水解土壤中的尿素，生成氨、二氧化碳和水，因此脲酶测定可为退化草地生态评价提供参考。本文还简述了试验地的概况，包括地理位置、气候条件、土壤类型等信息，并详细介绍了土壤样品的采集和处理方法。通过五点混合采样法采集了表层土壤，经风干、去砂石和植物残体、过筛等处理后，用于后续的土壤脲酶活性测定。
脲酶活性的测定
3、样品试验与空白试验的制备应相 隔5分钟，并且每隔5分钟搅拌内 容物一次。
4、30分钟后，相隔5分钟将样品与空 白试验的称量瓶从水浴中取出，将 上层液体移入5ml烧杯中，在从水 浴中取出刚达5分钟时，分别测定 此种上层液体的PH值。
六、结果的计算
1、计算公式：
样品试验的PH值与空白试验的PH值 两者之间的差异，则为脲酶活性的指数， 即：
脲酶活性 = 试样的PH测定值-空白的PH测定值
2、重复性：
每个样品应取两个平行样测定， 以其算术平均值为结果。
七、注意事项
1、关于酸度计的使用
2、称量瓶应塞紧 3、关于固定质量称量法 4、通常： 0.02<△PH≤0.3 加工适度 △PH<0.02 加工过度 △PH>0.3 加工不够 BACK
1、样品试验： 准确称取0.200±0.001g样品 于称量瓶中，加入10ml尿素缓冲 溶液，加塞混合，然后置于30℃ 水浴中，在混合操作时称量瓶切 勿倒置。
2、空白试验： 准确称取0.200±0.001g样品于 称量瓶中，加入10ml0.05mol/L磷 酸盐缓冲溶液，加塞混合，置于 30℃水浴中。
三、仪器及试剂
1、仪器
分析天平、样品粉碎机、样品分析 筛、恒温水浴、酸度计、称量瓶、 移液管、角匙等
2、试剂
0.05mol/L磷酸盐缓冲液、尿素缓 冲溶液等
四、试样的选取和制备
选取具有代表性的试样，粉碎至40 目，用“四分法”缩减至200～300g， 密闭保存，以防试样组分变化或变质。
五、测定步骤
实验三 大豆制品中脲酶活性的测定20来自0.10.30一、实验目的
1、掌握大豆制品中脲酶活性的测 定原理 2、熟悉掌握用PH增值法测定大豆 制品中脲酶活性
脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法
MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性 pH增值法盐酸中和法MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法1.适用范围本方法适用于大豆饼粕类脲酶活性的测定。
2.方法一2.1.术语脲酶活性：在规定的操作条件下，使试样中的脲酶分解尿素释放出氨基氮，以溶液pH值的变量表示。
2.2.原理概要将研细的试样与缓冲尿素溶液混合，在30℃作用30min后，测定溶液的pH值。
2.3.主要试剂和仪器2.3.1.主要试剂磷酸缓冲溶液：将3.403g KH2PO4和4.355g K2HPO4溶解并稀释至1000mL。
临用前，以强酸或强碱调节其pH至7.0，其使用期限不超过90d；缓冲的尿素溶液：溶15g尿素（NH2CONH2）于500mL磷酸缓冲溶液中。
加入5mL甲苯，用于防腐和防止霉菌生长。
按上法调节其pH至7.0。
2.3.2.仪器分析天平：感量0.1mg；研磨器：易于清理，研磨过程中不发热，并能达到要求的磨粉细度；恒温水浴：能控制于30±0.5℃；pH计：备有玻璃电极和甘汞电极，灵敏度不低于±0.02pH单位，同时附有温度补偿；试管：直径22mm，长150mm，具橡胶塞；烧杯：容量10mL；单刻度移液管：10mL；精密计时器；标准筛。
2.4.试样的制备用研磨器将约10g的样品，在不升高温度的条件下尽可能研细，使其通过60目标准筛的量不少于60％。
收集全部磨碎物于广口瓶中，小心混合并立即进行分析。
2.5.过程简述准确称取试样0.200g，放入试管内，加10mL缓冲的尿素溶液，塞好橡胶塞，混匀。
置于30±0.5℃水浴中，记下时间。
隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。
另称试样0.200g，放另一试管内，加10mL磷酸缓冲溶液，塞好橡胶塞，混匀，作为空白试验。
与上管间隔5min置于同一水浴中。
在消化过程中，每隔5min将试管内容物都摇匀一次。
大豆制品脲酶活性测定 PPT
（4）注意事项： • 1.粉碎样品时，不应产生大量热，
否则会影响结果判定； • 2.称量样品时，一定要将样品混合
均匀，否则会造成试验误差； • 3.试样和空白试验同时操作，过程
要迅速，防止时间影响。
2、尿素酚红法 （1）原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2
时由黄变红，大豆制品中所含的尿 素酶可将尿素水解产生氨，释放的 氨可使酚红指示剂变红，根据变红 样品占所有样品的比例来判断脲酶 活性的大小。
（2）仪器和试剂： • 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热 • 分析天平：感量0.01g • 25ml纳式比色管 • 恒温水浴锅 • 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于
100ml 95%乙醇溶液 • 结晶尿素：分析纯
（3）方法：
粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）；
•1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，
最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
两种脲酶活性定性测定方法及比较
随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。
判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。
脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。
脲酶活性没有负值，最低为0。
在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。
国内很多大企业一般均采用0.2。
实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。
目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。
一.液态法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂
2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂
2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；
2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法
3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性
1min 极强
1～5min 强
5～15min 稍有
15min 无
同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
一般企业认为7、8分钟变色较为合适。
二、半固态法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂
2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。
2.2尿素一酚红试剂
2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；
2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；
2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；
2.2.4用蒸馏水稀释至2L；
2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；
2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；
2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。
3.操作方法
3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。
若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。
3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。
3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。
若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。
4.放置5分钟后观察：
a.没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。
b.有少量红点：少量尿素酶活性，可用。
c.样品表面约有25％为红点覆盖：少量尿素酶活性，可用。
d.豆饼表面约有50％为红点覆盖：尿素酶活性较高，不可以使用。
e.豆饼表面的75％－100％为红点覆盖：尿素酶活性很高，样品过生，不能使用。
以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用，尤其是后者在膨化大豆
粉生产的在线检测上很普遍。
尽管这两种方法原理一样，但是，因其操作过程差异，所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同。
三、液态法和半固态法之比较
首先需要说明的是，这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称，笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法，对前者可以称之为“试管法”，后者称之为“表面皿法”，根据其实施的过程及样品的状态，笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”。
从实施方法来看，液态法是过程检测，从开始一直到规定时间段结束，而半固态法属于断点检测，是5分钟后看结果；液态法通过控制各个体合格，总体自然合格，而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格，即允许部分个体不合格。
简单地说，液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色，如果一个不合格，整个批次为不合格；而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色，部分不合格，总体可以是合格的。
从这点上来说，液态法对膨化大豆粉的品质要求更高，控制更严格，不仅要求熟化，而且要均匀熟化。
举例说明，如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量（可以是一粒）生大豆粉，液态法会立即变色从而判定为不合格，而半固态法只是增加了一个变色点，总体上仍是合格的。
从上可以看出，这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的。
半固态法反映的是产品符合统计学上的合格，而液态法反映的是完全合格。
这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的，液态法要求设备能均匀熟化，而半固态法允许产品出现部分不合格，只要总体上符合就可以，对膨化设备的要求自然要低。
可能会有人疑问，膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗？其实不然，物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化，机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多，如果结构设计上缺陷或部件磨损，就会导致熟化不均匀。
目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右（对家禽和猪要求可能低点），2001年，笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度，用液态法检测仍不合格，出来的料有熟的，有褐变的，还有少许夹生的，如果用半固态法检测，估计就合格了。
次年，一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉，因不熟被退货六十吨，根据大部分企业采用半固态法检测的情况，将其以一定比例掺入熟化料中，最终符合统计学上的合格。
上述事件，大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧。