第二章 核酸的基本操作技术

③EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制 的螯合剂，可抑制DNA酶的活 酶 防止DNA被酶降解。 被酶降解。 性，防止 被酶降解 ④NaOH-SDS NaOH：强碱，提供 ：强碱，提供pH>12的碱性条件，使 的碱性条件， 的碱性条件 DNA双链变性。 双链变性 双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白， 合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括 复合物， 合成“蛋白 复合物 使蛋白质（ DNA酶）变性沉淀。 酶 变性沉淀。
（2）质粒拷贝数 ） 这是直接决定DNA产量的重要因素之一。 产量的重要因素之一。 这是直接决定 产量的重要因素之一 质粒本身的性质所决定。 质粒本身的性质所决定。
（3）质粒大小 ） 分子量大的质粒，拷贝数少。 分子量大的质粒，拷贝数少。
若干常用质粒的理论产量 质粒名 pGEM pUC pBR322 ColE1 pACYC pSC101 分子大小bp 拷贝数 分子大小 2700 2700 4400 4500 4000 9000 300-700 500-700 >25 >15 ≈10 ≈6 质粒产量 µg/ml 1.8-4.1 2.9-4.1 >0.32 >0.15 ≈0.09 ≈0.12
有时还需要加入CTAB（十六烷基三乙基溴化铵） 除 （ 十六烷基三乙基溴化铵） 有时还需要加入 去细菌多糖。 去细菌多糖。 基本原理： 可溶解细胞膜， 基本原理：CTAB可溶解细胞膜，与核酸形成复合物， 可溶解细胞膜 与核酸形成复合物， 在高盐溶液中是可溶的；在低盐溶液中沉淀， 在高盐溶液中是可溶的；在低盐溶液中沉淀，通过离心就 可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开； 与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开； 可将 与核酸的复合物同蛋白质 然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液， 然后将 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液 入乙醇使核酸沉淀， 溶于乙醇。 入乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇。 溶于乙醇 特点：能较好的去除糖类杂质， 特点：能较好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材料 最为合适;在提取前期能同时得到高质量的 最为合适 在提取前期能同时得到高质量的DNA及RNA 在提取前期能同时得到高质量的 及
动物细胞DNA的提取 （五）动物细胞 的提取 提纯的思路： 提纯的思路： 动物DNA的特性：分子量较大，易断，提取 的特性：分子量较大，易断， 动物 的特性 过程中应尽量避免剧烈的搅拌， 过程中应尽量避免剧烈的搅拌，并注意抑制组织 的活性。 中DNase的活性。 的活性 要去除的杂质： 要去除的杂质：RNA、蛋白、多糖、脂类及 、蛋白、多糖、 各种小分子杂质。 各种小分子杂质。
（二）DNA提取的一般步骤 提取的一般步骤
准备生物材料： 准备生物材料： 选用的材料应处于提取DNA得率最高的生长期。如： 得率最高的生长期。 选用的材料应处于提取 得率最高的生长期 提取大肠杆菌质粒 提取大肠杆菌质粒DNA，菌液应培养至对数生长后期 测定 ，菌液应培养至对数生长后期(测定 质粒 对数生长后期 提取植物 植物DNA，最好选取幼嫩的部分。 幼嫩的部分 OD600值）；提取植物 值 ，最好选取幼嫩的部分。 裂解细胞： 裂解细胞： 对于原核生物可用溶菌酶、冰冻和超声波等法；对于 对于原核生物可用溶菌酶、冰冻和超声波等法； 结构复杂的动植物材料先粉碎，然后用液氮研磨或匀浆。 结构复杂的动植物材料先粉碎，然后用液氮研磨或匀浆。 分离和提取DNA： ： 分离和提取 氯仿等抽提； 总DNA，酚／氯仿等抽提； ， 叶绿体／线粒体DNA，一般采取先提纯细胞器，再溶解 叶绿体／线粒体 ，一般采取先提纯细胞器， 细胞器膜，待释放出细胞器DNA后，再进一步提取纯化之。 细胞器膜，待释放出细胞器 后 再进一步提取纯化之。 质粒DNA，要将其与染色体 分开。 质粒 ，要将其与染色体DNA分开。 分开
第四步： 第四步：离心除去沉淀 上清液中含有闭合质粒DNA。 。 上清液中含有闭合质粒 第五步：纯化DNA 第五步：纯化 酚-氯仿抽提。 氯仿抽提。 氯仿抽提 第六步：沉淀DNA 第六步：沉淀 0.6倍体积的异丙醇或 倍体积的乙醇。 倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇 倍体积的异丙醇或 倍体积的乙醇。
细菌总DNA的制备（E.coli） 的制备（ （三）细菌总 的制备 ）
1.菌体培养 将活化的菌体接种于 菌体培养: 将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani) 菌体培养 培养基，于37 oC培养至对数生长期 然后置冰水浴20min 培养基， 培养至对数生长期,然后置冰水浴 培养至对数生长期 然后置冰水浴 2.收集菌体 离心 收集菌体: 离心(5000 g， 5 min) (50 ml) 收集菌体 ， 3.菌体裂解 加5ml冷 TES(0.1 M Tris-HCl,0.1 M EDTA， 菌体裂解: 菌体裂解 冷 ， 0.15 M NaCl，pH 8.0)加10 mg 溶菌酶，于37 oC 温育 min 溶菌酶， 温育10 ， 加 4.去RNA: 去 加入1 加入 mg RNaseA，于室温温育 min ，于室温温育15 5.去蛋白 加入 去蛋白: 加入0.6 ml 10% SDS和Protease K(0.1mg/ml)， 去蛋白 和 ， 50 oC，3h，加苯酚 氯仿抽提 等体积 氯仿抽提(等体积 ， ，加苯酚-氯仿抽提 等体积) 6.沉淀 沉淀DNA: 加入 加入1/10 V 的NaAc，2 V 无水乙醇以玻璃 沉淀 ， 棒缠绕絮状沉淀，溶于 棒缠绕絮状沉淀，溶于TE Buffer中 中
变性
2 、所用的试剂作用 ① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的 ， 糖苷键 中的β 糖苷键。 聚糖中的β-1，4糖苷键。 在碱性条件（ 在碱性条件（pH>8）下有活性。 ）下有活性。 ② 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压 渗透压， 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 粘度 DNA受机械力（震荡）的作用而降解。 受机械力（震荡）的作用而降解。 受机械力
细菌质粒DNA的提取 的提取—— 碱裂解法 （四）细菌质粒 的提取 提取的思路： 提取的思路： 质粒的特性：共价闭合、环状的小分子量 质粒的特性：共价闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 要去除的物质： 基因组DNA（调节 从12.6降到 左右） （调节pH从 降到7.0左右 基因组 降到 左右） 蛋白质（ 和蛋白酶变性， 蛋白质（SDS和蛋白酶变性，苯酚 氯仿 和蛋白酶变性 苯酚-氯仿 抽提） 抽提） 脂类及小分子杂质（乙醇等） 脂类及小分子杂质（乙醇等） RNA（RNase) （
⑤ NaAc-HAc缓冲液 缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到 。用来中和 冰醋酸把醋酸钠溶液的 调到4.8。用来中和 调到 NaOH变性液，使DNA复性。 变性液， 复性。 变性液 复性 ⑥ 酚-氯仿 氯仿 蛋白变性剂，进一步抽提 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白 溶液中的蛋白 质，使蛋白质沉淀。 使蛋白质沉淀。 苯酚用来抽提蛋白，氯仿用来抽提苯酚。 苯酚用来抽提蛋白，氯仿用来抽提苯酚。
⑨ TE缓冲液 缓冲液 DNA保存液。 保存液 保存 配制。 由Tris-HCl和EDTA配制。 和 配制 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼 不含金属离子（ 不含金属离子 酸缓冲液），有利于以后操作； 酸缓冲液），有利于以后操作； ），有利于以后操作 EDTA抑制 抑制DNA酶，防止 被酶降解。 抑制 酶 防止DNA被酶降解。 被酶降解
第二章 核酸的基本操作技术
本章的主要内容
• 核酸的提取 • 核酸的检测与保存 • 核酸的凝胶电泳 • 核酸的分子杂交
第一节 核酸的提取
一、DNA的提取 的提取 二、RNA的提取 的提取
一、 DNA的提取 的提取
DNA是生物的主要遗传物质，因而 是生物的主要遗传物质，因而DNA的制 是生物的主要遗传物质 的制 备是基因工程的基础。由于生物形式的多样性 备是基因工程的基础。 细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存 ），以及 （细菌、植物、动物），以及 在生物体中存 在形式的差异（染色体、线性 ），因 在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因 、质粒）， 制备DNA的过程和方法也不相同。 的过程和方法也不相同。 此，制备 的过程和方法也不相同
1、原理 、
DNA双链 双链
变性 强碱 中性 复性 DNA单链 DNA单链
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 ， 闭合环状的质粒 分离，复性快； 分离，复性快；
染色体线性 变性后双链分离， 染色体线性DNA变性后双链分离，难以 线性 变性后双链分离 复性而形成缠绕的结构，与蛋白质 ，在离心的时候沉淀下去。 沉淀下去 合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
3、碱抽提法提取质粒DNA的步骤 、碱抽提法提取质粒 的步骤 第一步： 第一步：溶菌 使用“溶液Ⅰ 溶解细菌细胞壁 溶解细菌细胞壁。 使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。 Solution I 的配制： 的配制： 50mM葡萄糖， 葡萄糖， 葡萄糖 25mM Tris-HCl(pH8.0)， ， 10mM EDTA， ， 4-5mg/ml溶菌酶， 溶菌酶， 溶菌酶 RNase A
⑦ 乙醇 用于沉淀 用于沉淀DNA。 沉淀 。 DNA分子以水合状态“溶于”水里， 分子以水合状态“溶于”水里， 分子以水合状态 乙醇能夺去DNA分子的水环境。 分子的水环境。 乙醇能夺去 分子的水环境 ⑧ RNase A 降解RNA渣滓。 渣滓。 降解 渣滓 以免提取后的DNA中含有小分子的 中含有小分子的RNA。 以免提取后的 中含有小分子的 。
第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 第二步：破膜，蛋白质和 变性 溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 变性。 溶液 破坏细胞膜，蛋白质和 变性 Solution II 的配制（现用现配）： 的配制（现用现配）： 0.2M NaOH，1.0%SDS ， 第三步：中和 第三步： 溶液III使 复性、 溶液 使DNA复性、并促使蛋白质 复性 并促使蛋白质-SDS复合物 复合物 和染色体DNA、RNA沉淀。 、 沉淀。 和染色体 沉淀 Solution III的配制： 的配制： 的配制 3M 醋酸钠（用冰醋酸调 至4.8） 醋酸钠（用冰醋酸调pH至 ）