色谱柱相关知识
GC色谱柱基础知识介绍
上海试剂厂
异构烷烯烃、异构醇类 苯类
400
美国 Davison 10A
环烷类及 5A 分子筛可吸附者
美国 Linde 13X
俄国 Zeolit NaX
（二）高分子多孔小球 高分子多孔小球（GDX）是以苯乙烯等为单体与交联剂二乙烯苯交联共聚的小球。这种
聚合物在有些方面具有类似吸附剂的性能，而在另外一些方面又显示出固定液的性能[8]。因此，
在进行气相色谱分析时，色谱柱的选择是至关重要的。不仅要考虑被测组分的性质， 实验条件例如柱温、柱压的高低，还应注意和检测器的性能相匹配。有关内容我们将在以 后章节中加以详细讨论。
第二节 填充气相色谱柱
填充气相色谱柱通常简称填充柱，在实际分析工作中的应用非常普遍。据资料统计， 日常色谱分析工作大约有 80%是采用填充柱完成的。填充柱在分离效能和分析速度方面比 毛细管柱差，但填充柱的制备方法比较简单，定量分析的准确度较高，特别是在某些分析 领域（例如气体分析、痕量水分析）具有独特用途。从发展上看，虽然毛细管柱有逐步取 代填充柱的趋势（例如已有一些日常分析使用 PLOT 柱代替过去常用的气固色谱填充柱）， 但至少在目前一段时期内，填充柱在日常分析中仍是一种十分有价值的分析分离手段。
这一类吸附剂包括具有强极性的硅胶、中等极性的氧化铝、非极性的炭素及有特殊吸附作 用的分子筛。它们大多数能在高温下使用，吸附容量大，热稳定性好，是分析永久性气体及气 态烃类混合物理想的固定相。但使用时应该注意: ⑴吸附剂的吸附性能与其制备、活化条件有 密切关系。不同来源的同种产品或者同一来源而非同批的产品，其吸附性能可能存在较大的差 异；⑵一般具有催化活性，不宜在高温和存在活性组分的情况下使用； ⑶吸附等温线通常是 非线性的，进样量较大时易出现色谱峰形不对称。
色谱柱基本知识
色谱柱色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。
目录1简介2构造3填料4分类1. 4.1 安装2. 4.2 流动相3. 4.3 样品制备4. 4.4 保存操作5发展方向6性能评价7注意事项8新进展柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。
即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。
这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。
在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
2构造色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。
柱管多用不锈钢制成，压力不高于70 kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。
为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。
也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。
还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。
色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm；②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1~2mm，柱长10~20cm；③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm；④半制备柱，内径>5mm；⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；⑥生产制备柱内径可达几十厘米。
色谱柱名词解释
色谱柱是色谱分析中使用的一种关键设备，用于将混合物中的成分分离并进行定性和定量分析。
以下是一些与色谱柱相关的常见名词解释：
1. 固定相（Stationary Phase）：色谱柱中的固定涂层或填料，具有特定的化学性质和分离能力。
样品在固定相中发生相互作用，导致不同成分以不同速度移动并被分离。
2. 流动相（Mobile Phase）：用于携带样品通过色谱柱的流体，可以是气体（气相色谱）或液体（液相色谱）。
流动相的选择取决于分析目标和色谱柱类型。
3. 柱效（Plate Number）：用于描述色谱柱分离能力的度量。
柱效越高，表示色谱柱的分离效果越好。
4. 保留时间（Retention Time）：在色谱柱中，样品组分从进样到检测器出现的时间。
保留时间可以帮助确定化合物的特征和纯度。
5. 色谱峰（Chromatographic Peak）：色谱图中呈现出的高度峰值，表示在特定保留时间内检测到的样品成分。
6. 柱温（Column Temperature）：色谱柱的操作温度，可以对分离效果和分析速度产生影响。
某些分析方法需要在特定的温度下进行。
7. 柱寿命（Column Lifetime）：色谱柱使用期限，取决于使用条件和期间的保养和维护。
柱寿命的结束通常由分离性能下降或峰形变得不规则来决定。
色谱柱知识讲解
1、反相色谱的流动相不再需要烃类、氯仿这些 更危险的有机溶剂，使用起来更加简单和安全。 2、而极性强的化合物由于分子间作用力更强， 往往沸点不低，不适合用气相分析，更适合用反 相液相色谱分析
1、反相色谱的流动相有更多的参数选择：PH、缓冲盐种类、浓 度等，能更好地调整分离效果，而正相色谱可调整的流动相参数 非常有限
1、当样品流经凝胶色谱柱时，直径较大的化合物，不易进入凝 胶颗粒的微孔中，所以很快出峰。/2、而直径较小的化合物会进 入凝胶颗粒的微孔中，并不断的进出和扩散，因此，较晚出峰。
主要内容
正相 色谱 反相 离子对 色谱
色谱ห้องสมุดไป่ตู้
色谱
亲水作 用色谱
凝胶 色谱
正相色谱
固定相极性大于流动相极性 流动相是弱极性：如正己烷、石油醚等 固定相是有极性：布满硅羟基的硅胶
极性大的化合物 极性小的化合物
固定相（极性大） 流动相（极性小）
出峰慢 出峰快
反相色谱
流动相极性大于固定相极性 流动相是强极性：如甲醇、水
离子对色谱
又叫离子交换色谱
适用：化合物极性特别强， 一言不合就电离
原理：可增强离子和固定相 的相互作用，使不同的化合 物得到分离
凝胶色谱
又叫体积排阻色谱
不管是正相、反相还是离子交换色谱，化合物出峰的情况都是和极性相 关的，而凝胶色谱的出峰却只和化合物的大小有关，所以也叫体积排阻 色谱。
1、当样品流经凝胶色谱柱时，直径较大的化合物，不易进入凝 胶颗粒的微孔中，所以很快出峰。/2、而直径较小的化合物会进 入凝胶颗粒的微孔中，并不断的进出和扩散，因此，较晚出峰。
色谱柱相关知识
色谱柱相关知识气相色谱毛细管柱因其高分离能力、高灵敏度、高分析速度等独特优点而得到迅速发展。
随着弹性石英交联毛细管柱技术的日益成熟和性能的不断完善，已成为分离复杂多组分混合物、及多项目分析的主要手段，在各领域应用中大有取代填充柱的趋势。
现在新型气相色谱仪、气相色谱-质谱联用仪基本上都是采用毛细管色谱柱进行分离分析。
但是，毛细管色谱柱柱内径较小，固定液的膜薄，用于食品中残留物分析时，若使用不当，色谱柱性能很快就会下降。
本文旨在向初次接触气相色谱毛细管柱的操作者介绍不同类型的毛细管色谱柱的性质、选择、使用方法及注意事项等。
毛细管柱只能安装在配有专用毛细管柱连接装置的气相色谱仪上。
现在购买仪器时最常规的配置是配毛细管分流/不分流进样口。
2 类型毛细管色谱柱的类型有很多种，但目前最常用和商品化的，是开口熔融石英交联毛细管色谱柱。
本文仅介绍此类毛细管色谱柱的性能特点。
2.1 熔融石英毛细管柱2.1.1 熔融石英毛细管柱材料现在市售商品化的气相色谱用毛细管柱几乎都是由熔融石英制作的，简称石英毛细管柱。
制作毛细管柱用的石英纯度非常高，几乎无其它杂质。
它具有熔点高（近2000℃）、热膨胀系数低、化学稳定性好和抗张强度高等特点，是制备毛细管柱的理想材料。
毛细管柱内壁存在有许多具有吸附活性的基团，这些基团的存在直接影响固定相涂渍效果，所以，在涂渍固定相之前，柱表面必须经过适当预处理，以期得到较高的柱效和对称的色谱图形。
2.1.2 石英毛细管柱的聚酰亚胺外涂层石英毛细管柱很脆，只有在毛细管柱外涂一层聚酰亚胺保护材料后才具有很好的弹性，在使用这样的色谱柱时应十分小心，避免将聚酰亚胺涂层损坏，导致毛细管柱易折断。
通常商品毛细管柱出厂时都固定在一个金属丝制作的柱架上，柱架的直径与毛细管柱的直径成正比，即：毛细管柱的直径越大，固定架的直径也就越大。
对于0.53mm内径的毛细管柱，过度弯曲很容易折断，使用安装时要格外小心。
石英毛细管柱外涂层还有采用镀铝膜的，这类柱子适用于高温分析。
色谱柱基础知识的总结
色谱柱基础知识简介一、色谱柱工作原理当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。
二、色谱柱的分类2.1 色谱柱主要分为填充柱和毛细管柱注：此外，还有一些综合了填充柱和毛细管柱特点的特殊色谱柱，例如Alltech公司采用专利技术生产的集束管毛细管柱。
2.2 填充柱与毛细管柱的比较表1 填充柱与毛细管柱的比较色谱柱内径/mm 长度/m柱材料柱容量载气流速填充柱2-5玻璃或金属材质mg20-30mL/min毛细管柱10-10熔融石英或不锈钢、聚酰亚胺涂层ng1-10mL/min注：毛细管柱外层为聚酰亚胺，可修补柱子缺陷（即增强柔韧性）并且增加强度。
三、填充柱填充柱的柱管填充柱可以使用任何类型的柱管，只要它对样品是清洁,、惰性的, 以及能够承受GC的柱箱温度，像：不锈钢管、玻璃管、铜管、聚四氟乙烯管、聚合物管等。
固体载体(颗粒)和固定相近距离观察一个填充颗粒,会发现它是由一个固体载体(颗粒)和在它上面均匀涂渍的涂敷物(叫做固定相)所组成。
固体载体即液态固定相附着的载体，其细小、均匀、多孔，增加与样品接触的表面积。
常用的固体载体为硅土。
固体载体也有不同大小的颗粒度，颗粒度是指“目数大小”。
一般是根据柱径来选择固体载体的粒度，保持载体的直径为柱内径的1/20为宜。
常用60-80目及80-100目。
表2 直径大小与目号的关系四、毛细管柱4.1 毛细管柱的构成毛细管色谱柱由两个主要部分组成：管身和固定相。
管身毛细管柱的管身一般使用熔融二氧化硅或不锈钢作为基本材质。
熔融二氧化硅即高纯度合成石英（以下通称熔融石英)，通常在其表面涂上一层聚酰亚胺做为保护层。
当实验要求更高的使用温度时，我们可以来用不锈钢毛细柱来代替熔融石英毛细柱。
waters色谱柱相关知识
流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例
Good Column
Inject
用“5”法计算柱效
色谱柱的正确使用及操作
流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
正确使用色谱柱（一）
样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
对HPLC柱填料的了解(五)
填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）
残基处理的效果
NovaPak C18
未封口 C18
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
对HPLC柱填料的了解（六）
硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k' 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志
加速色谱柱寿命试验： (pH 10 ，50 °C)
寿命 (小时)
Xterra: 快梯度分析
AU
0.00
0.10
0.20
Minutes
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
气相色谱柱的基本知识
气相色谱柱的基本知识本文简单介绍了气相色谱柱固定相极性、保留机制、基本柱参数，以及气相柱固定相选择的方法。
仅供参考。
1、固定相极性：极性或非极性。
相似相容原理：非极性化合物-非极性固定相80%的应用使用最普遍的固定相：ZB-1、ZB-5、ZB-WAX；其他20%的应用使用特殊固定相。
Q Q 3 0 9 3 3 5 7 4 0 52、固定相保留机制：（1）色散力；（2）永久偶极；（3）诱导偶极；（4）H-键合；（5）π-π键合（1）色散力：非极性相互作用，最弱的作用力，按沸点差别分离对应色谱柱：ZB-1、ZB-1ms、ZB-5、ZB-5ms（2）偶极-偶极：极性相互作用，中等强度，最普遍用于含O、N或卤化的化合物对应色谱柱：ZB-624、ZB-1701、ZB-wax、ZB-waxplus、ZB-FFAP（3）H-键合：极性相互作用，最强的相互作用（有时是不利的）对应色谱柱：ZB-wax、ZB-waxplus、ZB-FFAP（4）π-π作用：π电子的相互作用，中等强度，如芳香族、腈类、羰类和烯/炔对应色谱柱：ZB-5、ZB-5ms、ZB-35、ZB-50、ZB-624、ZB-17013、气相柱基本柱参数，膜厚、柱容量、色谱柱极限温度图1 色谱柱规格描述（1）膜厚：一根气相柱的膜厚度会影响到几个重要的色谱参数①保留：厚膜柱对低沸点化合物有更强保留②柱效：膜越薄柱效越高③活性：膜越厚对酸碱的活性越低④载样量：膜越厚载样量越大⑤流失：膜越薄流失越低（2）柱容量：色谱柱对溶质可容纳的最大值，超过该值，峰型会发生畸变。
与柱容量相关的因素：①固定相与溶质极性的匹配性；②膜厚；③内径；④柱长（3）色谱柱温度极限：①温度下限---低于该温度使用柱效会降低，但不会破坏固定相；②恒温温度上限---可在此温度长时间使用；③程序升温温度上限---不可超过此温度，在此温度不能超过10分钟。
图 2 Zebron系列气相柱固定相类型图 3 Zebron系列气相柱极性大小比较图 4 Zebron系列气相柱固定相选择。
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧一、引言高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、医药等领域的分析技术。
色谱柱是HPLC系统的核心组成部分，其性能直接影响分析结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍HPLC色谱柱的基本原理、分类、使用及维护等方面的专业知识。
二、色谱柱的基本原理色谱法是一种基于不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡进行分离的物理化学方法。
HPLC色谱柱的核心是固定相，它是由硅胶、氧化铝、活性炭等颗粒状物质组成。
当样品溶液通过色谱柱时，不同物质根据其与固定相的相互作用力大小，依次从固定相中解吸下来，从而实现各成分的分离。
三、色谱柱的分类1.正相色谱柱：适合分离极性化合物，如糖类、醇类等。
2.反相色谱柱：适合分离非极性化合物，如脂肪酸、烃类等。
3.离子交换色谱柱：适合分离带电离子或极性化合物，如氨基酸、核酸等。
4.体积排阻色谱柱：适合分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。
四、色谱柱的选择与使用1.根据分析物的性质选择合适的色谱柱。
2.确保色谱柱不受污染，使用前需进行清洗和活化。
3.避免过度使用压力，以延长色谱柱的使用寿命。
4.定期更换色谱柱，以保证分析结果的稳定性。
五、色谱柱的维护与保养1.使用后及时清洗色谱柱，防止残留物对柱子的污染。
2.色谱柱应储存于干燥、避光的环境中，避免受潮或暴晒。
3.对于长期不用的色谱柱，应定期检查其性能并进行活化处理。
4.避免将色谱柱置于高温或低温环境中，以防止硅胶固定相产生裂纹或变形。
5.定期更换流动相，以保证流动相的质量和稳定性。
同时，流动相的pH值应控制在固定相所能承受的范围内。
6.在使用过程中，应时刻关注色谱柱的压力变化。
若发现异常压力或突然变化，应及时检查柱子是否堵塞或受损。
若确有问题，应立即停止使用并进行修复或更换。
7.在使用过程中，还应注意观察色谱峰的形状和大小。
若发现异常峰或分离效果变差，应考虑更换流动相或清洗柱子。
若问题仍未解决，应考虑更换色谱柱。
色谱柱基础知识简介
小，通常0.5~5ml/min
小，通常需要分流进样 口
填充柱(铜&不锈钢材料)
填充柱(玻璃材料)
毛细管柱
填充柱固定相的分类
• 固体固定相：炭质材料、氧化铝、硅胶、 分子筛、高分子多孔小球 • 液体固定相-固定液：
固定液的要求：操作温度下呈液态、粘度低、化学稳定性 好、不与组分发生反应、对样品有足够的分离能力和高的 柱效。 选择固定液的原则：相似性原则、样品与固定液的特殊的作 用力、混合固定液 选择固定液的支持物-担体
色谱柱基础知识简介
2005.07
色谱柱的分类
• 通常使用填充柱和毛细管柱两类 • 两类色谱柱的区别
项目 填充柱 毛细管柱柱源自料柱长 柱内径铜、不锈钢、硅酸硼玻 常用熔凝硅玻璃 璃
0.5~10米 2~4mm 10~150米 0.25mm、0.38mm、 0.50mm
柱流速
样品容量
大，通常10~50ml/min
开管柱开管柱（毛细管柱）的分类
• 壁涂渍开管柱：固定液直接涂在毛细管壁 上 • 固体涂渍开管柱：先在毛细管内涂一层很 细（小于2微米）多孔颗粒，形成多孔层， 再在多孔层上涂渍固定液。 • 多孔层开管柱：毛细管中涂渍细颗粒的吸 附剂或任何固定相（如分子筛）。不再涂 固定液。
色谱柱的老化
• 目的：除去溶剂、水分、以及色谱柱制备过程中其他挥发 性杂质；促进固定液均匀牢固的分布在担体上。 • 老化方法（略） • 老化温度的选择应注意：足够高以除去不挥发物质；足够 低以延长柱寿命和减少柱流失；温度越低老化时间应越长； 不超过色谱柱的最高使用温度 • 填充柱比毛细管柱应更经常、更严格的老化 • 填充柱老化时间应长些，可过夜；毛细管柱老化只能是轻 度的，时间应短些，防止固定液流失。 • 老化好的色谱柱若不立即投入使用，应将其从柱箱中取出， 两端盖上帽子，防止空气、水分或其他杂质的进入。
色谱柱基础知识的总结
色谱柱基础知识的总结色谱柱是色谱分析中的重要工具，它是用来分离混合物中不同化合物的设备。
色谱柱的选择和使用对于色谱分析结果的准确性和灵敏度起着至关重要的作用。
下面将对色谱柱的基础知识进行总结。
色谱柱的种类主要包括气相色谱柱（GC柱）和液相色谱柱（LC柱）。
GC柱使得样品在高温下蒸发成为气态，然后通过柱子的分离效应进行分离。
LC柱是将可溶于液相的样品通过柱子的分离效应进行分离。
色谱柱的工作原理是样品分离的基础。
色谱柱的分离效应由固定填充物和流动相的选择决定。
固定填充物是色谱柱中的重要组成部分，分为填充型和包袋型。
填充型色谱柱常用的填充物有硅胶、氧化铝、氮化硅等。
填充型色谱柱适用于对极性物质的分离。
包袋型色谱柱通常是指薄层涂布型的液相色谱柱，常见的包袋型色谱柱有C18、C8、C4等。
包袋型色谱柱适用于对非极性以及中等极性物质的分离。
流动相的选择也是色谱柱分离效应的关键因素。
在GC柱中，通常使用气体作为流动相，常用的有氢气、氦气等。
在LC柱中，流动相一般是有机溶剂和缓冲液的混合物，常见的有甲醇、乙腈等。
流动相的选择要根据要分离的物质的属性，如极性、溶解度等进行合理选择，以提高分离效果。
色谱柱的选择要根据需要分离的物质的性质进行。
对于GC柱的选择，常见的指标有极性、温度范围、长度和内径等。
相对于液相色谱柱，GC柱的选择范围较窄，通常根据物质的极性选择合适的GC柱。
液相色谱柱的选择相对较为复杂，常见的指标有固定相类型、粒径、孔径、长度和内径等。
固定相的选择要根据样品的性质进行，如极性的物质选择极性固定相，非极性物质选择非极性固定相。
粒径和孔径的选择会影响柱子的分离效果和分析时间。
总之，色谱柱是色谱分析中的重要工具，其选择和使用对于色谱分析结果至关重要。
合理选择柱子的类型和填充物，以及优化流动相的组成和条件，能够提高色谱分离效果和分析灵敏度。
同时，良好的色谱柱的使用与保养也是保证色谱分析质量的重要环节。
只有不断深入了解和熟悉色谱柱的基础知识，才能更好地进行色谱分析工作。
色谱柱常用知识
色谱柱使用常识1.色谱柱的安装⑴、用过滤和脱气的流动相（不含缓冲盐）彻底冲洗色谱仪的泵和管路，务必使系统中不含气泡。
⑵、根据色谱柱上所标示的流动相流向，将色谱柱入口与泵端管路相连，柱出口不连。
⑶、将泵的流速设为0.1mL/min或更低，流速缓慢地上升到正常流速（t>5min）。
⑷、当溶剂从色谱柱出口端自由流出时，将流速设为0，把柱出口与检测器端的管路相连。
⑸、用10－30倍柱体积的流动相、正常流速平衡色谱柱。
⑹、氨基柱、氰基柱既可在正相环境下使用，也可在反相环境下工作。
当需要从反相变为正相或正相变为反相时，需要用20－30倍柱体积的THF作为过渡溶剂冲洗系统，否则易使泵的单向阀堵塞，出现压力异常的现象。
2.色谱柱使用注意事项①、流动相：a、溶剂必须是HPLC级的，试剂则尽可能使用高纯度的；b、不与固定相发生化学反应，粘度小，且对样品有适宜的溶解度，要求k在1～10范围内（可用范围）或2～5（最佳范围），k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀；c、流动相使用之前必须过滤和脱气；d、确保溶剂间是相互混溶的；e、流动相必须与检测器相匹配，如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂。
痕量的杂质会极大地降低色谱柱的性能，当需要更换流动相时，确保溶剂（缓冲液）之间是相互混溶的。
若使用的溶剂与色谱柱中的溶剂不能混溶，则需使用过渡溶剂，否则会对色谱柱产生永久性的伤害。
盐或缓冲液从流动相中析出也会对色谱柱产生永久性的伤害。
每次进样前应该检查样品在流动相中的溶解性，如果可能尽量使用流动相溶解样品。
②、固定相：a、流动相的pH值应保持在2.0－8.0之间（除非有特殊说明）；b、如果有必要可使用预饱和柱和保护柱；c、使用氨基柱时，流动相和样品中尽量避免含醛类和酮类物质。
当前的反相色谱柱填料可分为以下三种：⒈硅胶柱：柱效高，机械强度大，但对pH敏感，低pH值(<2.0)会使键合相水解（除去键合的功能集团）；高pH值（>8.0），硅胶溶解。
色谱柱常识
因此，对于不同的被分析物要按实际情况选择封端或不封端的填料。
硅胶的化学性质—碳覆盖率
碳覆盖率（键合度）：与基体物质相连的键合相的量。
填料的选择性决定于键合的密度，尤其是在分离碳水化合物时，不同键合密度表现出不同的选择性。
碳覆盖率对色谱分离的影响：
* 双体键合：增加色谱柱稳定性，增加色谱柱的载样量
硅胶的化学性质—封端
封端：键合步骤之后，用小分子硅烷将裸露的硅羟基键合，以便获得更大的覆盖率。
封端多用于反相色谱键合中。
封端可消除或减少可能发生的二级反应。
没有封端的反相色谱填料通常比封端的有复杂多样的选择性。
碱性物质在不封端的填料上，容易产生拖尾。
色谱柱填料形状与粒径
基质：硅胶、二氧化铝、聚合物填料等
形状：球形和无定形
* 无定形：易制备、价格低；但涡流扩散大，渗透性差， 比较难填装出稳定的柱床，一般用来做制备柱。
* 球形：涡流扩散小，渗透性好，可填装出稳定的柱床。
* 高碳覆盖率：提高分辩率，分析时间长
* 低碳覆盖率：缩短运行时间
色谱柱分类
反相色谱柱：C18、C8、C3等
正相色谱柱：硅胶柱、氨基柱、氰基柱等
离子交换柱：有强阴、强阳、弱阴、来自阳之分 体积排阻柱：凝胶渗透色谱柱与凝胶过滤色谱柱
疏水作用柱
手性柱
宽径柱（3-21.2mm）-载样量高
柱的内径决定了流速：
流速F2=F1*(ID2/ID1)2
硅胶纯度
硅胶的硅醇基与离子型化合物之间可能进行二级反应
硅胶中的痕量金属会增加硅醇的酸性和峰的不对称性，有利于二级反应的发生，容易引起峰的拖尾。硅胶越纯，金属含量越低时，可以降低表面游离硅胶基的酸性，消除或减少可能发生的二级反应。
色谱柱相关知识课件
03
智能化：实现色谱柱的自动 化控制和优化
04
绿色环保：减少色谱柱对环境 的影响，提高环保性能
色谱柱在分析仪器中的应用
色谱柱在气相色谱 仪中的应用：用于 分离和分析气体样
品
色谱柱在离子色谱 仪中的应用：用于 分离和分析离子样
品
色谱柱在液相色谱 仪中的应用：用于 分离和分析液体样
品
色谱柱在超临界流 体色谱仪中的应用： 用于分离和分析超
演讲人
01
020304色谱柱 Nhomakorabea基本 原理
色谱柱的选择 与使用
色谱柱的应用 领域
色谱柱的发展 趋势
1
色谱柱的分类
填充柱：填充有固定相的色谱柱，如硅胶柱、 氧化铝柱等
毛细管柱：内径较小的色谱柱，如不锈钢柱、 玻璃柱等
微填充柱：填充有微粒固定相的色谱柱，如 硅胶微粒柱、氧化铝微粒柱等
超临界流体色谱柱：使用超临界流体作为流 动相的色谱柱，如二氧化碳柱、氮气柱等
加热器等
色谱柱的工作原理
色谱柱的基本结 构：包括柱管、 填料、固定相和 流动相
色谱柱的分类：根 据填料和固定相的 不同，可分为气相 色谱柱和液相色谱 柱
色谱柱的工作原理： 利用不同物质在固 定相和流动相中的 分配系数不同，实 现分离和检测
色谱柱的应用：广 泛应用于化学、生 物、医药、环境等 领域的分析和检测
流速：根据分 析物的性质和 分离要求选择 合适的流速
色谱柱的使用方法
1
色谱柱的选择：根 据分析目的、样品 性质和仪器条件选
择合适的色谱柱
2
色谱柱的安装：按 照说明书正确安装 色谱柱，注意密封
和固定
3
色谱柱的平衡：在 分析前，用适当的 溶剂平衡色谱柱， 以消除柱内残留的
色谱柱知识
液相色谱柱知识1. 色谱柱的构成色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。
柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。
色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒。
色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。
典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。
色谱柱：也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的。
2. 色谱柱的填充干法填充：在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。
湿法填充：又称淤浆填充法，使用专门的填充装置。
3. 填料的结构色谱填料是由基质和功能层两部分构成。
基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。
常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。
（常用球形全多孔硅胶为化学键合相载体）功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。
如图8-10是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。
液相色谱仪（Liquid Chromatograph）由高压输液泵、检测器、进样器及液相色谱柱等四部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
一、液相色谱柱的安装：1、液相色谱柱的结构：a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。
7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。
3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。
常用色谱柱相关知识.
常用色谱柱简介气相色谱毛细柱(键合,聚二甲基硅氧烷HP-1,DB-1,P-1,CP-SIL5CB,Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1类似固定相:SE-30,SP-2100,OV-1,OV-101,使用温度:-60℃-320℃应用范围:烷烃,芳烃,多环芳烃,醇,酚,酮,酯,醛,胺,卤代烃,吡啶,糖衍生物,氨基酸衍生物,维生素衍生物,镇痛药,农药,溶剂,胆固SPB-50型中等极性柱醇,香料,咖啡,食品添加剂等。
(键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷对照品牌:HP-50,HP-17,DB-17,RTx-50,AT-50 SPB-5型弱极性柱类似固定相:OV-17, SP-2250,使用温度:30℃-310℃(键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷应用范围:烷烃,低沸点芳烃,多环芳烃,醇,甘对照品牌:HP-5,DB-5,BP-5,CP-SIL 8CB,油三酸酯,喹啉,卤素化合物,香料,农药,酯, Ultra-2, ,RTx-5,AT-5镇痛药,除草剂等。
类似固定相:SE-54,SE-52,OV-73 使用温度:-60℃-320℃PTE-5,PTE-5QTM型弱极性柱应用范围:烷基苯,多环芳烃,醇,酚,酮,脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷酸酯,苯二甲酸酯,硝基芳烃,芳胺,烷基胺,联对照品牌:HP-5 MS,DB-5 MS, DB-5.625,XTI-5,苯胺,卤代烃,多氯联苯,,糖类衍生物,维生素衍BPX625,半挥发污染物分析柱(US EPA方法525,生物,有机酸,镇痛药,农药,抗组胺药,溶剂, 625.5,625生物碱,防腐剂,香料等。
类似固定相:SE-54,SE-52 使用温度:-60℃-320℃应用范围:多氯联苯,胺,有机磷,有机氯农药, SUPELCOWAX 10型极性柱含氯除草剂,酚,苯胺,香料等。
(键合,聚乙二醇二万对照品牌:HP-Wax,DB-Wax,BP-20,CP-Wax 52CB,SPB-1701型中等极性柱HP-INNO Wax,AT-Wax(键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷类似固定相:PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温对照品牌:HP-1701,DB-1701,RTx-1701,AT-1701,度:35℃-280℃BP-10,CPSil19CB应用范围:低沸点芳烃,醇,酮,酸,酯,醛,醚,类似固定相:OV-1701,SP-2250 使用温度:室温-280 乙二醇,丙二醇,甘油,吡啶,胺,亚硝胺,卤代℃烃,胆汁酸衍生物,冰片,薄荷,精油,香料,酒,应用范围:醇,卤素化合物,有机氯农药,酸性药苯乙烯,茶,溶剂等。
高效液相色谱柱基础知识
色谱柱的种类
➢ 高分子聚合物 • 常用的是以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙
烯酸酯为基质的球形填料。 • 压力限度比无机填料低； • 在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗
分离有机酸、碱、盐这些离子型化合物。 ➢ 样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可
使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择 性；短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极 性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键 合相与短链烷基键合相的性质相似。
反相键合相色谱
流动相为极性的水或缓冲液，常加入甲醇、 乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶 的有机溶剂以调节保留时间。
ZORBAX Extend-C18，pH9~12, ➢ 基质的颗粒度 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)，分离度越好，柱压
越高(渗透性差)，常用5μ。 ➢ 基质的颗粒分布 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) ➢ 基质的颗粒形状 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型（不规则形状）：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀，
色谱柱 ； • 聚合物基质在流动相发生变化时会出现膨胀或收缩，
对于小分子化合物柱效低； • 主要用于大分子化合物，常制成凝胶柱或离子交换
柱。
化学键合相色谱柱
➢ 定义：将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶 表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。
➢ 种类 非极性键合相（反相）：键合相表面基团为非极性
高效液相色谱柱基础知识
张润平
色谱柱的构造
✓ 色谱柱由柱管、填料压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、 于70 kg/cm2 时，也可采用 厚壁玻璃或石英管。为提高柱效，减小管壁效应，管内壁要求 有很高的光洁度，不锈钢柱内壁多经过抛光。
凝胶色谱柱知识点总结
凝胶色谱柱知识点总结凝胶色谱柱的分类凝胶色谱柱主要有两种类型，即大小分离色谱和亲和色谱。
1. 大小分离色谱大小分离色谱是根据生物大分子在凝胶中的大小差异进行分离的，通常用来分离蛋白质、核酸和多肽等大分子生物大分子。
根据凝胶的孔径大小，可以将大分子生物大分子从小分子生物大分子中分离出来。
2. 亲和色谱亲和色谱是利用生物大分子与特定配体之间的亲和作用来进行分离和纯化的方法。
通常在凝胶上固定一定的亲和剂，通过生物分子与亲和剂之间的特定相互作用来实现生物分子的选择性吸附和洗脱。
凝胶色谱柱的原理凝胶色谱柱的分离原理是利用凝胶材料固定在色谱柱中，通过色谱柱中的孔隙结构来实现生物大分子的分离。
凝胶色谱柱根据其孔隙大小可分为两种类型，包括凝胶过滤柱和凝胶渗透柱。
1. 凝胶过滤柱凝胶过滤柱利用凝胶中的孔隙大小来分离生物大分子。
当生物大分子通过色谱柱时，较大的生物大分子会被凝胶阻挡，而较小的生物大分子可以通过凝胶的孔隙，从而实现生物大分子的分离。
2. 凝胶渗透柱凝胶渗透柱通过凝胶中的孔隙大小来实现生物分子的分离。
通常，生物大分子会根据其大小在凝胶柱中进行渗透，从而实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶色谱柱的应用凝胶色谱柱在生物分离和纯化中有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 蛋白质分离与纯化凝胶色谱柱可用于蛋白质的分离与纯化，对于分离蛋白质复合物、纯化功能蛋白等方面具有重要作用。
2. 核酸分离与纯化凝胶色谱柱可以用于核酸的分离与纯化，对于分离DNA、RNA等核酸样品具有重要作用。
3. 多肽分离与纯化凝胶色谱柱也可用于多肽的分离与纯化，对于分离多肽混合物、纯化特定多肽等方面具有重要作用。
4. 膜蛋白分离与纯化对于膜蛋白的分离与纯化，凝胶色谱柱也有着重要的应用价值。
凝胶色谱柱的优缺点凝胶色谱柱具有一些优点和缺点，以下分别进行介绍：1. 优点（1）分离效果好：凝胶色谱柱能够实现对生物大分子的高效分离与纯化，分离效果好；（2）操作简便：凝胶色谱柱的操作相对简单，不需要复杂的设备和技术，易于掌握；（3）适用范围广：凝胶色谱柱适用于多种生物大分子的分离与纯化，具有较广的应用范围。
色谱柱相关知识点总结
色谱柱相关知识点总结一、色谱柱的基本知识色谱柱是色谱分析中用于分离和提取混合物中成分的一种仪器，其主要原理是利用混合物成分在固定相上的溶解度差异，通过流动相的运动使不同成分逐渐分离。
色谱柱通常由柱壁、填料和柱端组成，其内部填充有各种不同材质的固定相，以提供不同的分离机制。
二、色谱柱的分类根据填料的不同，色谱柱可以分为以下几种主要类型：1. 气相色谱柱：主要用于气相色谱分析，填料通常为不活性的多孔硅胶或聚酯。
气相色谱柱广泛应用于各种化学物质的分析和检测。
2. 液相色谱柱：主要用于液相色谱分析，填料通常为全球性组织最具影响力的金属有机框架领域标准协会。
液相色谱柱可根据分离机制的不同分为反相、正相、离子交换、凝胶柱等类型。
3. 离子色谱柱：特殊用途色谱柱，主要用于分离离子物质，填料通常为离子交换树脂。
离子色谱柱常用于水质分析和环境监测中。
4. 通用型色谱柱：用于多种成分的分离和检测，填料通常为较为通用的硅胶或聚酯材料。
通用型色谱柱适用范围广，可以满足多种化学成分的分离需求。
三、色谱柱的特点1. 分离效果好：色谱柱内部填充有固定相，可以提供不同的分离机制，使得不同成分能够得到有效的分离，从而保证分析的准确性。
2. 适用范围广：不同类型的色谱柱可以满足各种化学物质的分离和检测需求，适用范围广泛。
3. 操作简便：色谱柱的操作相对简单，只需要合理选择填料和条件，就可以进行有效的分离和检测。
4. 耐用性强：优质的色谱柱通常具有较长的使用寿命，能够满足长期的分析需求。
四、色谱柱的选择选择合适的色谱柱对于分析结果的准确性至关重要，通常需要考虑以下几个因素：1. 样品性质：不同的样品性质需要选择不同类型的色谱柱，如极性样品使用反相色谱柱，非极性样品使用正相色谱柱。
2. 分离要求：不同的分离要求需要选择不同类型的色谱柱，如需要高效分离的样品可以选择长柱或小颗粒填料的色谱柱。
3. 操作条件：不同的操作条件需要选择不同类型的色谱柱，如高温条件下需要选择耐高温的色谱柱，高压条件下需要选择耐高压的色谱柱。
气相色谱柱专业知识课件
装柱过程： 1）空柱管→酸洗，碱洗，乙醚洗 2）固定液（<20%）→溶解在有机溶剂→载体 3）静态老化 4）动态老化
第四节 检测器
检测器：是将流杰出谱柱旳被测组分旳浓度转变为 电信号旳装置
一、气相色谱检测器分类 二、常用检测器旳特点和检测原理 三、检测器旳性能指标
气相色谱柱
（一）载体
1．作用：承载固定液旳作用
2．要求： 比表面积大（多涂渍固定液） 无吸附性（不吸附被测组分） 化学惰性（不与固定液发生化学反应） 热稳定性好 一定旳机械强度
续前
3．分类： （1）硅藻土类：具有一定粒度旳多孔性固体微粒
红色：吸附力强，与非极性物质配伍 白色：吸附力弱，与极性物质配伍 （2）非硅藻土类：玻璃微球，石英微球，
注：对于中档极性组分，若沸点相同， 则按极性顺序出柱，极性较强旳后出柱
续前
b．按化学官能团相同选择： 固定液与被测组分化学官能团相同，作用力强， 选择性高
酯类——选酯或聚酯固定液 醇类——选醇类或聚乙二醇固定液
（2）按组分性质旳主要差别选择
组分旳沸点差别为主 —— 选非极性固定液 按沸点顺序出柱 沸点低旳先出柱
➢ 小结：
固定液分类，固定液选择，分离条件选择 两种类型检测器特点，检测原理，使用注意 敏捷度与检测限优劣衡量
Sm
A C1
C2 w
60
[mV s / g]
S m 指1秒钟携带1g样品进入检测器所产生的信号强度
A — —峰面积(cm2 )
C1 — —记录器灵敏度（mV / cm） C2 — —记录纸纸速倒数（min/ cm）
w — —进样量（g）
（三）检测限（敏感度）：
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色谱柱相关知识1、色谱柱的使用说明：（1）色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。
在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。
在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。
（2）流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。
如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。
另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。
当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。
（3）样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。
在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。
2、色谱柱的保存??（1）反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。
注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
（2）长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。
对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。
储存的温度最好是室温。
3、色谱柱的再生??因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
（1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
（2）正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。
要注意上述溶剂必须严格脱水。
4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法??色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。
但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；（2）色谱柱头的填料被样品污染；（3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；（4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。
解决办法如下：（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。
（2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
（3）如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
（4）如果因PH值使用不当，很难恢复。
液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择1．柱子的PH值使用范围? ???反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。
一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim 柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）? ???把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
1、进样量柱子的最大载样量取决于：柱子的型号，使用的条件和样品的类型，很难给出一个一般的指示。
对于进样体积的建议则比较容易（见表中的典型值）。
注射了太大体积或太浓的样品会使色谱柱过载，导致峰展宽，变形或者峰融合。
2、流量和压力注意最高压力：不锈钢柱<4500psi；玻璃柱<3000psi增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。
如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。
拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。
高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。
使用保护柱会防止污染物沉积在分析柱上。
HPLC使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45u m或更细的膜过滤)。
??2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。
对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。
清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。
11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。
更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法?? ??(一)保留时间变化??? ? 1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱? ? 2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱? ? 3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液? ? 4.柱污染每天冲洗柱? ? 5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相? ? 6.柱快达到寿命采用保护柱??(二)保留时间缩短??? ? 1.流速增加检查泵,重新设定流速? ? 2.样品超载降低样品量? ? 3.键合相流失流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向? ? 4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀? ? 5.温度增加柱恒温??(三)保留时间延长??? ? 1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡? ? 2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化? ? 3.键合相流失同前(二)3? ? 4.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5??(四) 出现肩峰或分*??? ? 1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%? ? 2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂? ? 3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件? ? 4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品? ? 5.进样器损坏更换进样器转子??(五)鬼峰? ? 1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗? ? 2.样品中未知物处理样品? ? 3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱) ? ? 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂? ? 5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水??(六) 基线噪声??? ? 1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压? ? 2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂? ? 3.检测器灯连续噪声更换氘灯? ? 4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)? ? 5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压??(七)峰拖尾??? ? 1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相? ? 2.峰干扰清洁样品,调整流动相? ? 3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品? ? 4.同前(四)4 同前(四)4? ? 5.同前(四)3 5.同前(四)3? ? 6.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管? ? 7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱??(八)峰展宽??? ? 1.进样体积过大同(四)1? ? 2.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散? ? 3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点? ? 4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%? ? 5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相? ? 6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器? ? 7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱? ? 8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小? ? 9.样品过载进小浓度小体积样品液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
??1、样品的前处理：????a、最好使用流动相溶解样品。
????b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。