食品中铜绿假单胞菌检测PPT课件
食品中铜绿假单胞菌检测.
二、铜绿假单胞菌的致病性
铜绿假单胞菌为条件致病菌,是医院内感染的主 要病原菌之一。
可引起局部化脓性炎症,也可引起中耳炎、角膜 炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎 ,还可引起败血 症菌血症及婴儿流行性腹泻。
GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法
(二)检测原理
铜绿假单胞菌的特性: 需氧菌,营养要求不高,产色素(主要为绿脓素) 90 %以上的菌株产生蓝绿色色素。 98 %菌株产生水溶性荧光色素。 氧化酶试验呈阳性。 分解乙酰胺L水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤, 并将滤膜移至CN琼脂选择性培养基上,于36℃士 1℃恒温箱中培养48h,典型菌落能够在CN琼脂选择 性培养基上生长并产生绿脓菌素,或者能够在CN琼 脂选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光 (360±20nm)照射下能产生荧光、能够利用乙酰 胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌,经证实为铜绿假 单胞菌,则其检测结果为阳性。
一、检测背景
WHO在HACCP的评估中明确指出铜绿假单胞菌 是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌,可造成婴儿腹 泻。
尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群,饮用含铜 绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生。
普通人食入103~104个菌体细胞即可被侵害。
一、检测背景
2014年新出台的食品安全国家标准 GB19298-2014《包装饮用水》 其中微生物指标中:
• 铜绿假单胞菌的菌体形态
无芽孢,无夹膜,革兰氏染色后为红色, 革兰阴性杆菌,有单鞭毛或丛鞭毛,运动 活泼。菌体的大小为0.5~1µm×1.5~ 3.0µm,菌体笔直或弯曲。
铜绿假单胞菌ppt课件
细小,无光泽 半透明菌落
侏儒型(麦康凯平板)
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菌落呈灰绿色 大小不一 扁平湿润 边缘不规则 呈伞状伸展 表面常可见 金属光泽
典型型(麦康凯平板)
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产绿脓素 琼脂染成黄绿色
典型型(普通平板上)
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菌落中央凸起 边缘扁平 表面粗糙
粗糙型(麦康凯平板)
40
菌落圆形凸起 似大肠埃希菌菌落
大肠型(麦康凯平板)
4
检查意义:
• 人及动物的皮肤、肠道、上呼吸道等处都有该菌存在。绿脓杆菌抵 抗力较强,湿热55℃1小时才被杀死。
• 对紫外线不敏感。对多种抗生素易产生耐药性。本菌仅于人体防御 功能改变或直接进入机体(如通过泌尿道插管及静脉导管、呼吸道 的通气设备和其他治疗检查方法)以及混合感染时才具有致病性。
• 长期使用抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂或大面积烧伤、肾 功能不全、心脏病、慢性支气管肺疾患的患者易继发绿脓杆菌的感 染。
16202035粗糙型铜绿的菌落分型16202036粘液型麦康凯平板粘液型血平板菌落光滑凸起成粘液状16202037侏儒型麦康凯平板细小无光泽半透明菌落16202038典型型麦康凯平板菌落呈灰绿色大小不一扁平湿润边缘不规则呈伞状伸展面常可见金属光泽16202039典型型普通平板上产绿脓素琼脂染成黄绿色16202040粗糙型麦康凯平板菌落中央凸起边缘扁平表面粗糙16202041大肠型麦康凯平板菌落圆形凸起似大肠埃希菌菌落16202042常见非发酵菌初步分群鉴定试验假单胞不动杆1620204320201644
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假单胞菌属Pseudomonas
种类:
• 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa) • 荧光假单胞菌(P.fluorescence ) • 恶臭假单胞菌(P.putica ) • 斯氏假单胞菌(P.stutizeri) • 曼多辛假单胞菌(P.mendocina) • 产碱假单胞菌(P.alcaligenes) • 假产碱假单胞菌
铜绿假单胞菌PPT优秀课件
250
200
150
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50
0
1994 1995 1996 1998 1999 2000 2001
总菌株 554 1048 1348 1542 1291 1678 1949
铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 克雷伯菌属 不动杆菌属 肠杆菌属 嗜麦芽窄食单胞菌 变形杆菌属 沙雷菌属 其它假单胞菌属 枸橼酸杆菌属
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青霉素结合蛋白( Penicillin2B inding2p roteins, PB2Ps)是位于细菌细胞内膜上的一些膜蛋白,是β内酰胺 类抗生素的专一性作用靶点,最初因为能与青霉素共价结 合而得名。PBPs是参与细菌细胞壁肽聚糖生物合成的酶, 包括转肽酶、羧肽酶和内肽酶。它的正常存在是细菌保持 正常形态及功能的必需条件。β内酰胺类抗生素正是通过 与PBPs结合抑制细菌细胞壁的生物合成引起细菌细胞死 亡从而发挥杀菌作用[ 22 ] 。当细胞膜上的PBPs数量减 少,或者PBPs的结构改变或产生一种新的PBPs,使其与β内 酰胺类抗生素的亲和力明显降低,就会产生耐药。这种机 制与β内酰胺酶能发生协同效应,引起细菌对β内酰胺类抗 生素的耐药。
铜绿假单胞菌对外界环境抵抗力较强,在潮湿处能长期生 存,对紫外线不敏感,湿热55℃ 1小时才被杀灭。
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G- 致病菌标本来源分布
1994~2001年共监测10,279株菌
各种脓液3% 胆汁4%
血液5%
其他12%
伤口6%
泌尿道12%
呼吸道58%
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7年间最常见的革兰氏阴性菌(株数)
铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 克雷伯菌属 不动杆菌属 肠杆菌属 嗜麦芽窄食单胞 菌 变形杆菌属 沙雷菌属 其它假单胞菌属 枸橼酸杆菌属
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最新铜绿假单胞菌耐药相关基因检测及临床意义ppt课件
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C
2a
A
2b
A
2be
A
2br
A
2c
A
2d
D
2e
A
2f
A
3
B
4
?
β-内酰胺酶
水解头孢菌素 水解青霉素 广谱酶
超广谱β -内酰胺酶 耐酶抑制剂广谱酶 水解羧苄西林 水解氯唑西林 水解头孢菌素 非金属碳青霉烯酶 金属β -内酰胺酶 水解青霉素
来源
代表酶
染色体 质粒 质粒 质粒 质粒 质粒 质粒 染色体 染色体 染色体
• aadB →对庆大霉素、妥布霉素、卡拉霉素耐药
本研究结果(18种耐药相关基因)
基因名称
TEM CARB SHV PER DHA VEB OXA-10 GES IMP VIM GIM SPM
试验菌株数
34 34 34 34 34 34 34 34 34 34 34 34
阳性率(%)
5.9 32.4 0.0 0.0 14.7 0.0 0.0 0.0 17.6 0.0 0.0 0.0
基因名称
OprD2 qacEΔ1-sull aac(6’)-I aac(6’)-II ant(2”)-I IntI1
TEM
来源:希腊1名叫Temoniera的病人血培养中分离到的 大肠埃希菌中发现并得名
TEM命名已至TEM-119型
TEM型ESBLs主要从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中发现, 其他肠杆菌科和Pa中也有发现
SHV
来源SHV型ESBLs是在广谱酶SHV-1型基因序列的基础上 由一至数十个氨基酸的密码子突变而成
395株铜绿假单胞菌耐药分析(2003.1-2005.6 ) (四川省人民医院)
100 90 80
铜绿假单胞菌ppt课件
微生物检验
采集标本:各种临床标本 医疗器械 环境用品 检验方法:直接镜检 分离培养(血平、MAC平板) 鉴定 分型:血清学分型、质粒指纹图谱分型、 脉冲场凝胶电泳分型等
脓液 痰 尿液等
血液 环境用品 分离培养 直接涂片染色
肉汤增菌
血平板
37 ℃18-24h
可疑菌落(金属光泽、β-溶血、产绿色素、特殊气味)
假单胞菌属Pseudomonas
种类:
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa) 荧光假单胞菌(P.fluorescence ) 恶臭假单胞菌(P.putica ) 斯氏假单胞菌(P.stutizeri) 曼多辛假单胞菌(P.mendocina) 产碱假单胞菌(P.alcaligenes) 假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)
初步鉴定
最后鉴定
菌落 色素
革兰阴性杆菌 氧化酶(+)
非发酵菌鉴定系统鉴定
血清分型
检验程序
分离培养
普平:
18-24h圆形 大小不一 边缘不整 扁平 湿润 常呈融合态 琼脂被染成绿或黄绿 血平: 扁平 湿润 有金属光泽 琼脂被染成蓝 绿或灰绿 有溶血环 MAC平:微小无光泽半透明 48h后菌落呈棕色
粘附素:菌毛的神经氨酸酶分解上皮细胞表面的 神经氨酸促进细菌侵入 荚膜:多糖类物质抗吞噬细胞的吞噬作用;使细 菌锚泊在细胞表面,与呼吸道感染有关 内毒素、外毒素 绿脓菌素:绿色色素,由铜绿假单胞菌的RpoS基 因编码产生的代谢产物,具有氧化还原活性的化 合物,能催化超氧化物和过氧化氢产生有毒氧基 团,引起组织损伤。在致病中起重要作用 弹性蛋白酶:降解弹性蛋白,引起肺实质损伤和 出血;降解补体和白细胞蛋白酶抑制物;可与相 应抗体形成复合物,沉积于感染组织中 磷脂酶C
《铜绿假单胞菌》课件
形态特征和生化试验进行鉴定。
3
抗生素敏感性测试
使用不同的抗生素对菌株进行敏感性 测试,以确定其对抗生素的耐药性。
菌种特点
形态特征 生长环境 耐药性
革兰氏阴性杆菌 一般生长于潮湿的环境,如水体和土壤 对多种抗生素具有耐药性
病原性机制
侵入性
铜绿假单胞菌通过附着于宿主 细胞表面并分泌外毒素,侵入 宿主细胞并引起感染。
影像学检查
如X光、CT扫描和核磁共振 等,用于评估感染的程度和 影响范围。
防控措施
1 个人卫生
保持良好的个人卫生习惯,如勤洗手、使用洗手液和消毒剂等。
2 环境清洁
保持环境的清洁和卫生,定期清洁和消毒接触过的表面。
3 隔离措施
对已感染的个体进行隔离,以避免感染的传细菌,具
生物膜形成
免疫反应
铜绿假单胞菌能够形成生物膜, 提供菌株的保护,增加抗药性, 并促进感染的持续。
感染引发宿主的免疫反应,导 致炎症反应和其他相关症状。
临床诊断
病情评估
对病患进行全面体格检查和 病情评估,包括症状、体征 和病史等。
实验室检查
进行标本分析、培养和鉴定, 以确定是否存在铜绿假单胞 菌感染。
展望
2
有多种病原性机制和耐药性。了解其 特点和防控措施对于预防感染非常重
未来的研究可以着重于开发新的抗菌
要。
药物、研究病原性机制并加强预防措
施。
《铜绿假单胞菌》PPT课 件
欢迎来到《铜绿假单胞菌》PPT课件!在本课件中,我们将介绍这种微生物 的特点、病原性机制以及临床诊断和防控措施。让我们一起深入了解这个有 趣的话题吧!
课程介绍
什么是铜绿假单胞菌?
铜绿假单胞菌是一种常见 的革兰氏阴性细菌,常见 于土壤和水体中。它具有 耐药性和适应性强的特点。
饮用水中微生物检测方法粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌ppt课件
报告
Ø 依据典型菌落的计数和确证性试验为阳性 的结果,计算250ml水样中粪链球菌数量, 结果以CFU/250mL计。
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第二部分 铜绿假单胞菌的检测
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铜绿假单胞菌特性
Ø 一种常见的条件致病菌,属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细 长且长短不一, 铜绿假单胞菌有时呈球杆状或线状,成对或短 链状排列。菌体的一端有单鞭毛,在暗视野显微镜或相差显微 镜下观察可见细菌运动活泼。 Ø 本菌为专性需氧菌,生长温度范围 25~42℃,最适生长温度为 25~30℃,特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可 用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素, 如绿脓素(pyocynin)与带荧光的水溶性荧光素(pyoverdin) 等。在血平板上会有透明溶血环。
Ø 牛奶发酵试验
取1mlFT培养液接于含铁牛乳培养基,46℃水浴培养2h,观察有无 “暴烈发酵”现象。发酵乳糖、凝固酪蛋白、产生大量气体。
Ø 卵黄琼脂平板
点种FT培养液,36℃±1℃,厌氧24h。产卵磷脂酶,接种点底部 及周围形成乳白色浑浊带。
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含铁牛乳培养基 暴烈发酵现象
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KF链球菌琼脂上菌落
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确证性试验
Ø 滤膜上的典型菌落在脑 - 心浸萃琼脂斜面培养, 36℃±1℃ 24h~48h,有菌落继续。 Ø 过氧化氢酶反应 取培养物在洁净载玻片上,滴加3%过氧化氢。有 气泡阳性,不是粪链球菌;无为阴性,继续。 Ø 继续培养 转移到脑-心浸萃液态培养基和胆汁液态培养基分 别于45℃ 48h和36℃±1℃ 3d。 Ø 判定:若生长,为阳性。
假单胞菌属ppt课件
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被检验的肉含有荧光假单胞菌
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2.临床意义
荧光假单胞菌(P.fluorescens)存在于土壤和水等环境中,常与
食物(鸡蛋、血、牛乳等)腐败有关,可作为咽部的正常菌群存 在,是人类少见的条件致病菌,偶从泌尿道感染病人尿中分离出。 由于具有嗜冷性,可在冰箱储存血液中繁殖,若输入含有此菌的 血库血液,可导致病人不可逆性的休克而死亡。
3. 运用血清学实验,噬菌体分型做医院内感染的追踪调查
铜绿假单胞菌的菌落分型
典型型 大肠菌样型 粘液型 侏儒型 粗糙型
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菌落光滑凸起 成粘液状
粘液型(麦康凯平板)
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粘液型(血平板)
细小,无光泽 半透明菌落
侏儒型(麦康凯平板)
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菌落呈灰绿色 大小不一 扁平湿润 边缘不规 则呈伞状伸展 表面常可 见金属光泽
假单胞菌在环境的生物修复方面进行了广泛的研究, 大体可分为有机 物污染和重金属污染的生物修复两大类。
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由恶臭假单胞菌及荧光假单胞菌等革 兰氏阴性短杆菌引起。患病初期可见 鱼的体表有点状白色黏液物附着并逐 渐蔓延扩大,严重时鳞片基部充血、 竖起,鳞片脱落,体表及鳍基部充血, 肝、肾充血,靠边缓游不吃食,不久 即死亡。
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血平板检验
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斯氏假单胞菌
1.细菌特性 革兰阴性杆菌,一端单鞭毛,运动活泼;最适生长 温度35℃,4℃不生长,大部分菌株在42℃生长,氧化 葡萄糖产酸,在6.5%高盐培养基中可生长;营养要求 不高,普通平板可生长,新分离菌株在培养基上可形 成特征性干燥、皱缩样菌落,黏附于琼脂表面难以移 动,可产生黄色色素,无荧光。
铜绿假单胞菌分类鉴定PPT课件
特性:具有产生水溶性色素的能 力,使培养基呈现特有的铜绿色 ,同时具有氧化酶阳性、触酶阳 性等生化特征。
生物学分类
01
界
细菌界
02
科
假单胞菌科
03
属
假单胞菌属
04
种
铜绿假单胞菌
生态分布与环境适应
分布
广泛分布于自然界,如土壤、水 、空气等,也常见于人体皮肤、 肠道等部位。
环境适应
具有较好的适应性,可在多种环 境条件下生存,如低温、高温、 酸碱度变化等。
自动化细菌鉴定系统
利用自动化仪器对细菌进行快速鉴定,通过检测细菌的生理 生化反应,结合数据库比对,确定细菌的种属。
免疫学方法
利用特异性抗体对细菌进行抗原检测,通过免疫反应的阳性 或阴性结果判断细菌种类。
分子鉴定技术
16S rRNA基因测序
通过对细菌16S rRNA基因进行测序,与数据库中的序列进行比对,确定细菌的种属和种内亚型。
分子生物学分类
总结词
基于铜绿假单胞菌的基因组序列进行分类。
详细描述
通过分析细菌的基因组序列,可以揭示不同铜绿假单胞菌之间的遗传差异,从而 进行分类。
血清学分型
总结词
利用特异性抗体检测铜绿假单胞菌表 面抗原进行分类。
详细描述
通过检测细菌表面抗原与特异性抗体 结合的反应,可以确定不同血清型铜 绿假单胞菌之间的差异,从而进行分 类。
感染治疗与预防
感染治疗
铜绿假单胞菌感染的治疗主要依赖于抗生素,常用的抗生素包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类等。针对不 同感染部位和病情严重程度,选择合适的抗生素进行治疗。
预防措施
预防铜绿假单胞菌感染的措施包括加强环境卫生、提高免疫力、避免接触感染源等。对于易感人群和高危人群, 应定期进行健康检查和监测,及时发现并治疗感染。
食品中铜绿假单胞菌检测
一、概 述
• 铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)俗称绿脓杆菌, 因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素,使伤 口与创面呈绿色,故名绿脓杆菌。 • 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖, 生长营养需求不高,善于利用各种碳源和氨化合 物作为氮源,在水、土壤、食品以及医院等环境 广泛存在,甚至在蒸馏水、消毒液也不例外,如 季铵类消毒液,特别是含有一些有机物的液体。
3、生化特性 • 氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型, 还原硝酸盐为亚硝酸盐,分解乙酰胺产生氨。 98 %菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能 液化明胶,酪蛋白水解,但淀粉不水解。90 %以 上的菌株产生蓝绿色色素。 • 分解蛋白质能力强,发酵糖类能力较低,氧化分 解葡萄糖,产酸不产气,不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖,能液化明胶,分解尿素,不形吲哚,氧化 酶试验阳性,还原硝酸盐产气,靛基质阴性,不 产硫化氢。
三、致病性
• 主要致病物质是内毒素,此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症 ,也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸,还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻。 • WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌,可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群,饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生,患者食入103~104个菌体细 胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献。
产荧光素实验(金氏B培养基)
• 原理:蛋白胨提供氮源,磷酸盐促进荧光素 的产生并抑制绿脓色素的产生,硫酸镁为 荧光素的产生提供必须的阳离子,琼脂是 培养基的凝固。 • 操作:将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳 性的培养物接种于金氏B培养基上,于 36℃±1℃恒温箱培养24h~5d。 每天需取 出在紫外灯下检查其是否产生荧光性,将 5d内产生荧光的菌落记录为阳性。
《铜绿假单胞菌》课件
国际合作与未来展望
加强国际合作,共同应对铜绿 假单胞菌抗药性问题,分享最
佳实践和成功经验。
加大对新型抗菌药物的研究 和开发力度,寻找更有效的
治疗手段。
提高公众对抗生素合理使用的 认识,减少抗生素滥用,从源
头上遏制抗药性的产生。
THANKS
感谢观看
感染途径
铜绿假单胞菌主要通过破损的皮 肤、黏膜或接触污染的水或空气 传播。
症状
感染铜绿假单胞菌后,可引起皮 肤、呼吸道、泌尿道等部位的感 染,出现红肿、疼痛、发热等症 状。
疾病预防与控制
提高免疫力
保持健康的生活方式,加强锻炼,提 高自身免疫力,降低感染风险。
勤洗手
经常用肥皂和流动水洗手,或使用含 有至少60%酒精的手部消毒液。
避免接触污染水源和空气
避免接触可能被铜绿假单胞菌污染的 水源和空气,特别是医疗场所和游泳 池等公共场所。
合理使用抗菌药物
在医生的指导下合理使用抗菌药物, 避免滥用抗菌药物导致耐药性的产生 。
05
铜绿假单胞菌的检测与鉴 定
检测方法
培养法
将样本接种在选择性培 养基上,观察菌落形态 、颜色等特征,进行初
铜绿假单胞菌对碳源的利用较为广泛,可以利用多种糖类、醇类和有机 酸作为碳源。
生长条件
铜绿假单胞菌适宜在温暖、湿润的环境 中生长,最佳生长温度为30-37℃,适
宜pH值为6.0-7.5。
铜绿假单胞菌对干燥、氧气、紫外线等 环境因素较为敏感,因此在自然环境中
存活时间较短。
铜绿假单胞菌在营养丰富、有适宜生长 条件的环境下迅速繁殖,可在水、土壤 、空气、动物和人体皮肤等处广泛分布
04
铜绿假单胞菌的致病性
致病因子
食品安全标准中铜绿假单胞菌解读
食品安全标准中铜绿假单胞菌解读食品微生物检测01铜绿假单胞菌概况铜绿假单胞菌,因在代谢过程中产生水溶性的绿色色素,使伤口与创面呈绿色,又名绿脓杆菌,是一种条件致病菌,最适生长温度为35℃。
该菌对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强,且极易产生耐药性。
因对营养要求不高,铜绿假单胞菌广泛存在于水、土壤、空气、人和动物机体皮肤及肠道中,对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境有较强的抵抗力,易形成生物膜,且形成生物被膜后不易被彻底清除。
作为条件致病菌,其主要产生胞外酶、内毒素、外毒素A 等十余种致病因子,可引起化脓性感染、菌血症、急性肠道疾病和皮肤炎症等。
潮湿的环境是铜绿假单胞菌存在的重要条件,因此常见有包装饮用水铜绿假单胞菌不合格信息发布。
一般刚出厂的包装饮用水中铜绿假单胞菌数量较少且分布不均,在出厂检测时检出率较低。
但由于包装饮用水尤其桶装饮用水产品消费周期较长,该菌在十几天内即可繁殖达到10000 CFU/mL。
这些致病菌可因大量饮水冲淡胃酸而避开人体消化道防御屏障,导致食源性疾病发生。
夏季是包装饮用水消费量最大的季节,而且气温更接近于铜绿假单胞菌的最适生长温度,因此该季节是感染铜绿假单胞菌的高峰期。
02检验标准及限量要求铜绿假单胞菌的检验原理为根据其在特定培养基上特定的生长、形态和生理生化特征,首先用孔径为0.45μm的滤膜将250mL水样中的微生物截留,再将滤膜移至CN琼脂培养基上在36℃培养24小时~48小时,使滤膜上的微生物得以生长;之后结合菌落的颜色、荧光特性及乙酰胺肉汤、氧化酶等生化试验对疑似菌落进行确认,判定是否检出并计数铜绿假单胞菌。
我国现行检验标准为GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》中“57铜绿假单胞菌”。
我国现行食品安全国家标准对铜绿假单胞菌的限量控制主要是针对包装饮用水和饮用天然矿泉水。
GB 19298-2014《食品安全国家标准包装饮用水》和GB 8537-2018《食品安全国家标准饮用天然矿泉水》对铜绿假单胞菌的限量规定均为n=5,c=0,m=0(CFU/ 250mL)。
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3、生化特性 • 氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型, 还原硝酸盐为亚硝酸盐,分解乙酰胺产生氨。 98 %菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能 液化明胶,酪蛋白水解,但淀粉不水解。90 %以 上的菌株产生蓝绿色色素。 • 分解蛋白质能力强,发酵糖类能力较低,氧化分 解葡萄糖,产酸不产气,不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖,能液化明胶,分解尿素,不形吲哚,氧化 酶试验阳性,还原硝酸盐产气,靛基质阴性,不 产硫化氢。
如滤膜未经灭菌,则使用前需先将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌3次,每 次15 min。前两次煮沸后需更换水,用蒸馏水洗涤2次~3次,以除去残留溶剂。建议使用一次性无 菌滤膜。)
• 显微镜:10×~100× • 冰箱:0℃~8℃
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操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分, 将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上, 固定好滤器,将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45μm的滤膜过滤,然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上, 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。
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• 铜绿假单胞菌可由多种途径传播,但主要是通过 污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性 感染,因此,对烧伤病房、手术器械及治疗器械 应进行严格消毒灭菌,以保证无铜绿假单胞菌的 污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗,可应用庆大 霉素、多粘菌素B和羧苄青霉素。 • 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强, 56℃1h可杀灭,对很多抗生素具有耐受性。对消 毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗 力强,对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌 强大。
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三、实验室检验
GB/T 8538-2008 铜绿假单胞菌检测(滤膜法)
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原
理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤, 并将滤膜移至CN琼脂培养基上,于36℃士1℃恒 温箱中培养48h,能够在CN琼脂上生长并产生绿 脓菌素,或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈 阳性、紫外光(360±20nm)照射下能发荧光、 能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌, 经证实为铜绿假单胞菌,则其检测结果为阳性。
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结果观察
培养20h~24h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数,防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合。( 40h~48h时更 容易观察产色素情况和荧光情况)。
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可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色(绿脓色素)的菌落,初步 判定为铜绿假单胞菌。 • 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单 胞菌菌落,并进行乙酰胺肉汤确定试验。 (在紫外线下检查滤膜时,应避免长时间在紫外光 下照射,否则可能会将平板上的菌落杀灭,而导 致无法在证实培养基上生长。) • 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、 乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。
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三、致病性
• 主要致病物质是内毒素,此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症 ,也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸,还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻。 • WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌,可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群,饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生,患者食入103~104个菌体细 胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献。
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纯 化
• 营养琼脂:将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基,于36℃±1℃培养 20h~24h,对可疑菌进行纯化。
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将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验 • 氧化酶试验 : • 原理:氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统 的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C氧 化,再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化,生成有色的 醌类化合物。 • 操作:取2~3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的 洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒,将适量的纯种培 养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为 阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进 行该项测试。
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培养基和试剂
• 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂(低温避 光保存) • 金氏B 培养基(低温避光保存) • 乙酰胺肉汤 • 营养琼脂 • 氧化酶试剂 • 钠氏试剂(配制好之后低温避光保存)
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设备和仪器
• 玻璃器具:所有玻璃器皿使用前需121℃高 压蒸汽灭菌15分钟 • 恒温培养箱:36℃±1℃ • 紫外灯:波长应为360±20nm • 滤膜:直径47mm,微孔径为0.45μm (处理特性 本菌属于假单胞菌属,是一种 非发酵革兰阴性无芽孢杆菌,菌体 细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或 短链状排列。菌体的一端有单鞭毛,在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。 2.菌体形态 无芽孢,无夹膜,革兰阴性杆菌,有单鞭毛 或丛鞭毛,运动活泼。菌体的大小为0.5~ 1µm×1.5~3.0µm,菌体笔直或弯曲。
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国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况:
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2%~23.6%; -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6%。 • 国外污染情况: -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌; -Rosenberg报告德国1.2%~10.2%的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。 • 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少,但有文献报 道5加仑桶装产品(15~31天的保存期),铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml。 • 国内卫生标准:0 CFU/250ml
铜绿假单胞菌
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一、概 述
• 铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)俗称绿脓杆菌, 因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素,使伤 口与创面呈绿色,故名绿脓杆菌。 • 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖, 生长营养需求不高,善于利用各种碳源和氨化合 物作为氮源,在水、土壤、食品以及医院等环境 广泛存在,甚至在蒸馏水、消毒液也不例外,如 季铵类消毒液,特别是含有一些有机物的液体。