细菌鉴定流程ppt课件
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细菌学检验ppt课件
2、标本的直接检查： ★ 直接显微镜检查：
革兰阴性小杆菌或多形态杆菌，结合临床 症状，可做出初步诊断。
★ 抗原检测
荚膜肿胀试验等
★ 核酸检测
3、分离培养与鉴定 （1) 分离培养
★ ★ ★ ★ 营养要求：高，生长中需要X、V因子。 气体环境：生长时需要5%～10%的CO2环境。 温度：35℃ 培养基：兔血或马血最好
方法：密集划线接种待测菌，再点种金葡菌，培养后观察。
流感嗜血杆菌
流感嗜血杆菌（兔血+X、V因子）
流感粘液型菌落
大菌落为奈瑟菌
小菌落为嗜血杆菌
咽拭子培养（未加万古霉素）
咽拭子培养（加万古霉素）
标本接种后点种金葡菌
卫星现象
琼脂卫星试验（脑心琼脂）
X、V因子需求试验→又称纸片法卫星试验
① 不含血液琼脂平板上密集划线接种待测菌或0.5麦 氏单位菌悬液涂抹接种。 ②将X、V、X+V因子三种纸片贴在接种细菌的平板上 纸片间相距5cm以上，（因为V因子分子量小，扩散 距离远），否则会出现X因子假阳性结果。 ③培养后观察结果 ④ （X+V）因子结果阴性的几种可能原因
一、分类
根据伯杰细菌分类手册，嗜血杆菌属隶属于 巴斯德菌科。本菌属共包括17个菌种，其中与临 床有关的有9种，分别是流感嗜血杆菌、副流感 嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、杜 克雷嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、嗜沫嗜血杆菌、 副嗜沫嗜血杆菌和迟缓嗜血杆菌。后三者现划归 “凝聚杆菌属”。
二、临床意义
1、致病因子：细菌结构成分、毒素和酶类。
2、在假单胞菌属细菌引起的临床感染中占70%。 3、可引起机体各个系统的感染。 4、眼部感染的铜绿假单胞菌可合成胶原酶，引起角膜 穿孔而失明。
微生物细菌鉴定试验汇总ppt课件
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19
硝酸盐还原试验方法
方法：
取一环待检菌接种到硝酸盐琼脂斜 面上，35℃培养18~24小时，然后依次 加入含α-萘氨和对氨基苯磺酸的试剂 各1mL，30s后观察结果。
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20
应用：
有助于鉴别肠杆菌科、奈瑟菌属、布 兰汉菌属、假单胞菌属等
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21
氧化酶试验
原理：
某些细菌具有细胞色素氧化 酶，能将二甲基对苯二胺或四 甲基对苯二胺试剂氧化成紫红 色醌类化合物
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34
6.克氏双糖铁（KIA）复合试验
【方法】：将待检菌接种于克氏双糖铁培养基（底 层穿刺，上层斜面划线），35ºC，24h，观察。
【结果】：发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则上层和 底层均呈黄色且有气泡产生；只发酵葡萄糖而不 发酵乳糖，则底层变黄，上层仍为红色。如底层 变黑，说明该菌产生硫化氢，生成黑色的硫化铁 沉淀。
30
3.甲基红试验
【原理】：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一 步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH 在4.5以下， 加入甲基红指示剂后呈红色（阳性）；有些细菌分解葡萄 糖产生的酸进一步化为醇、酮等非酸性物质，使培养基pH 在6.2以上，加入甲基红指示剂后呈黄色（阴性）。
【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种葡萄糖蛋白胨 水培养基中，35ºC18-24h，加入甲基红指示剂2-3滴观察 结果。
应用：
用于鉴定B群链球菌。
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3）CAMP试验
• 无乳链球菌能产生CAMP因子，它可促进金黄色葡萄 球菌溶血能力，使其产生显著的协同溶血作用。本 法可作为无乳链球菌的初步鉴定试验
标本
涂片：G+C
细菌的分离、培养和鉴定ppt课件
请大家自觉维持实验室的卫生和秩序！
Hale Waihona Puke 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
细菌的分离、培养与鉴定
王欣欣
一、细菌的分离
1、从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的 方法称为分离。 2、分离的目的在于从被检材料中、或者从 污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
1)病料采集
病料：疑似细菌性疾病的水产养殖动物 以鱼为例，常见症状：体色发黑，体表溃 烂、充血、粘液增多，鳃、鳍破损，内脏 红肿，腹水，眼球凸出或浑浊，肛门红肿 等等。 活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中 的部位（上述症状） 病料死后→应立即采集，越早越好
生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
ATB Expression：自动化微生物鉴 定和药敏分析系统
分子生物学技术
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核 酸检测技术, 包括基因测序、指纹图谱技术、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等。
培养基的种类 ① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物
质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂） ② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质
（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E） ③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】 ④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养 基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物， 能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应； 从而达到区分不同的微生物。（TCBS）
Hale Waihona Puke 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
细菌的分离、培养与鉴定
王欣欣
一、细菌的分离
1、从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的 方法称为分离。 2、分离的目的在于从被检材料中、或者从 污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
1)病料采集
病料：疑似细菌性疾病的水产养殖动物 以鱼为例，常见症状：体色发黑，体表溃 烂、充血、粘液增多，鳃、鳍破损，内脏 红肿，腹水，眼球凸出或浑浊，肛门红肿 等等。 活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中 的部位（上述症状） 病料死后→应立即采集，越早越好
生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
ATB Expression：自动化微生物鉴 定和药敏分析系统
分子生物学技术
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核 酸检测技术, 包括基因测序、指纹图谱技术、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等。
培养基的种类 ① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物
质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂） ② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质
（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E） ③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】 ④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养 基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物， 能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应； 从而达到区分不同的微生物。（TCBS）
微生物的鉴定ppt课件
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
微生物的鉴定（identification）:
借助于现有的微生物分类系统，通过特 征测定，确定未知的、或新发现的、或未 明确分类地位的微生物所应归属分类群的 过程。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。 利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎双球菌等菌分成数 十种菌型。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
4．生态学特征
生态学特征主要包括它与其它生物之间的关系（是 寄生还是共生？寄主范围以及致病的情况）、在自然界 的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是 否耐高渗、是否有嗜盐性等）。
在具体鉴定时，可参看中国科学院微生物研究所 细菌分类组编著的《一般细菌常用鉴定方法》一书。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
3．要有合适的鉴定方法
微生物种类繁多，特征各异，性状有主次之分。 因此，在鉴定某种微生物时，要选用合适的鉴定方法， 确定主要的测试项目。
微生物的鉴定（identification）:
借助于现有的微生物分类系统，通过特 征测定，确定未知的、或新发现的、或未 明确分类地位的微生物所应归属分类群的 过程。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。 利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎双球菌等菌分成数 十种菌型。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
4．生态学特征
生态学特征主要包括它与其它生物之间的关系（是 寄生还是共生？寄主范围以及致病的情况）、在自然界 的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是 否耐高渗、是否有嗜盐性等）。
在具体鉴定时，可参看中国科学院微生物研究所 细菌分类组编著的《一般细菌常用鉴定方法》一书。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
3．要有合适的鉴定方法
微生物种类繁多，特征各异，性状有主次之分。 因此，在鉴定某种微生物时，要选用合适的鉴定方法， 确定主要的测试项目。
细菌的培养及鉴定 ppt课件
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’ 3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥 油镜观察
细菌的培养及鉴定
美蓝复染1 ’
抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
细菌培养及鉴定
细菌的培养及鉴定
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂 5.采样后立即送检 6.送检标本应注明细菌来的培源养及和鉴定检验目的
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
细菌的培养及鉴定
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 ➢收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水
冲洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 ➢翻转包皮，清洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
采集标本后立即送检！
细菌的培养及鉴定
常用的培养基种类和用途
细菌的培养及鉴定
革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’ 3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥 油镜观察
细菌的培养及鉴定
美蓝复染1 ’
抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
细菌培养及鉴定
细菌的培养及鉴定
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂 5.采样后立即送检 6.送检标本应注明细菌来的培源养及和鉴定检验目的
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
细菌的培养及鉴定
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 ➢收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水
冲洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 ➢翻转包皮，清洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
采集标本后立即送检！
细菌的培养及鉴定
常用的培养基种类和用途
细菌的培养及鉴定
革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
《细菌鉴定》PPT课件
特殊气味等
形态学观察
* 营养需求（血琼脂、巧克力、营养琼脂生长 情况）
* 胆盐耐受（麦康凯生长情况） * 万古霉素耐受（含万古霉素巧克力生长情况） * 液体培养基生长现象（菌膜、上半部生长、
均匀浑浊、下半部生长、沉淀） * 半固体动力现象（清晰、毛刷样、倒伞状）
生化反应
* OF试验 * 各种糖发酵试验、糖氧化试验 * 糖衍生物发酵（α/β-甲基葡萄糖、β-葡萄糖胺、
不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作 时的难度而采用不同的鉴定手段
* 目前技术能培养的细菌采用传统手段
* 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、 肺炎支原体、肺炎衣原体等）
* 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体 血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细 胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、 挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分 析
血清学试验（不常用）
* 铜绿假单胞菌生物分型血清 * 脑膜炎奈瑟菌分型血清 * 隐球菌可溶血抗原血清 * 脑膜炎5种可溶性抗原复合乳胶
* b型流感嗜血杆菌乳胶 * 肺炎链球菌乳胶（含83个血清型的多价血清） * A群脑膜炎奈瑟菌乳胶 * B群脑膜炎奈瑟菌/大肠埃希菌K1乳胶 * C群脑膜炎奈瑟菌乳胶
然耐药反证法鉴定
形态学试验
G+菌 BA生长、Choc不生长、MecK不生长，——Gram染色： 分G+co（革兰阳性球菌） ,G+ b（革兰阳性杆菌）
G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形 态区分:
▲葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则 圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外， 一般不具有临床意义；
血清学试验（不常用）
形态学观察
* 营养需求（血琼脂、巧克力、营养琼脂生长 情况）
* 胆盐耐受（麦康凯生长情况） * 万古霉素耐受（含万古霉素巧克力生长情况） * 液体培养基生长现象（菌膜、上半部生长、
均匀浑浊、下半部生长、沉淀） * 半固体动力现象（清晰、毛刷样、倒伞状）
生化反应
* OF试验 * 各种糖发酵试验、糖氧化试验 * 糖衍生物发酵（α/β-甲基葡萄糖、β-葡萄糖胺、
不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作 时的难度而采用不同的鉴定手段
* 目前技术能培养的细菌采用传统手段
* 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、 肺炎支原体、肺炎衣原体等）
* 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体 血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细 胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、 挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分 析
血清学试验（不常用）
* 铜绿假单胞菌生物分型血清 * 脑膜炎奈瑟菌分型血清 * 隐球菌可溶血抗原血清 * 脑膜炎5种可溶性抗原复合乳胶
* b型流感嗜血杆菌乳胶 * 肺炎链球菌乳胶（含83个血清型的多价血清） * A群脑膜炎奈瑟菌乳胶 * B群脑膜炎奈瑟菌/大肠埃希菌K1乳胶 * C群脑膜炎奈瑟菌乳胶
然耐药反证法鉴定
形态学试验
G+菌 BA生长、Choc不生长、MecK不生长，——Gram染色： 分G+co（革兰阳性球菌） ,G+ b（革兰阳性杆菌）
G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形 态区分:
▲葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则 圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外， 一般不具有临床意义；
血清学试验（不常用）
细菌的分离培养与鉴定PPT课件
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22
硫化氢产生试验(Production of H2S)
将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中， 37℃培养24h后观察结果。有些细菌能分解 培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺 部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色 无变化，则为阴性。
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23
尿素分解试验(Splitting of urea)
➢ 相邻两区要有重叠区域。 ➢ 结果观察：观察各区的生长情况，并看是
否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、 大小、边缘、透明度都需记录。
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8
平皿送37℃温箱培养24小时 结果(要求)
两种单个菌 落
分四区 无杂菌 琼脂不破
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9
℃
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10
3.2 细菌的接种
斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。
将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养 18～24h。变形杆菌能迅速(2～4h)分解尿素 产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色， 是为阳性反应。
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24
实验后处理
将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！ 将所有的原菌种管放入自己组的红框试管架
中ห้องสมุดไป่ตู้ 将自己接种的培养物集中在试管架中统一放
入培养箱中37度培养！ 关照明和电扇开关，请勿关实验室总电
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17
糖发酵试验
不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。 例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾 杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使 两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽 相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄 糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2， 故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵 葡萄糖仅产酸不产气。
细菌学检验ppt课件
·
8
二、染色标本
（一）常用染料 1．碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等 2．酸性染料：有伊红、刚果红等 3．复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有
瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青） 等；荧光染料有荧光标记的抗体
11.12.2020
·
9
革兰染色（gram stain） 方法：
（二）常用的染色方法
1、结晶紫初染
1 min
2、卢戈氏碘液媒染 1 min
革兰阳性球菌
3、95％酒精脱色 30sec～1 min
4、稀释石炭酸复红复染 1 min
原理：
G+等电点低，带正电荷的碱性燃 料作色牢固
G+细胞壁肽聚糖层多，G-细胞壁 脂质含量高
G+含有多量核糖核酸镁盐与结晶 紫、碘结合成大分子复合物
革兰阴性杆菌
11.12.2020
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(一)培养基的组成成分
1．营养物质 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、 无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子
2．凝固物质 琼脂、明胶、卵白
3．抑制剂和指示剂 胆盐、蔷薇酸等，酚红、中性红、溴甲酚紫等
11.12.2020
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（二）培养基种类
1．基础培养基（based medium） 2．营养培养基（nutrient medium） 3．鉴别培养基（differential medium） 4．选择培养基（selective medium） 5．特殊培养基（special medium）
11.12.2020
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18
1．基础培养基（based medium）
含有大所属细菌生长所需 的基本营养成分，最常用的是 肉浸液，俗称肉汤（broth）， 主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。 用于培养一般细菌
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• 用血清凝集方法鉴定的准确性接近100%
11
无乳链球菌-CLSI
• 血平板上常表现为边缘光滑的窄的"溶血环" • 革兰阳性球菌成对或成链,触酶阴性; • 快速马尿酸盐水解试验阳性或快速CAMP因子
斑点试验阳性均可准确鉴定无乳链球菌 • 商用凝集试验鉴定该菌准确性接近100%
12
肠球菌
• 触酶试验阴性 • 七叶苷试验阳性 • 6.5%NaCl肉汤生长（高盐+）
20
肠杆菌科细菌
• 沙门菌属： KIA（克氏双糖铁）-/+，M
（动力）+，H2S（硫化氢）+（但甲型副 伤寒H2S-）
• 志贺菌属：KIA（克氏双糖铁）-/+，M
（动力）-
• 耶尔森菌属：鼠疫耶尔森菌—烈性传染病鼠
疫的病原菌；小肠结肠炎耶尔森菌— 37℃,动力- ； 但25℃，动力＋ ；假结核耶尔森菌—人兽共患性 疾病
+
+
+/－
－
+
+
+/－
葡萄糖发酵试 验（O/F）
O/－
O
O
O/－
－
－
－
动力
+/－
+/－
+/－
－
+
+
－
24
铜绿假单胞菌-CLSI
• 革兰阴性杆菌.氧化酶阳性,菌落有典型的气味(康科德葡萄 或玉米饼)和形态特征(金属或珍珠般光泽,粗糙,产色,有时 极其黏稠).
• 黏液型菌株革兰染色时在革兰阴性杆菌的周围常常可见橙 色区域.
细菌鉴定流程
1ห้องสมุดไป่ตู้
葡萄球菌
2
金黄色葡萄球菌
• 血平板上生长的由白色至黄色,奶酪样,不透 明,革兰阳性球菌.
• 触酶阳性 • 凝固酶试验阳性 • 或商用乳胶凝胶试剂阳性
3
金葡鉴定注意事项
• 玻片凝固酶 注意：施葡萄球菌和路邓葡萄球菌也可为阳性，但凝集反应呈片状或块状。 可通过PYR（吡咯烷酮酶）试验与金黄色葡萄球菌鉴别。 施葡萄球菌和路邓葡萄球菌为PYR（吡咯烷酮酶）强阳性,立即产生红紫色,而 金黄色葡萄球菌为阴性或弱阳性,
试验 氧化酶 6.5% Nacl生长 赖氨酸 150mg O/129纸片 10mg O/129纸片
化脓性链球 A 菌
敏感
CAMP —
无乳链球菌 B
耐药
+
C群、G群 C、G
耐药
—
SMZ R
R S
8
β溶血链球菌
• 化脓性链球菌 • B群链球菌
9
杆菌肽试验
CAMP试验
10
化脓链球菌-CLSI
• BAP上孵育24H 后出现ß溶血,菌落直径 >=0.5mm,干燥,凸起或有边缘清晰的溶血 环.
• 革兰阳性球菌,成双或成链排列,触酶阴 性,PYR（吡咯烷酮酶）试验阳性可确认 为化脓链球菌
• 局限性,极少数气单胞菌属分离菌株可与铜绿假单胞菌形 态相似(缺乏典型气味),可通过斑点吲哚试验区分(气单胞 菌属阳性,铜绿假单胞菌阴性).
• 分离于囊性纤维化患者的菌株应仔细鉴别,因为形态不典 型的铜绿假单胞菌很常见,而且某些洋葱伯克霍尔德分离 菌株与铜绿假单胞菌形态相似.
25
弧菌属与气单胞菌，邻单胞菌鉴别
• 4h快速试管凝固酶试验阳性 注意：1.试管法应该至少每小时判读一次直至4h.试管法的最后读取应在4h 后. 2.中间葡萄球菌和猪葡萄球菌可在12-24h 试管凝固酶试验为阳性. 3.凝固酶试验仅推荐用无菌乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝兔血浆.
* 商用乳胶凝胶试剂 腐生葡萄球菌在某些情况下可表现为阳性,但其玻片凝固酶及试管凝固酶试验 通常为阴性. 因此,商用凝集试验阳性结果不能用来鉴别尿中的非溶血葡萄球菌
22
变形杆菌-CLSI
• 菌落一定是有迁徙生长现象. • 奇异变形杆菌吲哚-,普通变形杆菌+ • 彭氏变形杆菌与奇异变形杆菌的鉴别
菌种
麦芽糖 鸟氨酸脱羧酶
彭氏变形杆菌 阳性 阴性
奇异变形杆菌 阴性 阳性
23
非发酵菌
试验
菌属
假单胞菌属 无色杆菌属
黄杆菌属
不动杆菌属 产碱杆菌属
丛毛菌属
摩拉菌属
氧化酶试 验
16
17
革兰阴性杆菌
18
肠杆菌科细菌主要生化反应
• 发酵葡萄糖（产酸或产酸产气） ： KIA（克
氏双糖铁试验）或三糖铁试验
• H2O2 （触酶）+ • OX （氧化酶）-
19
肠杆菌科细菌
• 大肠埃希菌：动力“+”；但某些菌株动力“—” • 克雷伯菌属：动力-，脲酶＋ • 肠杆菌属，泛菌属，哈夫尼菌属： • 枸橼酸杆菌属：生化反应不定 • 沙雷菌属： • 变形杆菌属，普罗威登菌属，摩根菌属：
13
肠球菌鉴定-CLSI
血平板上菌落大于1mm,BAP上非溶血且触 酶阴性 革兰染色形态为阳性球菌或球杆菌成对或成 链 PYR（吡咯烷酮酶）试验阳性可鉴定为肠 球菌属. 增加亮氨酸氨肽酶(LAP)试验可更好地鉴定 α溶血肠球菌
14
革兰阳性细菌鉴定卡GP-VITEK-2
注意事项： • 细菌的要求：新鲜；纯培养菌落 • 无菌盐水：0.45%-0.50%NaCL,pH 4.5-7.0 • 浊度：0.50-0.63 • 悬浮接种物接种于卡前，不能超过30min • 可能性百分率：可接受>85% • 附加信息：补充实验
21
大肠埃希菌-CLSI
• 革兰阴性杆菌,不迁徙生长 • 斑点吲哚试验阳性,氧化酶阴性, 有以上特征并且血平板上
形成溶血菌落,即可报告为大肠埃希菌. • 或吲哚阳性,血平板菌落不溶血且麦康凯或伊红美兰(EMB)
平板上的菌落乳糖分解阳性,快速吡咯烷酮芳基酰胺酶 (PYR) 试验阴性可确认为大肠埃希菌。 • 或BAP菌落不溶血,乳糖分解阴性,4-甲基伞型酮β-D-葡糖 苷酸酶(MUG) 试验阳性也可确证为大肠埃希菌
矛盾实验
15
革兰阳性细菌鉴定卡GP -VITEK-2
• 局限性:VITEK-2 GP卡不能直接用于临床标本或含有
混合菌的样本，对过程的改变或修改都可能影响结果。 新的说明或罕见菌株不包含在GP数据库中，
当所选菌株可获得时可加入数据库，但对没有记录的种类 进行检测时可能导致不被识别或错误鉴定
• 质控：每月以及更换批号时用相应的质控菌株（依说 明书，可选铅黄肠球菌ATCC700327或金葡ATCC29213 等）在仪器的质控通道下进行操作。
4
关键试验
• 触酶 • OF（氧化发酵）试验 • 血浆凝固酶：玻片法，试管法
5
链球菌科细菌
• α溶血：肺炎链球菌 • β溶血：化脓性链球菌
B群链球菌 C、G群链球菌 • γ溶血：肠球菌
6
肺炎链球菌
• 菌落形态 • Optochin试验：注意耐药菌株 • 胆汁溶菌试验
7
β溶血链球菌鉴定
菌种
血清分群 杆菌肽
11
无乳链球菌-CLSI
• 血平板上常表现为边缘光滑的窄的"溶血环" • 革兰阳性球菌成对或成链,触酶阴性; • 快速马尿酸盐水解试验阳性或快速CAMP因子
斑点试验阳性均可准确鉴定无乳链球菌 • 商用凝集试验鉴定该菌准确性接近100%
12
肠球菌
• 触酶试验阴性 • 七叶苷试验阳性 • 6.5%NaCl肉汤生长（高盐+）
20
肠杆菌科细菌
• 沙门菌属： KIA（克氏双糖铁）-/+，M
（动力）+，H2S（硫化氢）+（但甲型副 伤寒H2S-）
• 志贺菌属：KIA（克氏双糖铁）-/+，M
（动力）-
• 耶尔森菌属：鼠疫耶尔森菌—烈性传染病鼠
疫的病原菌；小肠结肠炎耶尔森菌— 37℃,动力- ； 但25℃，动力＋ ；假结核耶尔森菌—人兽共患性 疾病
+
+
+/－
－
+
+
+/－
葡萄糖发酵试 验（O/F）
O/－
O
O
O/－
－
－
－
动力
+/－
+/－
+/－
－
+
+
－
24
铜绿假单胞菌-CLSI
• 革兰阴性杆菌.氧化酶阳性,菌落有典型的气味(康科德葡萄 或玉米饼)和形态特征(金属或珍珠般光泽,粗糙,产色,有时 极其黏稠).
• 黏液型菌株革兰染色时在革兰阴性杆菌的周围常常可见橙 色区域.
细菌鉴定流程
1ห้องสมุดไป่ตู้
葡萄球菌
2
金黄色葡萄球菌
• 血平板上生长的由白色至黄色,奶酪样,不透 明,革兰阳性球菌.
• 触酶阳性 • 凝固酶试验阳性 • 或商用乳胶凝胶试剂阳性
3
金葡鉴定注意事项
• 玻片凝固酶 注意：施葡萄球菌和路邓葡萄球菌也可为阳性，但凝集反应呈片状或块状。 可通过PYR（吡咯烷酮酶）试验与金黄色葡萄球菌鉴别。 施葡萄球菌和路邓葡萄球菌为PYR（吡咯烷酮酶）强阳性,立即产生红紫色,而 金黄色葡萄球菌为阴性或弱阳性,
试验 氧化酶 6.5% Nacl生长 赖氨酸 150mg O/129纸片 10mg O/129纸片
化脓性链球 A 菌
敏感
CAMP —
无乳链球菌 B
耐药
+
C群、G群 C、G
耐药
—
SMZ R
R S
8
β溶血链球菌
• 化脓性链球菌 • B群链球菌
9
杆菌肽试验
CAMP试验
10
化脓链球菌-CLSI
• BAP上孵育24H 后出现ß溶血,菌落直径 >=0.5mm,干燥,凸起或有边缘清晰的溶血 环.
• 革兰阳性球菌,成双或成链排列,触酶阴 性,PYR（吡咯烷酮酶）试验阳性可确认 为化脓链球菌
• 局限性,极少数气单胞菌属分离菌株可与铜绿假单胞菌形 态相似(缺乏典型气味),可通过斑点吲哚试验区分(气单胞 菌属阳性,铜绿假单胞菌阴性).
• 分离于囊性纤维化患者的菌株应仔细鉴别,因为形态不典 型的铜绿假单胞菌很常见,而且某些洋葱伯克霍尔德分离 菌株与铜绿假单胞菌形态相似.
25
弧菌属与气单胞菌，邻单胞菌鉴别
• 4h快速试管凝固酶试验阳性 注意：1.试管法应该至少每小时判读一次直至4h.试管法的最后读取应在4h 后. 2.中间葡萄球菌和猪葡萄球菌可在12-24h 试管凝固酶试验为阳性. 3.凝固酶试验仅推荐用无菌乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝兔血浆.
* 商用乳胶凝胶试剂 腐生葡萄球菌在某些情况下可表现为阳性,但其玻片凝固酶及试管凝固酶试验 通常为阴性. 因此,商用凝集试验阳性结果不能用来鉴别尿中的非溶血葡萄球菌
22
变形杆菌-CLSI
• 菌落一定是有迁徙生长现象. • 奇异变形杆菌吲哚-,普通变形杆菌+ • 彭氏变形杆菌与奇异变形杆菌的鉴别
菌种
麦芽糖 鸟氨酸脱羧酶
彭氏变形杆菌 阳性 阴性
奇异变形杆菌 阴性 阳性
23
非发酵菌
试验
菌属
假单胞菌属 无色杆菌属
黄杆菌属
不动杆菌属 产碱杆菌属
丛毛菌属
摩拉菌属
氧化酶试 验
16
17
革兰阴性杆菌
18
肠杆菌科细菌主要生化反应
• 发酵葡萄糖（产酸或产酸产气） ： KIA（克
氏双糖铁试验）或三糖铁试验
• H2O2 （触酶）+ • OX （氧化酶）-
19
肠杆菌科细菌
• 大肠埃希菌：动力“+”；但某些菌株动力“—” • 克雷伯菌属：动力-，脲酶＋ • 肠杆菌属，泛菌属，哈夫尼菌属： • 枸橼酸杆菌属：生化反应不定 • 沙雷菌属： • 变形杆菌属，普罗威登菌属，摩根菌属：
13
肠球菌鉴定-CLSI
血平板上菌落大于1mm,BAP上非溶血且触 酶阴性 革兰染色形态为阳性球菌或球杆菌成对或成 链 PYR（吡咯烷酮酶）试验阳性可鉴定为肠 球菌属. 增加亮氨酸氨肽酶(LAP)试验可更好地鉴定 α溶血肠球菌
14
革兰阳性细菌鉴定卡GP-VITEK-2
注意事项： • 细菌的要求：新鲜；纯培养菌落 • 无菌盐水：0.45%-0.50%NaCL,pH 4.5-7.0 • 浊度：0.50-0.63 • 悬浮接种物接种于卡前，不能超过30min • 可能性百分率：可接受>85% • 附加信息：补充实验
21
大肠埃希菌-CLSI
• 革兰阴性杆菌,不迁徙生长 • 斑点吲哚试验阳性,氧化酶阴性, 有以上特征并且血平板上
形成溶血菌落,即可报告为大肠埃希菌. • 或吲哚阳性,血平板菌落不溶血且麦康凯或伊红美兰(EMB)
平板上的菌落乳糖分解阳性,快速吡咯烷酮芳基酰胺酶 (PYR) 试验阴性可确认为大肠埃希菌。 • 或BAP菌落不溶血,乳糖分解阴性,4-甲基伞型酮β-D-葡糖 苷酸酶(MUG) 试验阳性也可确证为大肠埃希菌
矛盾实验
15
革兰阳性细菌鉴定卡GP -VITEK-2
• 局限性:VITEK-2 GP卡不能直接用于临床标本或含有
混合菌的样本，对过程的改变或修改都可能影响结果。 新的说明或罕见菌株不包含在GP数据库中，
当所选菌株可获得时可加入数据库，但对没有记录的种类 进行检测时可能导致不被识别或错误鉴定
• 质控：每月以及更换批号时用相应的质控菌株（依说 明书，可选铅黄肠球菌ATCC700327或金葡ATCC29213 等）在仪器的质控通道下进行操作。
4
关键试验
• 触酶 • OF（氧化发酵）试验 • 血浆凝固酶：玻片法，试管法
5
链球菌科细菌
• α溶血：肺炎链球菌 • β溶血：化脓性链球菌
B群链球菌 C、G群链球菌 • γ溶血：肠球菌
6
肺炎链球菌
• 菌落形态 • Optochin试验：注意耐药菌株 • 胆汁溶菌试验
7
β溶血链球菌鉴定
菌种
血清分群 杆菌肽