抗体的制备

抗体的制备技术经历了三代： • 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用 抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗 体（polyclonal antibody）； • 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对 抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆 抗体(monoclonal antibody, McAb)； • 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来， 称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。

比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。 抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时，血 清中含有的杂蛋白比较多。

购买抗体时要注意厂商的标注
适合于做什么实验，使用浓度多少
• • • • • • WB（Western blotting ，免疫印迹) IHC (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) ICC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) IEM (Immunelectron microscopy,免疫电镜) FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶联免疫吸附实验，酶联免疫分析)
粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法： 注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒 ~1min)进行，时间过长会导致产热，破 坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过 的海沙使研磨更有效)。 匀浆液经离心，沉淀中含大量的组织细胞 和碎片，上清液可提取可溶性抗原。 消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细 胞间质消化，获得游离单个细胞。
是由于不同的抗原上有完全相同的 表位(100%的交叉反应)，或有相似 的表位(不同程度的交叉反应)。
多克隆抗体的特点
• 多抗是单抗的混合物，因此多抗的性 质是一个群体综合的性质。 • 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其 中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉 反应，所以多抗更容易有交叉反应。
1 4
Ag
2 3
抗原(antigen，Ag)
3.单克隆抗体 (Monoclonal Antibody, McAb)
由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体。
4.多克隆抗体 (Polyclonal Antibody，pAb)
用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动 物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多 种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清 实际上是含有多种抗体的混合物。
D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化 细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶 菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用 于多种微生物。 E、表面活性剂处理：在一定的条件下， 表面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡， 使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。 提取核酸时常用此法。 F、自溶法：利用组织和微生物的自身酶 系，在一定条件下使细胞溶解。
2. 免疫途径
• 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔 内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注 射等，一般常用皮下或背部多点皮内注 射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决 定于抗原的生物学特性和理化特性，如 激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一 般不宜采用静脉注射。
（三）免疫的基本步骤
1、基础免疫：首次抗原剂量大， 300～ 500μg，用福氏完全佐剂。 2、加强免疫：第2次以后，抗原量为首次 剂量的1/4～1/2，用福氏不完全佐剂， 每2～4周加强免疫一次，多次。
3、取血测效价：加强免疫两次或三次 以后的第7天取血。制备血清，检测 抗体效价。如未达到预期效价，需再 进行加强免疫，直到满意时为止。当 抗体效价达到预期水平时，即可放血 制备抗血清。
二、多克隆抗体制备
(一)免疫原的制备 免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统 产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原 最重要的性质是免疫原性（immunogenicity） 免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原
1. 颗粒性抗原的制备 (1)红细胞抗原的制备： A、新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细 胞并配制成2~5%，直接进行注射免疫。 B、新鲜血+抗凝剂— 4℃保存4W，免疫前 取适量抗凝绵羊血，按A处理。 C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。
抗体的制备
李成仁 组织学与胚胎学教研室
一、一些基本概念
1. 克隆(clone)
是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家 族的所有成员中，如无突变发生，其基因是 完全相同的。 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团
2. 抗原决定簇
是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学 基团，又称表位(epitope)，抗原结合位点
抗体制备技术
• 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的保存 • 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理
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抗体制备技术
（二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 • 三、基因工程抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术
• 兔子(rabbit)：最常用于自制抗体，抗 体量较多。最好用纯种新西兰兔， 大耳 白，体重以2～3kg为宜。 • 小鼠(mouse)：可用于自制抗体，但 抗体量很少。一般用BALB/C和昆明鼠 • 大鼠(rat)：可用于自制抗体，免疫过程 要麻醉动物。常用Wistar大鼠
• 羊(sheep、goat)：常用于较大批量地 生产抗体(商品)。 • 马（horse）：常用于大批量生产治疗 用抗体（商品）。 • 豚鼠(guinea pig)：国外实验室常用。
C、凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结 构，大分子在凝胶颗粒间很快通过，小 分子进入网孔，难于洗脱，将抗原分为 大、中、小三种。属区带分离法。 D、离子交换层析：利用带离子基团的纤 维或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
E、亲和层析：利用生物学分子间所具有 的专一亲和性而设计的层析方法。AgAb, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅 酶。
(2)蛋白质抗原的制备：破碎的细胞按一定 要求纯化，可获得不同成分的抗原。 A、超速离心法：利用各抗原在梯度液中 沉降速度不同，达到区带分离的目的。 这是分离亚细胞部分和蛋白质大分子的 有效手段。
B、选择性沉淀：是采用各种沉淀剂或改变 条件使抗原成分沉淀而达到分离的目的。 a、核酸除去法：用DNA/RNA酶降解或用氯 化锰/硫酸鱼精蛋白/链霉素作沉淀剂去除 核酸。 b、盐析沉淀法：用不同饱和度的硫酸铵或 硫酸钠。例如:用40、35、33%的硫酸铵 分次提取或用20%硫酸钠提取，即可获得 丙种球蛋白(含IgG 95%以上) 。
A、碳化二亚胺法 B、戊二醛法 C、氯甲酸异丁酯法 D、琥珀酸酐法 E、0-羧甲基羟胺法 F、一氯醋酸钠法 G、重氮化的对氨基苯甲酸法
(三)佐剂：与抗原同时或预先注射于 机体，能增强机体免疫应答或改变 免疫应答类型的物质，称为佐剂。 1、佐剂的条件： A、增加抗原的表面积，并改变抗原 的活性基团构型，从而增加抗原的 免疫原性。
C、福氏佐剂：分为不完全佐剂(石蜡 油+羊毛脂)和完全佐剂(石蜡油+羊 毛脂+卡介苗)。1:1与抗原混合研磨 均匀即可。但完全福氏佐剂局部注 射因易形成肉芽肿和持久溃疡而不 用于人体免疫。
(四)免疫动物
• 为获取高质量(特异性强和效价高)的 抗体，除了需制备质量好纯度高的抗 原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、 剂型、注射途径、注射次数、注射间 隔和接种动物的年龄均与免疫效果密 切的关系。
2. 可溶性抗原的制备 可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、 细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。 (1)细胞破碎：有如下方法： A、反复冻融法：置-15~-20 ℃冻结，然后 缓慢融化，反复2次，大部分细胞因胞内 冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被 融破。此法适用于组织细胞，对微生物 的细胞作用较差。
B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。 在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用 此法。 C、超声波破碎法：是利用超声波的机械 振动而使细胞破碎的方法。微生物和组 织细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子 则较难打破。
• 1. 用于免疫的动物：主要根据抗原的生 物学特性和所要获得抗体数量来选择。 ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来 源与免疫动物种属差异越远，其免疫源 性越强，免疫效果越好，而同种系或亲 缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符 合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗 体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等 小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、 山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类。
(2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用 0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶 液。 (3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫 卵悬液。
(4)组织细胞粗抗原：所用的组织必 须是新鲜或处理后低温(-40℃)保 存的。器官或组织材料得到后立即 去除表面的包膜或结缔组织及大血 管，用无菌NS进行灌注、洗涤至没 有残血、污物，在冷浴中将组织剪 成小块后粉碎(匀浆)/消化。
亲和层析的作用机理
(3)核酸抗原的制备：细胞破碎液去除蛋 白质(常用酚和氯仿抽提)后，用沉淀 剂(常用乙醇)沉淀核酸。 (4)脂多糖抗原的制备：苯酚提取法。 (5)Ig片段的制备：酶裂解法—Fc、Fab 氧化/还原法：轻、重链。
(6)纯化抗原的鉴定： 鉴定蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 • 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） • 分子的质量—电泳、质谱 • 蛋白的纯度—电泳等 • 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
1 Ag
B1
4
3
B2 B3 B4
2
多克隆抗体
B3 B3
B3
B3
单克隆抗体
单克隆抗体的特点
• 抗体的性质相同，容易纯化、标记。 • 特异性强，具有抗原结合位点的专一 性。(不是抗原的专一性！) • 因结合位点的单一性，有时不易捕捉 抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。
但单克隆抗体有交叉反应
c、有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的 介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电 荷的引力，导致溶解度降低而沉淀，有些 有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白 质沉淀，例Cohn地温酒精可将血浆蛋白分 为五组。IgG属CohnⅢ。 d、其它沉淀剂：常用聚乙二醇(PEG)和硫酸 葡聚糖。PEG浓度3~4%可沉淀IC，6~7% 沉淀IgM，8~12%沉淀IgG，12~15%沉淀 其它球蛋白，25%则沉淀白蛋白。
B、与抗原结合能延长抗原在局部组 织中的存留时间，达到持续刺激基 团产生高效价的抗体。 C、 可以激活免疫活性细胞，增强体 液免疫、细胞免疫和非特异免疫功 能。 D、 无毒、无副作用。
2、常用佐剂的种类和制备： A、铝乳：5%硫酸铝+5%NaOH，反 应后NS洗涤沉淀2次以上。1:1与抗 原混合。 B、明矾：硫酸钾铝在一定pH下产生 氢氧化铝胶体。制备方法是： Ag+NS，搅拌下缓慢滴入10%的硫 酸铝钾溶液，以NaOH校正pH至6.5， 离心、NS洗涤。
(二)半抗原免疫原的制备：利用某些功能 团将半抗原连接到载体上。 1、载体的选择： A、蛋白质：人/牛/兔白蛋白、牛甲状腺球蛋 白和血蓝蛋白等。最常用牛白蛋白。 B、多肽聚合物：多为人工合成(多聚赖氨酸)。 C、大分子聚合物和某些颗粒：聚乙烯吡咯 烷酮(PVP)，羧甲基纤维素，活性碳，乳酸 等
2. 连接方法：半抗原与载体的连接有物 理法和化学法。 • 物理法：用吸附法将载体与半抗原连接， 其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等； • 化学法：利用某些功能基团把半抗原连 接到白质类或多肽类聚合物载体上。不 同的半抗原应选用不同的方法进行连接。