Rh(D)血型鉴定SOP

二、Rh（D）血型鉴定操作规程

[目的]

保证Rh（D）血型鉴定准确，确保临床输血安全。

[适用范围]

XXX医院输血科

[职责]

输血科具有专业技术的工作人员主要负责本院输血（或备血）标本的Rh（D）血型鉴定（只对该单份标本负责）。

[相关文件]

试剂采购、保存和使用管理程序

设备采购、使用管理程序

消毒与清洁管理程序

标本采集、运输、保存和报废管理程序

紧急用血管理程序

[相关记录]

仪器设备的采购、使用和维护记录

仪器的温度记录

恒温水温箱的换水和消毒记录

消毒液的配置记录

清洁消毒记录

试剂采购、使用记录

标本交接和报废记录

紧急用血记录

[实验原理]

Rh（D）血型是由红细胞表面是否存在或缺失D抗原来确定的。D抗原与细胞株BS226细胞产生的单克隆抗体发生特异性反应。红细胞与抗-D抗体发生特异性凝集反应表明该细胞有D抗原，称为Rh（D）阳性；反之，无特异性凝集现象表明试验的红细胞缺少正常强度的D抗原，称为Rh（D）阴性。

[仪器器械]

玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、普通离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。

[试剂]

抗-D试剂

[标本收集与处理]

无菌操作采集血液标本,采集后的标本尽可能立即进行实验。如果不能立即实验,应将标本储存于2-8C冰箱内。收集在ACD、CPD、CPD－2A液中的血液标本,不超过21天仍可进行实验，但是加EDTA、肝素和凝集的血液标本，实验应在2天内进行。

[实验方法与步骤]

1、盐水试管法

①、正常D抗原表型检测

Ⅰ、制备受检者2~5%红细胞悬液。

Ⅱ、取一只干净玻璃试管，加1滴抗D试剂。

Ⅲ、加入1滴受检者2~5%红细胞悬液。

Ⅳ、混匀后，1000rpm离心1分钟或3400rpm离心20秒。

Ⅴ、轻轻振荡，悬浮沉积细胞，肉眼观察有无凝集反应，若肉眼观察有凝集反应，则判定为Rh（D）阳性；若肉眼观察无法判断有无凝集反应，则应混匀后用低倍镜进行观察。

Ⅵ、若镜下观察有凝集反应，则仍判定为Rh（D）阳性；若镜下观察无凝集反应，则应继续进行下列操作：

Ⅶ、混匀后进行37℃水浴15分钟。

Ⅷ、1000rpm离心1分钟或3400rpm离心20秒。

Ⅸ、轻轻振荡，悬浮沉积细胞，肉眼观察有无凝集反应，若肉眼观察有凝集反应，则仍判定为Rh（D）阳性；若肉眼观察无法判断有无凝集反应，则应再混匀后用低倍镜进行观察。

若镜下观察有凝集反应，则仍判定为Rh（D）阳性；若镜下观察仍无凝集反应，则判定为Rh（D）阴性，需要时还应进行弱D表型检测实验。

②、弱D表型抗原检测

Ⅰ、操作步骤与上述盐水试管法检测正常D抗原表型相同。如果先前已进行了盐水试管法实验，同一试管可直接用弱D表型检测实验。

Ⅱ、混匀后，37℃水浴15分钟。

Ⅲ、用干净的等渗盐水洗涤细胞至少4次，洗涤后充分将盐水弃掉。

Ⅳ、加2体积广谱抗人球蛋白于细胞试管中。

Ⅴ、轻轻混匀，500Xg低速离心15秒。

Ⅵ、轻轻振荡，悬浮沉积细胞，肉眼观察有无凝集反应，若肉眼观察有凝集反应，则判定为Rh血型弱D抗原阳性；若肉眼观察无法判断有无凝集反应，则应混匀后用低倍镜进行观察。

若镜下观察有凝集反应，则仍判定为Rh血型弱D抗原阳性；若镜下观察无凝集反应，则判定为Rh（D）阴性。

2 、玻片法：

①、干净玻片上加1滴抗D试剂。

②、再加入1滴35-45%的受检者红细胞悬液。

③、用干净涂棒，将试剂和血液充分混匀。

④、在一个照亮的观察箱上方轻轻前后倾斜玻片，观察凝集反应。并在显微镜下镜检证实。

⑤结果判断：有凝集时，表明所测的红细胞带有D抗原，判定为Rh（D）阳性；无凝集时，表明所测的红细胞缺少正常强度的D抗原，判定为Rh（D）阴性，但对于献血员应经过间接抗人球蛋白试验确定是否存在弱D表型。

[质量控制和注意事项]

1、抗D诊断试剂开封后，及时贴上开封时间标签，在效期内使用。

2、由于人红细胞的D抗原往往表现较弱，故必要时进行显微镜镜检，以免错判结果，特别是阴性结果时。

3、Rh血型鉴定应严格控制温度与时间，因Rh抗原、抗体集反应凝块比较脆弱，观察反应结果时，应轻轻侧动试管，不可用力振摇。

4、对于结果可疑的，必须洗涤红细胞后重新检验。

5、2~5%红细胞悬液的配制：先用生理盐水洗涤红细胞3次，再根据下表进行红细胞悬液的配制。

6

是IgM类免疫球蛋白人源单克隆抗体，因此不能用于间接抗球蛋白试验。

7、应该使用新鲜的、非溶血的血标本，可以是未加抗凝剂的血标本，或是加入抗凝剂EDTA或枸橼酸的血标本。必要时应使用经过加入等渗盐水离心（1000g，2分钟）洗涤后的标本所制备的红细胞悬液。推荐在制备红细胞悬液前，洗涤红细胞两遍，或洗涤上清至清澈。高脂肪性、黄疸性或微生物污染的标本可能会导致检测结果错误，因此应尽量避免使用。

8、应用试管法鉴定时，应同时平行进行阳性和阴性对照试验。

9、判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。

10、其它附注参见ABO血型鉴定和Rh（D）血型试剂说明书。

[假阳性反应原因分析]

1、试剂中存在具有其他特异性抗体（指不完全D抗体），因此对疑难抗原定型时，建议用不同来源的抗血清同时做两份试验。因为使用两份特异性相同的抗血清得到不一致的结果时，就会使检验人员意识到有进一步试验的必要。

2、多凝集红细胞与任何人血清都会发生凝集。

3、当用未经洗涤的红细胞做试验时，标本中的自由凝集素和异常蛋白质可能引起假阳性结果。

4、试剂瓶可能被细菌、外来物质或其他抗血清所污染。

[假阴性反应原因分析]

1、看错抗血清，每次试验时应细心核对抗血清瓶上的标签。

2、试管中漏加抗血清，在加入红细胞悬液之前，必须检查试管中有无抗血清。

3、某种特定的抗血清不能和与其相对应抗原的变异型起反应。

4、如某种抗血清含有主要对抗Rh复合抗原的抗体则可能与独立的基因产物的个别抗原不发生反应。

5、遵照抗血清使用说明书进行操作，如抗血清和红细胞悬液间比例以及反应温度和时间不准确。

6、抗血清保存不妥，试剂中的免疫球蛋白变质。

[临床应用]

用于常规检测人的Rh（D）血型归属。