蛋白不表达：常见原因及分析
质谱分析蛋白表达差异
百泰派克生物科技
质谱分析蛋白表达差异
质谱分析蛋白表达差异是利用质谱技术研究蛋白表达差异。
研究蛋白质表达差异，可以帮助我们认识生命活动的本质。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白表达差异分析服务。
蛋白表达差异
蛋白质是由基因转录后翻译形成的，是生物体中一类重要的生物大分子。
蛋白质除了参与生物体细胞和组织的组成，还可以在生物体中发挥广泛的功能，例如催化代谢反应、参与DNA复制、对刺激（如病原体）作出反应，以及将分子从一个位置运输到另一个位置等等。
蛋白表达差异，指的是蛋白质在表达水平上的变化，它可以发生在细胞在不同功能状态、不同细胞周期，或者是在不同条件或药物刺激等情况下。
研究蛋白质表达差异，可以帮助我们认识生命活动的本质，更有助于帮助我们研究疾病的早期诊断、疾病的病程，和检测药物对疾病的疗效等等。
质谱分析蛋白表达差异
质谱分析蛋白表达差异是利用质谱技术对蛋白表达差异进行研究。
质谱技术通过检测不同样品中蛋白质的差异表达，来实现样品中蛋白表达差异的分析。
借助生物信息学技术，还可以对有表达差异的蛋白进行分析，例如基于质谱数据可以对差异表达的蛋白质进行统计分析，如韦恩图和火山图，通过韦恩图可以看出两个差异样品之间的共有的和特有的差异表达蛋白数量，通过火山图（Volcano Plot）可以查看蛋白在两个不同样品中表达水平的差异，以及差异的统计学显著性。
His-Tag表达蛋白纯化原理、方法和问题分析
组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。
2．1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
荧光蛋白表达不均匀的原因
荧光蛋白表达不均匀的原因
荧光蛋白表达不均匀可能由多种原因引起，以下是一些可能的因素：1. 质粒拷贝数：质粒拷贝数的不均匀分布可能导致荧光蛋白表达的不均匀。
不同细胞可能含有不同数量的质粒，从而导致荧光蛋白表达水平的差异。
2. 转染效率：转染过程中，并非所有细胞都成功摄取质粒并表达荧光蛋白。
转染效率的差异可能导致不同细胞之间荧光蛋白表达的不均匀。
3. 细胞周期：细胞周期的不同阶段可能对荧光蛋白表达产生影响。
例如，在细胞分裂期间，荧光蛋白的表达可能受到抑制，导致表达不均匀。
4. 细胞健康状态：细胞的健康状态可能影响荧光蛋白的表达。
受损或死亡的细胞可能表达较少或不表达荧光蛋白，从而导致不均匀的表达。
5. 培养条件：培养细胞的条件，如营养供应、温度、氧气含量等，也可能对荧光蛋白表达产生影响。
不合适的培养条件可能导致表达不均匀。
6. 荧光蛋白稳定性：某些荧光蛋白可能在细胞内不稳定，容易降解或失活。
这可能导致荧光蛋白表达的不均匀和逐渐消失。
为了解决荧光蛋白表达不均匀的问题，可以尝试以下方法：
1. 优化转染条件：尝试不同的转染方法和试剂，以提高转染效率和均匀性。
2. 细胞筛选：选择转染效率高且荧光蛋白表达均匀的细胞系进行实验。
3. 培养条件优化：确保培养条件稳定，并提供适当的营养和环境。
4. 荧光蛋白选择：选择稳定性较高的荧光蛋白，并进行适当的表达和检测条件优化。
蛋白不表达原因
蛋白质不表达：常见原因及分析1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。
这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。
那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
WB常见问题解答
Western Blot常见问题及处理(一)1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可。
5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。
这是最主要的。
同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。
将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。
10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
蛋白不表达常见原因及分析
蛋白不表达常见原因及分析在生物学和医学研究中，蛋白表达是一个至关重要的环节。
然而，经常会遇到蛋白不表达的情况，这给研究工作带来了很大的困扰。
要解决蛋白不表达的问题，首先需要了解导致这一现象的常见原因。
一、基因层面的问题1、基因序列错误基因在转录和翻译过程中，需要遵循严格的碱基互补配对原则。
如果基因序列本身存在错误，比如碱基的缺失、插入或突变，就可能导致 mRNA 无法正确合成，或者合成的 mRNA 无法翻译成有功能的蛋白质。
2、基因调控元件异常基因的表达受到多种调控元件的控制，如启动子、增强子、沉默子等。
如果这些调控元件发生突变或缺失，可能会影响基因的转录起始效率，导致蛋白表达水平降低甚至不表达。
3、基因拷贝数不足在某些情况下，基因的拷贝数过低会导致转录产生的 mRNA 量不足，从而无法合成足够的蛋白质。
二、转录层面的问题1、 RNA 聚合酶活性受影响RNA 聚合酶负责将 DNA 转录为 mRNA，如果其活性受到抑制或者出现功能障碍，就会影响 mRNA 的合成，进而导致蛋白不表达。
2、转录因子异常转录因子能够与基因的调控元件结合，促进或抑制基因的转录。
当转录因子的表达水平、活性或与调控元件的结合能力出现异常时，可能会影响基因的正常转录。
三、翻译层面的问题1、密码子偏好性不同的生物体对某些密码子的使用频率存在差异。
如果在表达系统中使用了不常用的密码子，可能会导致翻译效率低下甚至停滞，从而造成蛋白不表达。
2、 tRNA 丰度不足tRNA 负责携带氨基酸参与蛋白质的合成。
如果某些特定 tRNA 的丰度不足，无法及时供应相应的氨基酸，就会影响蛋白质的翻译进程。
3、核糖体结合位点问题核糖体需要结合在 mRNA 上的特定位点才能启动翻译。
如果核糖体结合位点的序列发生突变或缺失，核糖体无法有效结合，蛋白合成也会受到阻碍。
四、蛋白折叠与修饰问题1、错误折叠即使蛋白质成功合成，若折叠过程出现错误，形成的错误构象可能会被细胞内的质量控制系统识别并降解，导致蛋白无法积累。
蛋白表达常见问题分析
蛋白表达常见问题分析影响蛋白表达有许多因素，如目的蛋白自身的特点，表达载体、表达菌株的组合，诱导表达的条件，培养基的选择等，都有可能对蛋白的表达产生影响。
针对蛋白表达中的一些常见问题，可尝试用如下方法加以解决。
一、蛋白不表达或表达量很低1．选择正确的表达载体与表达菌株基于T7 启动子的载体（如pET 系列载体）应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体（如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体）应选用BL21 表达菌株。
对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。
对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。
2．尝试不同的表达系统与菌株不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。
3．表达条件的优化选择不同的培养基。
对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明显提高表达量。
较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。
但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。
菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。
对于大部分蛋白，应在菌液的对数生长期（OD ≈ 0.5）进行诱导。
二、目的蛋白不可溶，形成包涵体首先确认目的蛋白是否有表达。
裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，还是形成了包涵体。
包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。
在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达系统与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。
目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。
蛋白不表达
蛋白不表达引言蛋白质是生物体中最基本的组成部分之一，它们在生物体内发挥着重要的功能。
然而，在某些情况下，蛋白质的表达可能会出现问题，导致一系列的生物学和医学问题。
本文将探讨蛋白质不表达的原因、影响以及可能的解决方法。
为什么蛋白不表达蛋白质的表达受到多种因素的调控，包括基因转录、蛋白翻译、蛋白质修饰等。
蛋白质不表达的原因可以是多方面的。
1. 基因转录问题基因转录是蛋白质表达的第一步，如果基因没有被正确地转录成mRNA，则无法进行后续的蛋白质翻译过程。
基因转录问题可能包括基因突变、转录因子缺失、启动子区域的变异等。
2. 蛋白翻译问题蛋白翻译是将mRNA转化为蛋白质的过程。
如果翻译过程中出现错误，或者翻译过程被抑制，都会导致蛋白质不表达。
蛋白翻译问题可能包括启动子序列的变异、翻译起始子的缺失、翻译因子的不足等。
3. 蛋白修饰问题蛋白修饰是调控蛋白质功能和活性的重要过程。
如果蛋白修饰过程出现问题，也会导致蛋白质不表达。
常见的蛋白修饰问题包括磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰方式的缺失或错误。
蛋白不表达的影响蛋白质不表达可能会对生物体的正常功能产生重大影响。
1. 细胞功能受损蛋白质作为细胞内重要的功能分子，参与了细胞的各种生物学过程。
如果某些关键的蛋白质不表达，细胞的正常功能将受到严重的影响，可能导致细胞死亡、代谢紊乱等现象。
2. 器官和组织功能受损蛋白质的功能不仅限于细胞内部，还可以参与组织和器官的正常功能调控。
如果某些关键的蛋白质不表达，可能导致器官和组织的功能受损，进而影响整个生物体的生理活动。
3. 疾病的发生和发展蛋白质的不表达也可能与一些疾病的发生和发展密切相关。
例如，某些肿瘤细胞中特定的肿瘤抑制因子蛋白质不表达，导致异常的细胞增殖和分化，从而促进肿瘤的发展。
解决蛋白不表达的方法针对蛋白质不表达的问题，科学家们提出了一系列的解决方法。
1. 基因治疗基因治疗是利用基因传递手段将正常的基因传递给患者，从而恢复蛋白质的表达。
免疫组化的判断
免疫组化的判断良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。
（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。
为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。
如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。
如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB或DAB的配制过程。
大量蛋白表达下调的原因
大量蛋白表达下调的原因有多种，包括：
1. 基因表达调控：基因的表达受到多种因素的影响，如转录水平、翻译水平、蛋白质降解等。
这些因素可能因细胞生理状态、环境因素、药物处理等因素而发生变化，导致蛋白表达下调。
2. 基因突变：基因突变可能导致蛋白质结构异常，从而影响其功能和稳定性，导致表达下调。
3. 染色体变异：染色体变异可以改变基因的表达调控序列，如启动子区域的顺式元件、增强子等，从而影响蛋白表达。
4. 信号转导通路异常：信号转导通路异常可以影响细胞对各种刺激的反应性，进而影响蛋白表达。
5. 转录因子失衡：转录因子可以调节基因表达，如果这些因子的平衡发生变化，也可能导致蛋白表达下调。
6. 蛋白降解途径增强：有些蛋白可能通过降解途径被迅速降解，如果这种途径增强，就会导致相应蛋白表达下调。
7. 细胞周期和凋亡：细胞周期和凋亡过程会动态调整细胞内蛋白质的表达。
以上是常见的一些原因，具体情况可能会因个体差异而有所不同。
如遇到特定情况，建议咨询专业医生。
WB中常见问题和解决方法（学术论文）
1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高。
●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
●拖尾原因：样品溶解不好。
●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。
●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。
●条带两边扩散原因：加样量过多。
2．Western blot结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。
●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。
●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。
●检测时曝光时间过长减少曝光时间。
3．Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。
●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
●上样量过高，太敏感适当减少上样量。
●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。
●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。
4.Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
蛋白不表达常见原因及分析定稿版
蛋白不表达常见原因及分析HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】蛋白不表达：常见原因及分析根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。
1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
蛋白质不表达的原因分析
蛋白质不表达：常见原因及分析1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。
这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。
那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
蛋白不表达常见原因及分析
蛋白不表达常见原因及分析蛋白质是生物体内最基本的结构单位，它们在细胞的生物化学功能中起着至关重要的作用。
然而，在某些情况下，蛋白质的表达可能会受到抑制或受到其他因素的干扰，导致其无法正常表达。
本文将探讨蛋白不表达的常见原因及其分析。
1. 基因突变基因突变是导致蛋白质不表达的主要原因之一。
突变可能引起DNA序列的改变，进而使正常的转录和翻译过程受到影响。
例如，点突变可能会导致氨基酸序列发生变化，从而影响蛋白质的结构和功能。
这种突变可能会导致蛋白质在转录或翻译过程中发生错误，并最终导致其无法正常表达。
2. 转录调控异常蛋白质的表达通常受到转录的调控。
转录调控是指在基因转录过程中通过启动子和调控因子来控制基因表达水平的调节机制。
如果转录调控过程中发生异常，例如调控因子缺失或突变，将导致蛋白质无法正常表达。
此外，DNA甲基化也是一种常见的转录调控机制，它可以通过甲基化基因组区域来静默基因的表达。
3. 翻译后修饰异常翻译后修饰是蛋白质合成后的重要过程，它可以调节蛋白质的结构和功能。
然而，某些异常情况下，翻译后修饰可能无法正确进行，导致蛋白质无法正常表达。
例如，翻译后修饰酶的缺失或突变可能会导致磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰无法进行，从而影响蛋白质的功能。
4. 细胞环境影响蛋白质的表达还受到细胞环境的影响。
细胞内环境的改变可能会影响蛋白质的产生和稳定性。
例如，异常的细胞应激反应、病毒感染、细胞内局部代谢物浓度的变化等都可能导致蛋白质无法正常表达。
5. 蛋白质降解异常蛋白质的降解也是影响蛋白质表达的重要因素。
异常的蛋白降解过程可能导致蛋白质无法稳定存在。
例如，异常的泛素化和蛋白酶体功能可能导致蛋白质的过早降解，从而影响其表达。
综上所述，蛋白质不表达的原因多种多样，包括基因突变、转录调控异常、翻译后修饰异常、细胞环境影响以及蛋白质降解异常等。
了解这些原因并分析其影响是研究蛋白质功能和相关疾病的重要基础。
未来的研究应该继续深入探索这些问题，以促进我们对蛋白质表达机制的理解，并开发出新的疾病治疗策略。
WB中常见问题和解决方法
1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高。
●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
●拖尾原因：样品溶解不好。
●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。
●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。
●条带两边扩散原因：加样量过多。
2．Western blot结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。
●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。
●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。
●检测时曝光时间过长减少曝光时间。
3．Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。
●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
●上样量过高，太敏感适当减少上样量。
●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。
●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。
4.Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
蛋白质纯化常见问题及解决方案
蛋白质纯化常见问题及解决方案蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。
纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能，从而推动相关领域的研究进展。
然而，在进行蛋白质纯化的过程中，科学家们常常会遇到各种问题。
本文将介绍一些常见的问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。
常见问题一：蛋白质表达量太低在蛋白质纯化中，蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。
然而，有时候我们会发现蛋白质的表达量过低，难以获得足够纯度的样品。
这可能有以下几个原因：1. 载体选择不当：选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。
可以尝试使用高效表达载体，如pET系列载体，来提高蛋白质的表达量。
2. 菌株选择不当：不同菌株对蛋白质表达量有差异。
常用的菌株包括大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。
可以尝试不同菌株进行表达，找到最适合的菌株。
3. 条件优化不足：包括温度、培养基和诱导条件等。
合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。
解决方案：针对上述问题，可以尝试优化表达载体、菌株和条件，并进行系统的优化实验。
此外，还可以尝试使用其他表达系统，如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。
常见问题二：蛋白质不稳定或易聚集蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性，因而导致降解、聚集或失活。
这种情况可能是由于多种因素造成的，例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。
解决方案：对于易聚集和不稳定的蛋白质，可以采取以下一些措施：1. 降低温度：将温度降低到4℃以下，可以减缓蛋白质的降解和聚集速度。
2. 优化缓冲液：选择合适的缓冲液，并进行pH和离子强度的优化。
有时候添加一些辅助物质，如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂，可以提高蛋白质的稳定性。
3. 使用小分子化合物：有时候可以加入一些小分子化合物，如L-辅酶A和聚氧乙烯醇等，来增强蛋白质的稳定性。
常见问题三：蛋白质纯化的污染蛋白质纯化过程中常常会伴随着各种污染物的存在，如其他蛋白质、核酸、有机化合物和盐等。
蛋白质功能不同的直接原因和根本原因__概述及解释说明
蛋白质功能不同的直接原因和根本原因概述及解释说明1. 引言1.1 概述蛋白质是生命体中非常重要的大分子有机化合物，具有多种功能。
这些功能不同主要包括蛋白质参与细胞结构组成、催化酶活性以及传递信号等。
然而，不同蛋白质具有不同的功能特点，这一现象引发了人们对于蛋白质功能不同的直接原因和根本原因的研究。
1.2 文章结构本文将分析和讨论蛋白质功能不同的直接原因和根本原因。
首先介绍了直接原因和根本原因的概念，并解释了它们之间的关系。
随后，通过实例分析来进一步说明直接原因和根本原因对蛋白质功能产生影响的具体情况。
最后，总结出直接原因和根本原因之间的关系，并探讨了研究蛋白质功能对于科学发展和应用的重要意义。
1.3 目的本文旨在阐明蛋白质功能不同的直接原因和根本原因，并探索其背后隐藏着的科学现象。
通过深入研究蛋白质功能的差异性，我们可以更好地理解生命体的运转机制，并为相关领域的进一步研究和应用提供有益的参考。
2. 蛋白质功能不同的直接原因和根本原因：蛋白质是生物体中非常重要的大分子，它们承担着多种功能，例如催化化学反应、结构支撑、传递信号等。
然而，尽管蛋白质具有相似的基本结构，它们的功能却因具体的氨基酸序列和空间结构差异而各不相同。
这引出了一个关键问题：为什么会存在蛋白质功能不同的现象？2.1 直接原因：蛋白质功能的差异可以归结为其直接原因。
直接导致蛋白质功能差别的主要原因包括以下几个方面：1. 氨基酸序列差异：蛋白质由氨基酸组成，通过连接在一起形成多肽链。
每个氨基酸都具有自己特定的属性和侧链组合方式，这些特性会影响最终蛋白质的折叠和空间结构，从而决定其功能。
2. 折叠结构差异：蛋白质在经过翻译后需要正确地折叠成特定的三维结构才能发挥功能。
不同的氨基酸序列会导致蛋白质在折叠过程中出现不同的稳定性和结构形态，从而决定其功能表现。
3. 互作伙伴选择性：蛋白质常常通过与其他分子相互作用来实现特定的功能。
具体的氨基酸序列和结构决定了蛋白质与某些分子能够发生特异性相互作用，进而影响其功能。
WB常见问题及处理方法
WB常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法无信号一抗和二抗不匹配1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温1-2h；4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。
封闭液与一抗或二抗有交叉反应1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择BSA溶液进行封闭）；2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择成分比较清楚的BSA或者明胶）。
一抗不识别检测物种的蛋白1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强的可以尝试；3.设置能检测的阳性对照。
抗原量不足1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。
4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。
组织中目的蛋白含量低1.选择特异表达目的蛋白的组织；2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。
转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。
洗膜过度 1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。
过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、显色液失活 1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效。
激发光波长选择不合适 1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长。
WB注意事项及常见问题
WB注意事项及常见问题注意事项一、样本收集1.组织样本原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根据实验的需要告知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于—80℃保存。
具体详情参照“组织样本收集注意事项。
doc"；2.细胞样品原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋白时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项。
doc”;二、总蛋白提取1.组织样品具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂,如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；2.细胞样品具体详情参照“细胞样品收集注意事项。
doc"；记得加入蛋白酶抑制剂,如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂;三、蛋白样本保存裂解细胞或组织提取总蛋白时,细胞碎片沉淀一般—20℃保存以防万一，提取好的蛋白样品分装2份,一份加入上样缓冲液变性后-20℃保存，一份直接—20℃保存;四、蛋白变性提取好的总蛋白取一部分(不是全部)加入上样缓冲液进行加热变性(100℃,5min），变性好的蛋白应该—20℃保存，冻融后不再需要加热变性；五、SDS-PAGE1.浓缩胶的胶浓度一般为5％，用于压沉样品;2.分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见Western Blotting 全攻略.pdf第4页;3.分离胶和浓缩胶的高度比为8：3；4.电泳结束后,应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子,以免刮花玻璃板；5.电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；6.清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝;六、转膜1.注意海绵垫，滤纸(转膜专用滤纸）,转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；2.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸),转印膜,胶的相对大小，以免造成短路;3.转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1—2遍,并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题；4.转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；5.转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸,以免盐离子沉积，导致转膜时短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干,容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏；七、封闭1。
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蛋白不表达：常见原因及分析
根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。
1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图
3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤
其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-
端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr
这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。
这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。
那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
7、SD序列。
这个不陌生吧？考研时老师喜欢出名词解释，也难怪人家老是拿这个出题----SD序列和起始密码子序列（80%是AUG，也有GUG的）之间的距离，对蛋白表达的效率也有着非常重要的影响。
SD序列本身的组成对翻译效率也有影响。
有时为了减少包涵体的产生，还特别对SD序列进行修饰呢！
8、mRNA的二级结构。
在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖体结合位点和/或翻译起始位点互补的序列。
如然，你最好进行同义密码子替换。
否则由此形成的mRNA二级结构，会让翻译嘎然而止的。
9、意外终止。
这种情况见于PCR扩增序列时，会和你开个不大不小的玩笑。
比如它会将序列中间TAC突变为TAA，让你的蛋白翻译刹车。
所以在进行表达之前，一定要进行测序，避免这种情况的发生。
10、转录终止子。
转录终止子的存在可以促进蛋白表达；但是缺少时就会造成“通读”，没完没了地读下去。
这在pET系统里不成问题，因为它在靶基因的相反方向有个选择性的标记基因。
如果你的靶基因正好和这个标记基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有个转录终止子。
如果没有的话，它们会竞争得天昏地暗，抢着生成mRNA和蛋白质。
11、mRNA的不稳定性。
靶基因的mRNA常聚集于细胞内。
但是大肠菌的mRNA及其不稳定。
如果在mRNA的5'-非翻译区和3‘-rho非依赖性终止子处插入稳定结构序列，可以促进mRNA的稳定性。
尤其是5'末端要是有个不带突出的发夹结构，能让mRNA 在胞浆内无生命之虞。
12、检测方法的可行性。
有时候，蛋白的确表达了，只是表达量特别低，或者和杂带靠得特别近，致使你错误地以为蛋白没有表达。
这时候，你可千万别忘记了生物学实验的两大黄金准则：对照和重复。
说到对照，有很多层意思。
最基本的意思是，要设立空载体对照。
在真核系统表达的蛋白，常常量特别低。
因此你不要老是想着WB和SDS-PAGE去检测。
这时候，你必须多看文献，另辟蹊径，从文献中找找看这个蛋白有米有很特别的性质----比如说如果它具有酶活性，那简直就是便宜你了。
还比如说，某些蛋白具有异样性质，比如说流感病毒的HA，你拿表达的不同梯度稀释的蛋白做个
血凝。
如果发生血凝，并且呈现一定的梯度关系，那简直就是板上钉钉的事情了。
总结起来，套用一句很经典的电影台词：能表达出来的蛋白，其原因都是一致的；表达不出来的蛋白，各有各的原因。
我这个小帖子，就是给你一点启示：从哪里找原因。
希望能抛砖引玉，得到更多有价值的建议。