荧光显微技术
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原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列， 将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。
课后作业
• 请同学查阅资料，比较荧光原位杂交技术 在实际应用中的优缺点。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击 数码成像系统软件，采集数码图像。
2.注意事项
(1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫 外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。 (2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银 蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。 (3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气 尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路， 导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢 出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次 打开，必须等待至少30分钟。
直接荧光抗体染色法示意 图
荧光抗体染色
间接法
特异性抗体与相应 抗原反应，荧光素 标记的抗抗体再与 第一抗体结合。
间接荧光抗体染色法示意 图
荧光抗体染色
双标记法
两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗 体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜 色荧光。
荧光抗体染色
荧光抗体染色结果判 断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
荧光显微镜的基本结构
滤光片
荧光显微 镜
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见 波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光 透过，保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光：照明光线从 标本下经聚光器透过 标本进入物镜。 落射光：照明光线从 标本上经垂直照明器 落射到标本，经标本 反射进入物镜。
五.荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术
用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的 物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技 术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接， 用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧 光技术(direct immunofluorescent technique)”。用荧光染 料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方 法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色 透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不 易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作 封裱剂。 （五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本 时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光 镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可 用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用 (如TRITC)。
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
透射荧光显微镜光路 (a)
落射荧光显微镜光路(b)
一 . 荧光显微镜的原理
• 某些物质在一定短波长的光 (如紫外光)的照射下吸收光能进 入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照 射光波长更长的光(如见光)，这 种光就称为荧光。
• 荧光显微镜利用特殊的照明装 置发出较短波长的激发光，诱发 荧光物质发出荧光,通过物镜作用 在样品上，在有目镜观察到肉眼 可见的荧光。
荧光探针分布是利用信号
传导中信号分子的迁移功能， 将一荧光蛋白与信号分子相偶 联，根据荧光蛋白的分布情况 即可推断信号分子的迁移状况， 并推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
六、荧光抗体染色
直接法
荧光素标记的特异 性抗体直接与相应 抗原反应。
荧 光 显 微 镜
四、荧光显微镜的基本结 构
荧光显微镜
利用一定波长的激发光 对样品进行激发，产生一定 波长的荧光，对样品结构或 其组分进行定性、定位、定 量观察检测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
➢光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 ➢滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 ➢光路：透射光、落射光 ➢聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光 器 ➢镜头：消色差镜头
在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛 用途，包括有
• 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
2.药物筛选
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激
发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观 察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或 杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂
(4)高压汞灯工作时会散发大量的热量，因此， 工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
(5)汞灯的使用寿命约200—300小时，在电源 控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计 小时数，达到300小时，需更换新灯泡，否则亮 度不够，影响观察
四.荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚 的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石 英玻璃载玻片。
二.荧光显微镜的结构
主要结构有机械系统和光学系统两部分，如图 1.机械系统：包括底座、镜身、观察筒三部分 2.光学系统: 包括物镜、聚光镜、光源等
三.荧光显微镜的操作及注意事项
• 1．基本操作步骤
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
technique)”。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出， 从而可对抗原进行细胞定位
• 2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
绿色荧光蛋白
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)， 简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤 光
荧光抗体技术的应用
①自身抗体检 测
抗核抗体(均质型)
抗核抗体(斑点 型)
抗核抗体(核膜型)
wenku.baidu.com
荧光抗体技术的应用
②病原体检 测
细菌（藤黄微球菌 )
寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）
荧光抗体技术的应用
③免疫病理检 测
肿瘤（人肝癌细胞）
七、荧光原位杂交
概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸 进行定位和相对定量研究的一种手段。
课后作业
• 请同学查阅资料，比较荧光原位杂交技术 在实际应用中的优缺点。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击 数码成像系统软件，采集数码图像。
2.注意事项
(1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫 外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。 (2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银 蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。 (3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气 尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路， 导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢 出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次 打开，必须等待至少30分钟。
直接荧光抗体染色法示意 图
荧光抗体染色
间接法
特异性抗体与相应 抗原反应，荧光素 标记的抗抗体再与 第一抗体结合。
间接荧光抗体染色法示意 图
荧光抗体染色
双标记法
两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗 体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜 色荧光。
荧光抗体染色
荧光抗体染色结果判 断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
荧光显微镜的基本结构
滤光片
荧光显微 镜
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见 波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光 透过，保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光：照明光线从 标本下经聚光器透过 标本进入物镜。 落射光：照明光线从 标本上经垂直照明器 落射到标本，经标本 反射进入物镜。
五.荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术
用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的 物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技 术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接， 用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧 光技术(direct immunofluorescent technique)”。用荧光染 料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方 法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色 透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不 易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作 封裱剂。 （五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本 时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光 镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可 用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用 (如TRITC)。
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
透射荧光显微镜光路 (a)
落射荧光显微镜光路(b)
一 . 荧光显微镜的原理
• 某些物质在一定短波长的光 (如紫外光)的照射下吸收光能进 入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照 射光波长更长的光(如见光)，这 种光就称为荧光。
• 荧光显微镜利用特殊的照明装 置发出较短波长的激发光，诱发 荧光物质发出荧光,通过物镜作用 在样品上，在有目镜观察到肉眼 可见的荧光。
荧光探针分布是利用信号
传导中信号分子的迁移功能， 将一荧光蛋白与信号分子相偶 联，根据荧光蛋白的分布情况 即可推断信号分子的迁移状况， 并推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
六、荧光抗体染色
直接法
荧光素标记的特异 性抗体直接与相应 抗原反应。
荧 光 显 微 镜
四、荧光显微镜的基本结 构
荧光显微镜
利用一定波长的激发光 对样品进行激发，产生一定 波长的荧光，对样品结构或 其组分进行定性、定位、定 量观察检测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
➢光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 ➢滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 ➢光路：透射光、落射光 ➢聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光 器 ➢镜头：消色差镜头
在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛 用途，包括有
• 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
2.药物筛选
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激
发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观 察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或 杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂
(4)高压汞灯工作时会散发大量的热量，因此， 工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
(5)汞灯的使用寿命约200—300小时，在电源 控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计 小时数，达到300小时，需更换新灯泡，否则亮 度不够，影响观察
四.荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚 的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石 英玻璃载玻片。
二.荧光显微镜的结构
主要结构有机械系统和光学系统两部分，如图 1.机械系统：包括底座、镜身、观察筒三部分 2.光学系统: 包括物镜、聚光镜、光源等
三.荧光显微镜的操作及注意事项
• 1．基本操作步骤
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
technique)”。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出， 从而可对抗原进行细胞定位
• 2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
绿色荧光蛋白
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)， 简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤 光
荧光抗体技术的应用
①自身抗体检 测
抗核抗体(均质型)
抗核抗体(斑点 型)
抗核抗体(核膜型)
wenku.baidu.com
荧光抗体技术的应用
②病原体检 测
细菌（藤黄微球菌 )
寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）
荧光抗体技术的应用
③免疫病理检 测
肿瘤（人肝癌细胞）
七、荧光原位杂交
概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸 进行定位和相对定量研究的一种手段。