荧光显微技术
显微操作技术-荧光显微镜技术的特点和应用
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• 活体染色 vital staining 将无毒或毒性较小 的某种染料注入动物体内,可被机体内某些 组织或细胞所摄取,称为活体...
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影响荧光的因素 1. pH的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的 荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在pH=7-12 的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光； 而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以离子形式存 在，都不会发出荧光。
同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎 宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。
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2.温度的影响
温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时， 介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减 少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反， 随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加， 使去活化几率增加，则荧光强度下降。
1.自发荧光:或原发荧光
细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产生 荧光
2.诱发荧光
材料中的某些物质经一定的化学处理后，可转 化为荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见的 是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化为 荧光色团。戊二醛也能诱发荧光
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• 3荧光染料染色：
应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物组 织中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即可 被激发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。 许多常规染色剂(如刚果红、曙红、碱性品红、水 溶性苯胺蓝等)兼有荧光染料的性能
荧光显微成像技术在神经科学中的应用
荧光显微成像技术在神经科学中的应用神经科学是一门研究神经系统结构和功能的学科，旨在揭示人类大脑的奥秘。
了解神经细胞的定位、连接和通信方式对于理解大脑的工作原理至关重要。
荧光显微成像技术作为一种能够非侵入性地观察和记录神经活动的方法，在神经科学研究中扮演着重要的角色。
荧光显微成像技术是一种利用生物体内外发光物质的性质，通过光学显微镜观察和记录生物体内活动的方法。
该技术结合了光学、生物学和物理学的原理，能够提供细胞和组织的高分辨率图像，以及对细胞内信号传递等生物过程的实时观察。
在神经科学中，荧光显微成像技术得到了广泛应用，下面将从以下几个方面介绍其在神经科学研究中的重要应用：1. 神经元成像和追踪：荧光显微成像技术可以通过标记神经元的荧光探针，实现神经元的成像和追踪。
通过观察神经元在不同时间点的位置和形态变化，研究人员可以揭示神经元的生长、分支和连接方式，进一步了解神经网络的结构和功能。
2. 神经递质和离子成像：荧光显微成像技术可以使用荧光染料或荧光探针，实时观察神经递质和离子在神经元之间的传递和浓度变化。
通过研究神经递质和离子的动态活动，可以深入研究神经元的兴奋性和抑制性过程，进而探究大脑的认知和行为功能。
3. 脑片切片成像：荧光显微成像技术可以在体外制备脑片，并对其进行荧光显微观察。
通过对切片的成像，研究人员可以观察神经元的空间分布、突触连接和活动模式，进而研究神经网络的拓扑结构和信息传递机制。
4. 跨膜电位成像：荧光显微成像技术结合电生理方法，可以实时记录神经元的膜电位变化。
研究人员可以通过标记神经元的荧光探针，观察神经元的电位变化和动作电位的传播路径，进一步研究神经元兴奋性和兴奋传导机制。
荧光显微成像技术的应用为神经科学研究带来了很多重要的进展，但也存在着一些挑战。
首先，荧光探针的选择和设计需要考虑到其对神经元活动的影响，以及其与神经元系统的特异性结合。
此外，荧光显微成像技术的分辨率和灵敏度仍然有待提高，以更全面地研究神经元的微观结构和活动。
超分辨荧光显微技术原理
超分辨荧光显微技术原理传统的荧光显微镜受到瑞利准则的限制，即其分辨率受到光学波长和透镜的限制。
超分辨荧光显微技术则通过创新的方法克服了这一限制，实现了超分辨率的荧光成像。
1.非线性显微技术：传统的荧光显微技术采用的是线性成像原理，即通过样品中的荧光物质发射的线性荧光信号来获得图像。
而超分辨荧光显微技术采用非线性成像原理，利用荧光物质的非线性光学效应，提高了分辨率。
例如，通过激光器的脉冲激发，可以使荧光物质在非线性荧光效应下发射高阶谐波信号，从而得到更高分辨率的图像。
2.相干显微技术：传统的荧光显微技术采用的是非相干光源，无法获取相干光的相位信息，从而限制了分辨率的提高。
而超分辨荧光显微技术采用相干光源，如激光光源或可调谐激光器，使得可以获取到样品的相位信息，从而提高了分辨率。
例如，通过在激光束上加入相位调制，可以在信号中提取出相位信息，从而实现更高的分辨率。
3.显微镜改进：传统的荧光显微镜在透镜、光路和探测器等方面都存在一定的限制，无法实现超分辨率成像。
超分辨荧光显微技术通过改进显微镜的设计和构造，例如采用高数值孔径物镜、自适应光学元件和高速探测器等，可以克服这些限制，提高分辨率。
4.数据分析和算法：超分辨荧光显微技术的数据量较大，需要进行大量的图像处理和分析。
通过使用高级算法和计算方法，可以将大量数据进行处理和重建，得到超分辨率的图像。
例如，通过拟合和重建点扩散函数，可以实现超分辨率的成像。
超分辨荧光显微技术的应用非常广泛，涵盖了生物医学、材料科学和纳米技术等领域。
例如，在生物医学领域，超分辨荧光显微技术可以用于观察和研究细胞结构、分子过程和疾病发展等，为生物医学研究提供了重要的工具。
在材料科学领域，超分辨荧光显微技术可以用于材料表征和纳米结构研究，为材料科学的发展和应用提供了有力支持。
总之，超分辨荧光显微技术通过创新的光学方法和图像处理算法，突破了传统荧光显微技术的分辨率限制，实现了超分辨率的荧光成像，为生物医学和材料科学等领域的研究提供了重要工具。
荧光显微技术
荧光显微技术
荧光显微技术
荧光显微技术是一种利用荧光染料标记生物分子并通过显微镜观察的技术。
它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用，如细胞成像、蛋白质定位、基因表达分析等。
一、荧光染料的选择
荧光染料是荧光显微技术中最重要的组成部分，其选择应根据样品特性和实验需求进行。
常见的荧光染料包括偶氮染料、羰基化合物、环氧化合物等。
二、标记方法
1.直接标记法：将荧光染料直接与待检测分子结合，适用于小分子或表面易于修饰的大分子。
2.间接标记法：先将抗体或亲和素与待检测分子结合，再使用带有荧光标记的二级抗体或亲和素进行检测。
3.生物素-亲和素标记法：待检测分子上带有生物素，使用带有荧光标记的亲和素进行检测。
三、显微镜成像
1.激发波长：不同荧光染料的最大激发波长不同，应选择与荧光染料相匹配的激发波长。
2.荧光滤镜：使用适当的荧光滤镜可以增强信号和降低背景噪音。
3.成像方式：常见的成像方式包括单色成像、双色成像、多色成像等，可以根据实验需求选择合适的方式。
四、应用
1.细胞成像：通过荧光显微技术可以观察细胞内各种分子的分布和动态变化，如蛋白质、核酸、小分子等。
2.蛋白质定位：通过标记蛋白质上的特定结构域或标签，可以观察其在细胞内的定位和转运情况。
3.基因表达分析：利用荧光素染料标记基因表达产物，可以观察不同组织或条件下基因表达水平的差异。
4.材料科学研究：荧光显微技术也被广泛应用于材料科学领域，如纳米粒子形貌分析、材料表面性质研究等。
总之，荧光显微技术是一种非常重要的生物学研究工具，其应用范围广泛，未来还有着更广阔的发展前景。
显微荧光成像技术
显微荧光成像技术生命科学是一个充满活力的领域，包括生物学、医学、农学、生态学等诸多分支。
显微镜是生命科学研究中不可或缺的工具之一，而显微荧光成像技术则是显微镜技术的重要分支之一。
本文将围绕显微荧光成像技术展开阐述。
一、显微荧光成像技术的基本原理显微荧光成像技术是利用荧光分子在吸收一定波长的光后，能够发出较长波长（即红外、红光、黄光）的光的特性，来探测并分析样品中各种微观结构与分子的分布情况和相互作用。
从理论上讲，这些分子在不受到荧光激发的情况下是不会发光的。
因此，要实现荧光成像需要通过激发、显微观测、成像三个步骤来完成。
激发环节是荧光成像技术的起点。
荧光分子必须要由波长与其吸收光谱相吻合的光子作用下，才能在其内部发生电子的跃迁，发出荧光信号。
一般而言，荧光分子的激发波长与发射波长是不同的。
由此，通过双光子荧光激发技术，可以用一种比传统荧光显微镜的短波长更长的激发波长来对样品进行激发，使荧光分子针对测量目的进行有选择性的激发，大大减少光伤害，同时增加激光的渗透深度，解决深部显微成像的问题。
显微观察环节是荧光成像技术的重点。
显微荧光成像技术基于荧光分子的发射特性，即它们可以在可见光谱的较长波长区域发射出光，这种现象可以被显微镜观察到。
在显微荧光成像系统中，将样品置于显微镜下，并通过荧光染料激发样品，然后通过适当的荧光滤波器对荧光发射信号进行过滤，最后将信号捕获并显示在荧光显微镜上。
成像环节是荧光成像技术的末端。
荧光显微成像系统可以将荧光信号反射到图像传感器（如CCD）上，捕获图像数据，使用显微荧光成像图像处理软件对获得的图像数据进行分析和处理，处理结果可以被投影或与其他数据交互的形式展现。
二、显微荧光成像技术的应用显微荧光成像技术应用广泛，包括生命科学、药学、医学、农业、食品工业、生态学等领域。
一些具体的应用如下：1、生命科学领域显微荧光成像技术广泛应用于生命科学领域，它可以被用来研究生物体在不同行为状态下的荧光响应，如酶活性、细胞间相互作用、细胞家族、组织结构、线粒体功能等，进一步揭示生物体的结构、功能和相互作用等相关生物学问题。
荧光显微镜技术在生物学中的应用
荧光显微镜技术在生物学中的应用荧光显微镜是一种基于荧光现象的显微技术，它能够将激发物质发出的荧光信号转化为图像。
这一技术的应用之一就是在生物学研究中，它已经成为了一项重要的工具。
荧光显微镜技术的发展，不仅解决了传统显微镜不能达到的任务，同时也使得很多原本不能检测的生物学现象得到了揭示。
荧光显微镜技术的应用荧光显微镜技术在生物学领域的应用主要包括以下几个方面：1. 活细胞观察由于传统显微镜观测需要对样本进行固定处理，因此观察过程中无法观察到活细胞的现象。
使用荧光显微镜，由于它不需要使用化学固定剂，因此可以观察到细胞内部的动态变化，如细胞分裂、细胞核运动等现象。
2. 瞬时生化反应荧光显微镜技术可以标记生化反应或细胞内物质，使其发出荧光信号，并在实时观察到这一过程。
这项技术可以大大缩短生化反应的运行时间，可以监测蛋白质、DNA和RNA等的合成，以及离子和分子等化学现象。
3. 染色体和DNA研究荧光染色体或质体是一种标记生物大分子的技术。
荧光染色体和DNA标记技术可以用于检测DNA复制、DNA拆解和DNA修复等活动。
DNA标记技术也可用于评估遗传变异，这有助于检测不良遗传信息和基因突变。
4. 免疫荧光荧光显微镜技术可以用于免疫荧光标记。
在这项技术中，荧光标记的抗原与细胞内特定蛋白结合，呈现荧光信号。
这项技术可用于检测蛋白质的具体位置以及其在细胞中的分布情况与移动轨迹。
荧光显微镜技术广泛应用于细胞内分子动力学研究、免疫荧光技术、荧光共振能量转移、荧光蛋白研究、单分子力学测量、3D显微成像等多个领域，成为现代生物学研究的必备技术手段。
未来发展趋势正如其他许多生物技术一样，荧光显微镜技术取得了许多突破，但仍有困难需要解决。
解决这些问题的方法是不断研究和创新。
荧光显微镜技术的未来发展趋势在于进一步减少噪声和提高显微镜解析度。
在生物学研究中，我们将看到更清晰、更准确的图像，并且我们将能够识别其所显示的微观结构和化合物。
超分辨率荧光显微技术的原理和进展
超分辨率荧光显微技术的原理和进展超分辨率荧光显微技术是一种用于观察细胞和生物分子的显微镜技术，具有比传统荧光显微镜更高的分辨率，可以更清晰地分辨出细胞和生物分子的结构和功能。
其原理基于物理学原理和计算机算法，通过精确的荧光标记和高分辨率成像技术，实现了对生物结构的超分辨率观察。
本文将介绍超分辨率荧光显微技术的原理和进展。
1.超分辨率荧光显微技术的原理抑制光的衍射：传统光学显微镜无法突破维恩衍射极限，限制了其分辨率。
超分辨率荧光显微技术利用光的非线性响应和光学调制技术，使得衍射限制得以突破。
例如，利用单分子荧光显微技术，可以将荧光标记的分子在时间上进行“开关”，只有少数分子发出荧光，可以精确定位每个分子的位置。
利用这种方法，可以获得超分辨率的图像。
图像重建算法：超分辨率荧光显微技术还依赖于一系列图像处理技术，如重建算法和数据解析算法。
这些算法能够在获得低分辨率图像的基础上，通过处理和分析图像数据，恢复出高分辨率的图像。
常见的算法有结构光超分辨率显微镜（SR-SIM）、单分子定位显微镜（SMLM）等。
这些算法通过统计学原理和概率分析等方法，提高图像的分辨率和清晰度。
2.超分辨率荧光显微技术的进展（1）结构光超分辨率显微镜（SR-SIM）：这种技术是利用结构光的干涉原理，通过调整光源的相位和频率，实现对样本的超分辨率成像。
SR-SIM技术能够将样本的分辨率提高到约100 nm，从而观察到更细微的结构。
（2）单分子定位显微镜（SMLM）：SMLM技术利用荧光标记的分子在时间上进行“开关”，只有少数分子发出荧光，可以精确定位每个分子的位置。
通过收集大量分子的位置信息，可以恢复出高分辨率图像。
SMLM 技术的分辨率可以达到10 nm左右，成为最高分辨率的超分辨率显微技术之一（3）受限激发荧光显微镜（STED）：STED技术是一种利用激光束的光强分布来抑制荧光的发射，从而实现超分辨率成像的方法。
STED技术的分辨率可以达到几十纳米，可以观察到更小的细胞结构和分子组装。
荧光显微技术在细胞动态分析中的应用
荧光显微技术在细胞动态分析中的应用细胞是生物体最小的单位，是构成生物体的基本单元。
细胞内几乎所有的生命现象都是以分子的运动和相互作用为基础的，但是由于分子的尺度极小，因此必须借助先进的技术手段来观察和分析细胞的生命现象。
荧光显微技术是目前最常用的细胞动态分析方法之一，具有非侵入性、高时空分辨率和多样化的应用优势。
荧光显微技术的基本原理荧光显微技术基于物质的荧光特性，利用光源引起荧光探针分子发射光信号，观察样品获得信息。
荧光探针分子是一类特殊的分子，它们可以在受到光的激发后，从一个能级跃迁到另一个能级，释放出荧光光子。
根据荧光探针分子的特性，荧光显微技术可以分为荧光光学显微镜和荧光分光计两种形式。
其中荧光光学显微镜是用来观察细胞或者样品固定后的荧光标记下的细胞结构或者异物的位置和状态。
荧光分光计则是用来测量荧光信号的强度，并且分析这些信号所在分子之间的相互作用。
1. 细胞分子定位和观察荧光显微技术可以用于分析细胞中荧光标记的蛋白质分子的动态定位和跟踪。
在细胞内部，荧光探针分子可以通过转染技术或者共转染技术标记到蛋白质分子上。
标记后的蛋白质分子固定在细胞结构上，荧光显微技术可以帮助研究者了解这些分子在不同时间和空间点的位置和数量变化。
这些信息可以在比较不同的细胞之间的相关基因表达和功能性变化时提供支持。
2. 细胞内分子相互作用分析荧光显微技术在细胞动态分析中还可以用于检测、分析和计量细胞内分子之间的相互作用。
荧光标记的蛋白质可用于探测细胞内多个分子的相互作用，比如蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质、以及RNA、核酸等。
这种利用荧光标记的分子相互作用分析技术可以通过不同的激发光谱来区别和定位。
3. 细胞状态监测和检测最后，荧光显微技术在细胞动态分析中还可以帮助研究者提取细胞状态的监测和检测。
比如，在荧光显微技术中，荧光标记的细胞固定并被加入到流式细胞术分析中，可以帮助对细胞代谢状态，生长状态，以及细胞毒性状态等进行监测和检测。
荧光显微镜技术参数
荧光显微镜技术参数1.工作条件及用途适于在气温为摄氏-40℃~+50℃的环境条件下运输和贮存,在电源220V( 10%)/50Hz、气温摄氏-5℃~40℃和相对湿度85%的环境条件下运行。
可作切片的明场(BF)、荧光(FL)、偏光(PO)观察。
2.主要技术指标2.1 研究级正置显微镜2.1.1 研究级正置显微镜,可作明场、偏光和荧光的观察2.1.2 光学系统:无限远校正光学系统,齐焦距离必须为国际标准45mm2.1.3 调焦:载物台垂直运动方式距离不小于25mm,带聚焦粗调限位器,粗调旋钮扭矩可调,最小微调刻度单位≤1微米2.1.4 观察镜筒:宽场三目观察筒,倾角为30°*2.1.5 照明装置:内置透射光柯勒照明器,12V100W卤素灯,光强预调开关,内置式滤色镜(日光平衡滤色片、ND25、ND6),左右手均可操作。
*2.1.6 物镜:万能平场半复消色差物镜4X(N.A≥ 0.13,W.D≥17)10X(N.A≥0.3,W.D≥10)20X(N.A≥0.5,W.D≥2.1 spring)40X(N.A≥0.75,W.D≥0.51 spring)100X(N.A≥1.30,W.D≥0.2 spring,oil)2.1.7 载物台:右手油式载物台,带有旋转装置和扭矩调节装置,高抗磨损性陶瓷覆盖层载物台。
2.1.8 目镜:10X宽视野目镜,带屈光度校准2.1.9 物镜转换器:六孔物镜转换器2.1.10 聚光镜:摇摆式聚光镜,N.A.≥0.92.1.11 具备ECO环保节能感应开关,操作人员离开30分钟后自动关闭透射光源。
2.2 荧光照明系统2.2.1 荧光照明器:八孔荧光照明器,配置ND25、ND6、ND1.5中灰滤色片,无需工具即可更换滤色镜组*2.2.2荧光光源:130W长寿命荧光光源,通过冷光纤导入,减少热传递。
2.2.3 通用高性能荧光紫外、蓝色带通、绿色激发滤色镜组,滤色镜均带有干涉镀膜。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
荧光显微镜技术在生命科学中的应用进展
荧光显微镜技术在生命科学中的应用进展随着生命科学领域的不断发展，荧光显微镜技术越来越受到人们的关注。
荧光显微镜技术是一种利用特殊处理的荧光染料对微生物、细胞或组织内特定分子和结构进行标记，然后利用荧光显微镜系统对其进行定位、照相和分析的技术。
荧光显微镜技术的广泛应用已经成为生命科学研究中不可或缺的一部分。
一、荧光显微镜的原理荧光显微镜是现代生命科学研究中常用的一种技术。
它利用了分子在光的作用下发射出来的荧光信号，将其进行采集和增强后，形成分子在组织或细胞中的分布图。
荧光显微镜技术主要包括两类：显微荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜。
显微荧光显微镜是最基本的荧光显微镜技术，它可以利用荧光素上的信息来对细胞或组织进行成像。
在荧光显微镜成像时，应首先通过荧光染料的特性选择标记物和荧光显微镜仪器。
将所选标记物进行染色处理后，便可通过荧光显微镜来观察标记的物体分布和活动状态。
共聚焦荧光显微镜是显微荧光显微镜的改进，它使荧光成像更加精确和准确。
共聚焦显微镜具有高分辨率、不同深度成像能力和三维成像能力，能够对组织、细胞及其介质进行高效成像。
二、荧光显微镜技术与生命科学的应用1.分子生物学方面的应用荧光显微镜技术在分子生物学研究中应用得较为广泛。
比如在蛋白质研究中，荧光标记技术已经成为了研究蛋白质定位和激活状态的常用手段。
荧光标记还可以在深度显微镜学上辅助分子校正，进而准确地表征分子内部结构，从而实现快速检测和药物研发。
2.细胞生物学方面的应用荧光显微镜技术的应用在细胞生物学中尤为明显。
通过染色等方法，可以对细胞不同的器官、组件、代谢过程等进行实时的三维动态成像，从而提高对细胞生理和分子途径的认识，为细胞研究提供了重要的方法和手段。
3.医学领域方面的应用荧光显微镜技术除了在科研中有广泛的应用，还在医学领域中有重要的作用。
通过荧光显微摄影技术可以帮助提高诊断精度，为医生提供更加准确的医学工具。
此外，荧光显微镜可以在体系结构和生命科学工程领域等方面为医学科研提供更加安全可靠的方法和技术。
显微操作技术 荧光显微镜技术的特点和应用解读
2.细胞壁研究
荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出 方面,是用于鉴定细胞壁成分,研究壁形成和再生, 以及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化 观察细胞壁的方法很多,如用专一的染料染色 或利用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方 法是荧光增白剂染色,在4QOnm左右的激发光照射下 观察细胞壁(纤维素)所产生的绿色荧光来判断细胞 壁的有无
• 它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不 同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与 RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有 膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。 因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常 细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光。
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
荧光显微镜技术的特点和应用
荧光显微镜的种类
• 透射式 ●落射式
• 和传统显微技术相比,荧光显微技术具有以下优点:
(1)荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的 波长短1/2,因此荧光显微镜的分辨能力超出了传 统显微镜的分辨率的极限 (2)荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性.它所 用染料的量是极其微小的,只相当于传统显微技术 中染料消耗量的几千分之一.
• 活体染色 vital staining 将无毒或毒性较小 的某种染料注入动物体内,可被机体内某些 组织或细胞所摄取,称为活体...
影响荧光的因素 1. pH的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物 的荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在pH=7-12 的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光； 而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以离子形式存在， 都不会发出荧光。 同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如： 奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。
超分辨荧光显微
随机光学重建显微技术（STORM）
要点一
总结词
要点二
详细描述
STORM是一种基于单分子定位的超分辨技术，通过控制荧 光分子的开关状态，实现高精度单分子定位和超分辨成像 。
STORM技术利用荧光分子在不同开关状态下的光散射性质 不同，通过控制荧光分子的开关状态，实现高精度单分子 定位和超分辨成像。在STORM显微镜中，激光束被聚焦到 样品上，激发荧光分子发光。通过控制荧光分子的开关状 态，可以选择性地激活特定荧光分子并记录其位置信息。 通过大量单分子定位的累积，可以构建出超分辨图像。
未来发展方向
突破光学衍射极限
自动化和智能化
通过发展新型光学器件和技术，突破 光学衍射极限，进一步提高超分辨荧 光显微技术的分辨率。
提高超分辨荧光显微技术的自动化和 智能化水平，使其更易于操作和使用， 降低使用门槛。
多模态成像技术
结合不同成像模态的优势，发展多模 态成像技术，以获得更全面、更准确 的信息。
稀疏光学重构显微技术（SORTIE）
总结词
SORTIE是一种基于光学重构的超分辨技术，通过稀疏采样和光学重构算法，实现高分辨率成像。
详细描述
SORTIE技术利用光学重构的原理，通过稀疏采样和光学重构算法，实现高分辨率成像。在SORTIE显 微镜中，激光束被聚焦到样品上并产生散射光。通过控制散射光的角度和强度，可以对样品进行稀疏 采样。然后利用光学重构算法对采样数据进行处理，实现高分辨率成像。
成熟应用阶段
随着技术的不断完善和优 化，超分辨荧光显微技术 逐渐成为生物学和医学领 域的重要研究工具。
02
超分辨荧光显微技术的基本原 理
荧光物质的激发与发射
荧光物质在特定波长的光激发下，吸 收能量并跃迁至激发态，随后释放能 量回到低能态，并发出特定波长的荧 光。
荧光显微技术在生物科学中的应用
荧光显微技术在生物科学中的应用生物科学一直以来都是一个充满着奥秘的学科，我们不断地在研究和探索生命的各种表现形式。
而在生物科学的领域中，荧光显微技术得到了广泛的应用。
荧光显微技术不仅能够帮助研究人员观察活细胞、分子的各种活动，还能够使人们更好地了解生物体的各种功能和性质，并在不断地研究和探索中，扩展了生物科学的应用范围。
一、荧光显微技术的发展历程荧光显微技术的历史可以追溯到1852年，当时这项技术被用于观测昆虫的结构，并于1930年代得到了进一步的发展。
在20世纪50年代，荧光显微技术被用于对于DNA结构进行研究，后来在20世纪70年代，这项技术逐渐成为了生物科学领域的重要工具，在细胞、分子、蛋白质等领域得到了广泛的应用。
二、荧光显微技术的基本原理荧光显微技术的基本原理就是将被观察的样本结合荧光物质，该荧光物质会发射出光子，并使被观察样本的细节显现出来。
常用的荧光物质如荧光素（fluorescein）、罗丹明（rhodamine）等，这些物质可以被吸收不同波长的光线，并转化成不同颜色的荧光，从而使得样本的显色和显微效果变得更加明显。
三、 1. 细胞活性和细胞凋亡荧光显微技术在细胞活性和细胞凋亡方面发挥着重要的作用。
生物科学研究人员可以通过将细胞结合不同的荧光物质进行研究，从而了解细胞是否正常活跃或正在腐败死亡。
2. 分子运动和组织结构荧光显微技术还可以被应用于分子运动和组织结构的研究。
例如，在研究分子组装和信号转导的过程中，荧光显微技术可以显示细胞内分子的动态行为，包括分子荷载和运动方式等细节，这对于多种生物学进程，如细胞生长、细胞分裂实验中都非常具有价值。
3. 疾病研究和药物筛选荧光显微技术还可以用于疾病研究和药物筛选。
通过荧光显微技术，研究人员可以观察生理系统或疾病微结构相关的生物学过程，并进一步开发出用于治疗疾病和治疗的治疗药物。
4. 生物成像荧光显微技术可以实现在不破坏细胞的情况下，对于生物组织进行高分辨率成像。
荧光显微镜成像技术的发展与应用
荧光显微镜成像技术的发展与应用荧光显微镜是一种重要的显微镜工具，它可以对活体细胞进行三维成像和追踪。
近几十年来，荧光显微镜成像技术在生物医学、医学诊断和药物研发中得到了广泛的应用。
本文将着重介绍荧光显微镜成像技术的发展历程和应用。
一、荧光显微镜成像技术的起源及发展荧光是强烈的荧光染料在受紫外线或其他激发源作用下所发出的光。
20世纪初，荧光染料被广泛应用于生物学领域。
1938年，G. Palade等人发现电镜下的胰岛细胞有个叫做“小颗粒”的结构。
1952年，Codon和夏斯曼成功地在已知DNA的组织中，用荧光化合物探针—烟酸腺嘌呤二核苷酸（NAD）标记了DNA。
1952年，Singer等人第一次使用荧光标记技术探究细胞膜的结构。
1953年，Zinsser等人使用荧光比色法检测结核杆菌。
这些荧光化合物和技术的不断发展，奠定了荧光成像技术的基础。
荧光显微镜的发明也是荧光成像技术发展的关键。
1949年，Zernike发明了相差显微术（DIC），极大地提高了光学显微镜的分辨率。
然而，由于生物组织自身存在一定的吸收和散射，平面成像存在局限性。
因此，人们开始开发三维成像技术。
1951年，Osterberg发明了普通荧光显微镜。
1970年，Davidovits发明了荧光光谱成像显微镜（FSIM），它可以对样品进行多种激发波长的荧光光谱成像。
1983年，Webb发明了双光子激发荧光显微镜（TPF），并获得了Nobel奖。
目前，由于光学与计算机领域的不断发展，荧光显微镜成像技术也在不断地更新换代。
二、荧光显微镜成像技术的应用领域荧光显微镜成像技术可以对生物样品进行多种成像方式，例如二维、三维、时间序列等多种成像。
它可以实时地观测活体细胞、动物和细菌等微观生物系统的特定结构和生理功能。
因此，荧光成像技术在生物医学、医学诊断和药物研发中得到了广泛的应用。
（一）生物医学中的应用荧光显微镜成像技术在生物医学中的应用主要包括：1.生物大分子的研究：荧光标记可以对分子发生的变化进行实时追踪和记录，因此荧光显微镜成像技术被广泛应用于蛋白质、细胞膜、DNA和RNA结构的研究。
荧光显微技术
荧光显微技术一、荧光显微技术的概述荧光显微技术是一种基于物质的荧光特性来进行显微观察和分析的技术。
通过将荧光染料或标记物与样品中的目标物相互作用，利用荧光显微镜观察样品的发光信号，并通过相应的荧光显微镜成像系统对信号进行捕获和处理，来获得样品的相关信息。
荧光显微技术在生物学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
二、荧光显微技术的原理荧光显微技术的原理基于物质的荧光特性。
当荧光染料或标记物受到特定波长的激发光照射后，其电子会从基态跃迁到激发态，再经过非辐射跃迁返回基态时会发出荧光。
荧光显微镜通过选择性地激发荧光染料或标记物，让目标物发出荧光信号，然后利用适当的荧光滤光片和荧光探测器对荧光信号进行筛选和捕获，从而获得显微观察的图像。
三、荧光显微技术的应用领域1. 生物学领域荧光显微技术在生物学研究中有着广泛的应用。
我们可以利用荧光染料或标记物来标记细胞器、蛋白质、核酸等生物分子，通过荧光显微技术观察这些标记物在细胞中的分布和相互作用，从而揭示生物分子在生物过程中的功能和调控机制。
此外，荧光显微技术还可以用于细胞核型分析、荧光原位杂交等研究。
2. 医学领域荧光显微技术在医学诊断和研究中也具有重要意义。
例如，通过荧光标记特定抗体或核酸探针，可以用于检测病毒、细菌和肿瘤细胞等，从而提供早期诊断和疾病监测的手段。
此外，在药物研发和药效评价中，荧光显微技术也可以用于观察药物在细胞内的分布和靶向效果。
3. 材料科学领域荧光显微技术在材料科学中的应用也越来越广泛。
利用荧光标记技术，可以对材料的微观结构和性能进行观察和评价。
例如，荧光显微技术可以用于研究材料的表面形貌、微观组织和缺陷等信息，为材料设计和性能改进提供科学依据。
四、荧光显微技术的发展趋势随着科学技术的不断发展，荧光显微技术也在不断创新和进步。
以下是荧光显微技术的一些发展趋势：1. 高分辨率成像近年来，高分辨率荧光显微技术如超分辨荧光显微镜（SRF）和结构光显微镜（SIM）等的出现，使得荧光显微技术在细胞和材料领域的观察精度有了质的飞跃。
荧光显微技术原理
荧光显微技术原理荧光显微技术是一种光学成像技术，利用特定波长的光激发细胞或组织中的荧光物质，使之发出荧光，再通过显微镜观察和记录这些荧光信号。
这种技术广泛应用于生物学、医学、病理学等领域，能够观察细胞结构、基因表达、蛋白质分布等信息。
首先，让我们了解荧光显微技术的原理。
当特定波长的光（通常是紫外光或蓝光）照射到某些物质上时，这些物质会吸收光能并跃迁至激发态。
然而，这些物质不会一直保持在激发态上，它们会很快地释放能量并回到基态，同时发出荧光。
每种荧光物质都有其特定的发射波长，因此可以通过测量荧光波长和强度来识别不同的物质。
在荧光显微技术中，通常使用两种类型的显微镜：落射荧光显微镜和透射荧光显微镜。
落射荧光显微镜利用激发光从底部向上照射样本，而透射荧光显微镜则利用激发光从侧面穿过样本。
无论哪种类型，都需要选择合适的激发光波长和滤镜来只允许特定波长的荧光通过，以便能够清晰地观察和记录荧光信号。
荧光显微技术有许多优点。
首先，它能够高灵敏度地检测荧光信号，使得在细胞或组织中含量极低的物质也能够被检测出来。
其次，荧光物质可以选择性地标记细胞或组织中的特定成分，例如蛋白质、核酸或脂质等，从而实现高特异性的检测。
此外，荧光信号还可以通过不同的波长和强度进行定量分析，以确定荧光物质的浓度和分布情况。
然而，荧光显微技术也存在一些局限性。
首先，荧光物质的激发光通常具有较高的能量，可能会对细胞或组织造成光损伤或光毒性。
其次，荧光物质的稳定性较低，容易受到光漂白、氧化等因素的影响，使得荧光信号逐渐减弱。
此外，由于每种荧光物质都有其特定的激发和发射波长，因此可能需要多种荧光染料同时使用，以实现多通道成像和分析。
荧光显微技术在细胞生物学中的应用
因为我们需要培育细胞进行汞离子的吞噬。所以取适量裸藻细胞悬浮培养液， 在室温下离心3 min(2000 r／min)，洗涤3次去除培养物质。令纯净的细胞沉降物
与适量去离子水混合，然后再注入事先设计好浓(CH3CO2)Hg溶液。将样品放在先前 的培养环境下,让细胞吞噬汞离子24小时。另外取一批干净的细胞同时培养，以作 对比。 将裸藻细胞和含有(CH3CO2)Hg的悬浮液，在室温下离心3 min(2000 r／min)， 用PBS洗涤3次来去除溶液中的杂质和残余的汞离子。然后再将洗好的吞噬了汞离子 的细胞和作对比的细胞分别放在预先设计好浓度的BNPTU的溶液中在室温下培育 0．5小时。最终离心3 min(2000 r／min)，用PBS洗涤3次来去除溶液中BNPTU。这 样，细胞就可以用来做荧光成像和光谱分析的测试了。 我们的最终目标就是利用荧光探针来探测生物细胞中的微量汞离子。因此探 针的低毒性显得尤为重要。通过显微镜观察，吞噬了BNPTU的裸藻细胞三天后仍然 没有显示出任何形态上的损坏以及中毒症状，细胞仍然和正常的一样在水中活动性 很高，说明探针完全符合生物应用的要求。
2．2汞离子的荧光探测方法
近年来还是有很多关于荧光探针的报道。在这些荧光探针中，大部分是 通过探针与汞耦合后荧光强度的变化来探测汞．由于其荧光很弱，所以在复 杂环境中，一旦探针分布不均匀，就很难通过荧光强度的变化进行准确的检 测。另外。由于它们中的大部分只能在有机溶剂中探测，很少有可以在水环 境下检测的探针。所以，这些探针很难用于检测生物体中的汞污染。再次， 由于其本身技术的限制，探测灵敏度都不是很高，约在10-4 M附近。因此，寻 求一种可以在生物中探测微量汞离子的荧光探针成为了首要目标。
2．3汞离子荧光探针BNPTU
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• 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
2.药物筛选
荧光显微镜的基本结构
滤光片
荧光显微 镜
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见 波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光 透过，保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光：照明光线从 标本下经聚光器透过 标本进入物镜。 落射光：照明光线从 标本上经垂直照明器 落射到标本，经标本 反射进入物镜。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击 数码成像系统软件，采集数码图像。
2.注意事项
(1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫 外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。 (2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银 蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。 (3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气 尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路， 导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢 出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次 打开，必须等待至少30分钟。
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色 透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不 易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作 封裱剂。 （五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本 时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光 镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可 用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
荧光探针分布是利用信号
传导中信号分子的迁移功能， 将一荧光蛋白与信号分子相偶 联，根据荧光蛋白的分布情况 即可推断信号分子的迁移状况， 并推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
六、荧光抗体染色
直接法
荧光素标记的特异 性抗体直接与相应 抗原反应。
原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列， 将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。
课后作业
• 请同学查阅资料，比较荧光原位杂交技术 在实际应用中的优缺点。
technique)”。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出， 从而可对抗原进行细胞定位
• 2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
绿色荧光蛋白
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)， 简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤 光
透射荧光显微镜光路 (a)
落射荧光显微镜光路(b)
一 . 荧光显微镜的原理
• 某些物质在一定短波长的光 (如紫外光)的照射下吸收光能进 入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照 射光波长更长的光(如见光)，这 种光就称为荧光。
• 荧光显微镜利用特殊的照明装 置发出较短波长的激发光，诱发 荧光物质发出荧光,通过物镜作用 在样品上，在有目镜观察到肉眼 可见的荧光。
荧 光 显 微 镜
四、荧光显微镜的基本结 构
荧光显微镜
利用一定波长的激发光 对样品进行激发，产生一定 波长的荧光，对样品结构或 其组分进行定性、定位、定 量观察检测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
➢光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 ➢滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 ➢光路：透射光、落射光 ➢聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光 器 ➢镜头：消色差镜头
(4)高压汞灯工作时会散发大量的热量，因此， 工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
(5)汞灯的使用寿命约200—300小时，在电源 控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计 小时数，达到300小时，需更换新灯泡，否则亮 度不够，影响观察
四.荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚 的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石 英玻璃载玻片。
荧光抗体技术的应用
①自身抗体检 测
抗核抗体(均质型)
抗核抗体(斑点 型)
抗核抗体(核膜型)
荧光抗体技术的应用
②病原体检 测
细菌（藤黄微球菌 )
寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）
荧光抗体技术的应用
③免疫病理检 测
肿瘤（人肝癌细胞）
七、荧光原位杂交
概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸 进行定位和相对定量研究的一种手段。
二.荧光显微镜的结构
主要结构有机械系统和光学系统两部分，如图 1.机械系统：包括底座、镜身、观察筒三部分 2.光学系统: 包括物镜、聚光镜、光源等
三.荧光显微镜的操作及注意事项
• 1．基本操作步骤
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
五.荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术
用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的 物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技 术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接， 用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧 光技术(direct immunofluorescent technique)”。用荧光染 料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方 法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用 (如TRITC)。
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
直接荧光抗体染色法示意 图
荧素 标记的抗抗体再与 第一抗体结合。
间接荧光抗体染色法示意 图
荧光抗体染色
双标记法
两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗 体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜 色荧光。
荧光抗体染色
荧光抗体染色结果判 断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激
发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观 察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或 杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂