细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证1份ok
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.１菌种试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、1。
３阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表１规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
微生物限度检查方法验证方案
微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。
4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。
4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例）白色念珠菌（0）代↓传代培养↓实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天↓计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株）取白色念珠菌的新鲜培养物↓用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑曲霉的新鲜培养物↓加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱↓采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.培养基适用性检查按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好3计数方法适用性试验供试液制备：水不溶性非油脂类供试品↓取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基↓制备成1:10供试液。
细菌霉菌及酵母菌计数方法验证
有限公司GMP管理文件一、U的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
二、适用范圉：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
三、责任者：质量标准分析方法验证小组。
四、正文：1、验证申请2、验证立项申请表3、验证方案4、验证方案的批复5、验证报告6、验证报告的审批、验证证书7・文件编码第2页细菌.霉菌及酵母菌计数方法验证申请细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。
我公司细菌、霉菌及酵母菌讣数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。
请予以批准！附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单组长：成员:申报单位：质量标准分析方法验证小组申报日期：年月日文件编码第3页验证申请批复文件编码第4页细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案—、概述：1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。
2、H的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2003年版附录乂叮4、验证人员：质保部：负责对验证结果进行评价。
化验室：负责验证情况的检测和监督。
总经理：负责对验证结果进行评价。
5、验证日期：二.验证1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。
按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。
2、内容:（1）菌液所用的菌株传代次数为3代，接种大肠埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时，接种口色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为60cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0. 9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱。
实验食品中细菌总数、霉菌和酵母菌的检验
实验 食品中细菌总数、霉菌和酵母菌的检验一、实验目的要求1、了解细菌总数检验的意义。
2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握国际法测定菌落总数的方法和技能4、掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能5、熟练无菌操作技术。
二、原理菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。
霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。
霉菌和酵母也可造成中腐败变质。
由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。
由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。
霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。
例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等 。
因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。
目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。
我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
三、试剂和仪器细菌总数的检验部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 用途1、500ml广口瓶 1个 稀释样品2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂4、18×180mm试管 3支 稀释样品5、1ml移液管 5 支6、直径为90mm平皿 10套 倒营养平板7、250ml量筒 1支8、玻璃珠：直径约5mm（二）应灭菌、消毒的器材剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只， 开瓶器（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1、0.85%NaCl生理盐水 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶2、营养琼脂： 2瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶食品中霉菌和酵母菌的计数部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 用途1、500ml广口瓶 1个 稀释样品2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂4、18×180mm试管 3支 稀释样品5、1ml移液管 ５ 支6、10ml移液管 1支6、直径为90mm平皿 10套 倒平板7、250ml量筒 1支8、玻璃珠：直径约5mm 适量（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1.灭菌蒸馏水： 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶2.高盐察氏培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶3.孟加拉红培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶四、实验内容细菌总数的检验部分：（一）、基本操作过程：样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。
无菌检测试卷答案
《一次性使用无菌医疗器械》培训考试试卷姓名：________ 岗位：________ 评分：_______一、填空题（每空 2 分，共38 分）1．微生物限度检查和无菌检查应在环境洁净度10000 级的局部洁净度 100 级的单向流空气区域内进行。
2. 除另有规定外，微生物限度检查法中，细菌培养温度为30～35℃，培养时间为3 天；霉菌、酵母菌培养温度为20-25℃，培养时间为 5 天；3.除另有规定外，一般供试品检验量为 10g 或 10ml ；4. 检验时应从 2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂不得少于 4 片；一般应随机抽取不少于检验用量 3 倍量的供试品。
5.试验用菌株的传代次数不得超过 5 代。
从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代。
菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用，若保存在2-8 ℃，可在24 小时内使用。
6.消除供试品抑菌活性的方法有培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法。
7.薄膜过滤法所用滤膜孔径应不大于 0.45 um，直径一般为50mm。
若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml 。
总冲洗量不得超过1000ml 。
8.培养基配制的分装量不得超过容器的 2/3 ，以免灭菌时溢出；配制后应在 2h内灭菌，避免细菌繁殖。
9.供试液制备若需水浴加温时，温度不应超过45℃℃，供试液自制备至加入培养基不得超过 1 小时。
10.洁净区测定沉降菌时，注入培养基的平皿应放置30 分钟。
二、单项选择题（2 ×10=20分）1. 热力灭菌法分干热和湿热灭菌两类，并在同一温度下湿热灭菌效力较干热灭菌效力要强这是因为（ B ）A、可迅速提高温度B、湿热有一定潜热、穿透力大，促进菌体蛋白凝固C、迅速破坏细菌的酶系统D、使细菌迅速失活2. 生物安全柜主要原理（B ）A、干燥B、空气经滤膜除菌后定向流动C、空气定向流动D、通风3.培养基加入有供试品的平皿时的温度不宜超过（ A ）A、45 ℃B、50 ℃C、48℃D、60 ℃4. 药品微生物实验室所检测微生物的生物危害等级大部分为生物安全（ B ）A、一级B、二级C、三级D、四级5. 洁净实验室内的温度应控制在（），相对湿度最好控制在（ D ）A、20～25℃，40～60%B、10～30℃，50～70%C、15～25℃，50～70%D、18～26℃，40～60%6. 操作间或净化工作台的洁净空气对环境的相对正压为（），操作间与缓冲间的相对正压为（ C ）A、不低于 10 帕，不高于5 帕B、不高于10 帕，不低于5 帕C、不低于 10 帕，不低于5 帕D、不低于5 帕，不低于 10 帕7．检查结果如各稀释级的平板均无菌落生长或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于 1 时，应报告（ D ）A、0 个B、＜1 cfuC、0cfuD、＜1 乘以最低稀释倍数的值8. 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括（ C ）检查A、细菌数和霉菌数B、细菌数、霉菌数及酵母菌数C、细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌D、细菌数、霉菌数、控制菌数9. 微生物限度检查验证试验至少应进行（）次独立的平行试验，各试验菌每次试验的回收率应不低于（ A ）A、3，70%B、2，80%C、3，80%D、2，70%10.细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证时试验菌加入量规定为（）cfu，控制菌计数方法验证时试验菌加入量规定为（D）cfu。
微生物方法学验证
速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。
2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。
（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。
b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。
c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。
d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。
4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证
一、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
二、适用范围：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
三、责任者：质量标准分析方法验证小组。
四、正文：1、验证申请2、验证立项申请表3、验证方案4、验证方案的批复5、验证报告6、验证报告的审批7、验证证书细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。
我公司细菌、霉菌及酵母菌计数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。
请予以批准！附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单组长：成员：申报单位：质量标准分析方法验证小组申报日期：年月日验证申请批复细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案一、概述：1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。
2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ4、验证人员：质保部：负责对验证结果进行评价。
化验室：负责验证情况的检测和监督。
总经理：负责对验证结果进行评价。
5、验证日期：二、验证1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。
按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。
2、内容：（1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
微生物限度检验
2007.4
1
微生物限度检查 (Microbial Limits Test) ：
是指非无菌制剂及原，辅料受到微生物污染程度的检查。 包括：
1）细菌计数； 2）霉菌及酵母菌计数； 3）控制菌检查：大肠杆菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡 萄球菌，大肠菌群
2
细菌、霉菌及酵母菌计数
稀释剂对照组：
蛋白胨稀释液 9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
计数B （阴性对照）
菌种组：
104 102
计数C （阳性对照）
空白样品组：
计数D
24
结果判断依据：
1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明： - 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。 2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明： - 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。 3、空白样品组测试结果阴性，表明： - 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。
甘露醇氯化钠琼 脂 (或卵黄氯化钠琼 脂) 35-37 ℃,18-72h
0.2ml 涂抹于 含庆大霉素的哥 伦比亚琼脂 厌氧, 35-微生物限度检查法与英美比较
比较项目
检验条件规定 计数测定方法 控制
ChP2005
总体10000级、局部100级 平皿法、薄膜过滤法、MPN 大肠埃希菌、大肠菌群、沙门 菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡 球菌、梭菌、其他致病菌 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液； pH6.8/7.6PBS；0.9%NaCl 细菌数：营养琼脂，48hrs 霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂， 72hrs,5～7天
10
恢复试验
- 微生物方法验证的实质就是评价和考察微生 物恢复试验（恢复生长）的可信度。 - 恢复试验就是确认某一检验方法，它可以使 加入其中的各种微生物都能够恢复生长。
食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数—检验方法比较
食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数—检验方法比较霉菌酵母菌在自然界中分布极广，种类繁多，食品中易受到不同程度的污染。
食品中霉菌酵母菌的增殖一般会导致营养价值下降、酸败变味或外观恶化等，影响货架期及口感，若霉菌、酵母菌含量较高，且日摄入量较多，会影响人体肠胃内的微生物平衡，甚至造成肠胃不适，可能引起疾病发生。
霉菌对干食品的最大风险主要是在适宜的条件下(产毒株、数量、温度、湿度、水分活度等），能产生霉菌的有毒代谢产物—霉菌毒素，引起过敏反应等各种急、慢性中毒及可能的致癌作用。
因此，人们愈来愈重视食品中霉菌及酵母菌污染对人体造成的危害。
在我国国家部分食品产品及卫生标准中，把霉菌和酵母菌作为常见指示菌进行监测和控制，如饮料、坚果制品、米面制品、糕点类等食品。
霉菌和酵母的检测被列入国标4789 系列食品安全微生物常规检测项目之一 , 霉菌酵母菌的检验方法看似简单，但由于食品种类繁多成分复杂，食品中存在的霉菌种类较多，对环境温湿度及营养成分的要求有所不同，要在同等条件下把所有的霉菌培养出来，反映出样品的真实情况，实属不易，且霉菌前期生长速度缓慢，后期菌丝急剧增加，特别是毛霉的蔓延，给霉菌和酵母菌的同时计数带来一定的困难，如何能更准确、快速提离食品中霉菌检测数目是食品卫生部门面临的一个严峻问题。
能力验证是利用实验室间的比对判定实验室的特定校准、检测能力，以考察实验室检验能力的外部质量活动,组织方提供试验的样本，一般会考虑增加检测难度。
为了更准确更全面得出能力验证结果，本实验室综合了多种方法进行同步检测，主要是考虑霉菌、酵母菌总数检测是通过平板中生长的菌落数目直接计数推算，培养基的质量和培养方式直接影响了检测的结果，因此，选择两种常用的霉菌酵母培养基，采用正置和倒置培养法进行试验，比较分析不同培养基、不同培养方式对霉菌酵母菌计算结果的差异，进而得出较为准确的试验结果进行上报。
2 材料与方法2.1 样品能力验证样品：中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，样品编号为15-G068。
微生物（需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数）计数能力验证结果分析
微生物（需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数）计数能力验证结果分析发布时间：2023-01-13T08:36:01.951Z 来源：《中国科技信息》2022年16期第8月作者：杨丽雯陈旭煜* 赖瑞英张卉[导读] 能力验证既是对实验室检测技术能力的考核，也是实验室内部质量控制的评价方式，对提高实验室的检测能力具有重要意义。
杨丽雯陈旭煜* 赖瑞英张卉钦州市检验检测中心广西钦州 535000摘要：能力验证既是对实验室检测技术能力的考核，也是实验室内部质量控制的评价方式，对提高实验室的检测能力具有重要意义。
本文通过对此次能力验证的整个实验过程进行回顾，对“人、机、料、法、环”五个方面进行质量控制分析，通过分析总结实验室的优势及不足，充分发挥优势改正不足，以提高实验室的检测能力和管理水平，增强政府监管部门的公信力。
关键字：需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数能力验证结果分析1 前言能力验证是检验检测实验室认可活动中不可缺少的一项重要内容，不仅是针对个别检验项目的考核，同时是对整个机构质量管理体系运行情况的考核[1]，药品检验检测能力验证不仅能考核本实验室的药品检验技术，更能提高本实验室药品检验的技术能力，增强各级监管部门对本实验室能力的信任度[2]。
本实验组人员参加了2022年由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的ACAS-PT1396(2022)非无菌产品微生物限度检查：微生物（需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数）计数能力验证。
本文旨在回顾梳理实验过程，总结本次实验结果，为健全完善微生物检验内部质量控制管理体系提供理论和实践参考[2]。
2 实验试剂耗材、仪器及方法2.1 样品样品来源于中国检验检疫科学研究院测试评价中心，需氧菌总数计数样品编号为22-E290、22-X687；霉菌和酵母总数计数样品编号为22-D950、22-J547，为药品制剂的冷冻干燥物，采用玻璃西林瓶密封包装，瓶身贴有编号标识。
收到样品后立即置于4 ℃冰箱保存，并尽快安排实验。
细菌霉菌和酵母菌计数
细菌霉菌和酵母菌计数1 简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。
也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。
细菌、霉菌和酵母菌计数除另有外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。
以琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。
该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、pH 和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。
一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。
因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu）不应理解为细菌、霉菌和酵母菌的个数。
在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。
2 设备、仪器2.1 设备2.1.1 无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。
2.1.1.1 结构和要求见无菌检查法2.1.1.2 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间的净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
2.1.1.3 缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。
缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。
2.1.1.4 洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
洁净级别尘粒数/m3 浮游菌（个）/ m3沉降菌（个）/（∮90mm·0.5h）微粒直径≥0.5µm 微粒直径≥5µm100级10000级100000级≤3，500≤350，000≤3，500，000≤0≤2000≤20，000≤5≤100≤500≤1≤3≤10沉降菌数测定（Ⅱ法）无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上，在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证1份ok
一、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
二、适用范围：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
三、责任者：质量标准分析方法验证小组。
四、正文：1、验证申请2、验证立项申请表3、验证方案4、验证方案的批复5、验证报告6、验证报告的审批7、验证证书细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。
我公司细菌、霉菌及酵母菌计数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。
请予以批准！附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单组长：成员：申报单位：质量标准分析方法验证小组申报日期：年月日验证申请批复细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案一、概述：1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。
2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ4、验证人员：质保部：负责对验证结果进行评价。
化验室：负责验证情况的检测和监督。
总经理：负责对验证结果进行评价。
5、验证日期：二、验证1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。
按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。
2、内容：（1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
微生物方法学验证
速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。
2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。
（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。
b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。
c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。
d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。
4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例）白色念珠菌（0）代↓传代培养↓实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天↓计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株）取白色念珠菌的新鲜培养物↓用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑曲霉的新鲜培养物↓加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱↓采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
霉菌和酵母菌检验方法验证报告
方法验证报告方法验证报告一、方法依据/原理1.1方法依据：化妆品安全技术规范（2015）第五章 6 霉菌和酵母菌检验方法1.2原理：化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。
本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28℃±2℃培养5d，计算所生长的霉菌和酵母菌数。
二、使用范围2.1适用于化妆品霉菌和酵母菌的测定。
三、设备情况表1使用仪器设备一览表表2标准物质和关键物料登记表四、环境条件情况表3环境条件五、人员能力情况表4相关人员六、方法验证/确认情况6.1 实验步骤6.1.1样品前处理6.1.1.1液体样品：水溶性的液体样品，用灭菌吸管吸取 10mL 样品加到 90mL 灭菌生理盐水中，混匀后，制成 1：10检液。
6.1.1.2油性液体样品：取样品10g，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40℃—44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL（在40℃—44℃水浴中预温），在40℃—44℃水浴中乳化，制成1：10的悬液。
6.1.1.3膏、霜、乳剂半固体状样品：亲水性的样品：称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置 15min。
用其上清液作为 1:10 的检液。
疏水性样品：称取10g，置于灭菌的研钵中，加10mL灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL灭菌吐温 80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40℃—44℃水浴中充分混合，制成 1：10 检液。
6.1.1.4固体样品：称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10 的检液。
使用均质器时，则采用灭菌均质袋，将上述水溶性膏、霜、粉剂等，称10g 样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min—2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，加10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80，70mL 灭菌生理盐水，均质3min—5min。
霉菌和酵母菌菌数检验技术
28±1℃ 5天
4.结果计数
案例---蜂蜜中霉菌数测定
菌落计数应于培养后的72 h进行第一次观察。培养过程中观察平板时，动作稍重，生长快速的 霉菌孢子就会在培养基内扩散，导致二次污染，结果异常。
一般以第五天的读数为最终计数。
案例---蜂蜜中霉菌数测定
5.结果报告 例次 1
不同稀释度的平均菌落数
GB 4789.15-2016 标准解读
5 操作步骤
5.1.3 取1 mL 1:10样品匀液注入含有9 mL 无菌稀释液的试管中, 另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸，或在 漩涡混合器上混匀，此液为1:100的样品匀液。 5.1.4 按5.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。 5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进 行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀 释液加入2个无菌平皿作空白对照。 5.1.6 及时将20 mL～ 25mL冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃ 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，置水平台面待培养基完全凝固。
计算公式：
备注：
注意事项
培养基的选择 在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基： ① 马铃薯-葡萄糖-琼脂配有计算（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良 好。用PDA做平板计数时，必须加入抗菌素以抑制细菌。 ② 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的 作用。孟加拉红还可以抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的 红色有助于霉菌和酵母菌落的计数
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一、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
二、适用围：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
三、责任者：质量标准分析方法验证小组。
四、正文：1、验证申请2、验证立项申请表3、验证方案4、验证方案的批复5、验证报告6、验证报告的审批7、验证证书细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。
我公司细菌、霉菌及酵母菌计数方法严格按照《中华人民国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。
请予以批准！附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员组长：成员：申报单位：质量标准分析方法验证小组申报日期：年月日验证申请批复细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案一、概述：1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。
2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
3、验证判断标准：《中华人民国兽药典》2005年版附录XIJ4、验证人员：质保部：负责对验证结果进行评价。
化验室：负责验证情况的检测和监督。
总经理：负责对验证结果进行评价。
5、验证日期：二、验证1、验证依据：《中华人民国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。
按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。
2、容：（1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌沙布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数60cfu的孢子悬液。
（2）验证方法验证试验进行了3次独立的平行试验。
A、试验组供试液（Ⅰ）纯化水1ml（Ⅱ）药品名称（1：100）10g，取供试液1ml过滤冲洗，在最后一次冲洗液中加入60cfu试验菌。
B、菌液组测定所加试验菌数。
C、供试品对照组取相当于供试品1g（1ml），按菌落数据计数方法测定供试品本底菌数。
D、稀释剂对照组用相应稀释液0.9%无菌氯化钠，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液60cfu，按薄膜过滤法制备计菌落数。
（Ⅰ）纯化水试验组A 菌液组B 供试品对照组C稀释剂对照组DD组菌回收率%D/BC组菌回收率%(A-C)/B大肠埃希菌1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3≥70≥70 平均：金黄色葡萄球菌≥70≥70 平均：枯草芽孢杆菌≥70≥70 平均：白色念珠菌≥70≥70 平均：黑曲霉≥70≥70 平均：（Ⅱ）产品名称以上试验同时取试验用稀释液0.9%无菌氯化钠1ml ，依薄膜过滤法操作，作为阴性对照试验，均应无菌生长。
（3）验证方案的实施情况，及偏差情况分析。
对于细菌霉菌及酵母菌计数方法 验证方案应进行严格细致精密认真的实施，根据统计结果，数据基本上应在允许偏差围。
（4）培训：所有参与的人员在开始验证前应作充分的培训。
（5）结果判断由上表可知，在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率，（稀释剂对试验组A菌液组B供试品对照组C稀释剂对照组DD 组菌回收率% D/BC 组菌回收率% (A-C)/B大肠 埃希菌≥70≥70平均：金黄色 葡萄球菌≥70≥70平均：枯草芽孢杆菌≥70≥70平均：白色念珠菌≥70≥70平均：黑曲霉≥70≥70平均：照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）应均大于70%，则按该验证供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌霉菌及酵母菌数。
（6）再验证当建立药品的微生物限度检查法时，进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证方案批复细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证报告一、概述：1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。
2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
3、验证判断标准：《中华人民国兽药典》2005年版附录XIJ4、验证人员：质保部：负责对验证结果进行评价。
化验室：负责验证情况的检测和监督。
总经理：负责对验证结果进行评价。
5、验证日期：二、验证1、验证依据：《中华人民国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。
按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。
2、容：（1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌沙布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数60cfu的孢子悬液。
（2）验证方法验证试验进行了3次独立的平行试验。
A试验组供试液（Ⅰ）纯化水1ml（Ⅱ）药品名称（1：100）10g，取供试液1ml过滤冲洗，在最后一次冲洗液中加入60cfu试验菌。
B菌液组测定所加试验菌数。
C供试品对照组取相当于供试品1g（1ml），按菌落数据计数方法测定供试品本底菌数。
D稀释剂对照组用相应稀释液0.9%无菌氯化钠，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液60cfu，按薄膜过滤法制备计菌落数。
（Ⅰ）纯化水试验组A 菌液组B 供试品对照组C稀释剂对照组DD组菌回收率%D/BC组菌回收率%(A-C)/B大肠埃希菌1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 383.33 73.33 96 96 97 60 60 60 52 52 51 50 51 50平均96 60 52 50金黄色葡萄球菌97 97 96 60 60 60 53 54 54 52 52 5280.67 71.67平均97 60 54 52枯草芽孢杆菌96 96 96 60 60 60 51 52 52 50 50 5083.33 73.33平均96 60 52 50白色念珠菌95 96 95 60 60 60 52 52 52 51 52 5286.67 71.67平均95 60 52 52黑曲霉96 96 96 60 60 60 53 53 52 51 50 5185.00 71.67平均96 60 53 51（Ⅱ）药品名称以上试验同时取试验用稀释液0.9%无菌氯化钠1ml ，依薄膜过滤法操作，作为阴性对照试验，均无菌生长。
（3）验证方案的实施情况，及偏差情况分析。
对于细菌霉菌及酵母菌计数方法 验证方案进行了严格细致精密认真的实施，根据统计结果，数据基本上在允许偏差围。
（4）结论：由上表可知，在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率，（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，试验组的菌回收率试验组A菌液组B供试品对照组C稀释剂对照组DD 组菌回收率% D/BC 组菌回收率% (A-C)/B大肠 埃希菌 12 3 1 2 3 1 2 3 1 2 386.67 85.0089 89 88 60 60 60 38 38 38 52 51 52 平均89603852金黄色 葡萄球菌 91 90 91 60 60 60 40 41 41 50 50 5083.3383.33平均91604150枯草芽孢杆菌 89 89 89 60 60 60 38 39 39 51 51 5085.0083.00平均89603951白色念珠菌 88 88 88 60 60 60 38 37 38 52 52 52 86.6783.33平均88603852黑曲霉90 89 89 60 60 60 39 40 39 50 51 50 83.3383.33平均90 604050（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均大于70%，则按该验证供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌霉菌及酵母菌数。
结论人：日期：批准人：日期：（5）再验证当建立药品的微生物限度检查法时，进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证报告批复验证证书★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★名称：上述检查方法已按验证方案进行验证，各项验证结果符合标准要求，批准按此方案执行。
验证报告名称：验证报告编号：验证完成日期：有效期:验证办公室：年月日备注：1．该方法应在当前验证条件下使用，使用条件发生变更，应报验证办公室审核，必要时重新验证。
2．该方法应按批准的标准操作。