抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
牛奶中抗生素残留的检测方法
doi:10.19369/j. cnki. 2095 — 9737.2021.04.043牛奶中抗生素残留的检测方法范松阳(黑龙江省地质矿产实验测试研究中心，黑龙江哈尔滨150000)摘要：牛奶等乳制品中如果残留抗生素既会导致品质变差，严重时还会对发酵乳制品的生产造成影响，使其产量降低，并导致后期产品风味变差，损害生产者的经济效益，同时人们摄入后会 严重危害健康，如导致人体发生过敏反应（过敏性休克、皮疹等），使肠道中有益菌的生长被抑制，而致病菌、念珠菌等大量增殖，引起局部或者全身感染，还会使人体对抗生素形成抗药性，明显加大临床治疗难度。
现概述奶牛中抗生素残留的检测方法，供参考。
关键词：牛奶；抗生素残留；检测方法中图分类号：T S252. 7 文献标识码：B文章编号2095—9737(2021)04 —0074 —021理化检测法1.1检测原理该法主要是根据抗生素分子的性质，使用相 关实验仪器对其进行分离检测。
分离时常用的实 验技术为电泳检测或者色谱检测等，检测时常用 的实验技术为紫外检测、化学发光检测、荧光检测 或者质谱检测等。
1.2优缺点该法具有精确可靠、重复性好、检测灵敏、分 离效率高、结果稳定的特点，属于检测抗生素残留 的一种精确方法。
2微生物检测法该法是检测牛奶抗生素残留时应用比较广泛 的经典方法，主要有氯化三苯基四氮唑法（T TC 法）、纸片法、管蝶法以及试剂盒法等。
2.1检测原理主要是根据抗生素对微生物的机能、生理代 谢产生的抑制作用来对样品中残留抗微生物药物 进行定性。
2.2优缺点这种检测方法具有费用低、操作简单、结果可 靠、不需使用高级实验设备的优点，可应用于普通 养殖场及实验室。
但由于需要进行微生物培养，因此有相对较长的检测时间，无法实现定量检测，不可检测出某些抗生素的最低限。
2.3常用方法2.3. 1T TC 法将9m L灭菌脱脂乳中接种提前制备好的嗜热链球菌菌种，放人3 6±1C恒温培养箱中经过15 h活化，然后对脱脂乳按1 〇 1比例进行稀释制 成测试菌液。
快速检测乳及乳制品中多种抗生素残留的微生物抑制法
◎ 高静静，王一村，李 娜，才美佳，赵彤彤，张宇鑫，周莉莉 （山东省产品质量检验研究院，山东 济南 250102）
GAO Jingjing, WANG Yicun, LI Na, CAI Meijia, ZHAO Tongtong, ZHANG Yuxin, ZHOU Lili (Shandong Institute for Product Quality Inspection, Ji’nan 250102, China)
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造成重大的困扰。原料乳中抗生素残留对后期乳制品 的生产会产生重要的影响，由于乳制品加工过程需要 微生物参与中，而抗生素残留过高会对微生物的繁殖 产生一定的影响。此外，长期食用抗生素残留超标乳 制品会给自身健康带来严重的影响。主要表现在抗生 素残留超标会增加病原菌的耐药性，破坏人体肠道中 的微生物菌落的平衡和容易引发过敏反应等。为防止 含有抗生素的乳以及乳制品进入市场，对消费者造成 不可逆的伤害，研究人员均会对进入市场中的乳制品 中抗生素含量进行检测。
抗生素残留现状及检测方法
抗生素残留现状及检测方法随着我国经济的快速发展，人们追求效益最大化，抗生素的使用越来越普遍，如用抗生素治疗奶牛的乳腺炎；畜禽养殖户在饲料中添加抗生素和激素，提高种畜的抗病能力和食欲；水产养殖用户为了让大闸蟹加快脱壳过程、长得肥大生猛，给蟹喂食大量抗生素和激素等。
我国是抗生素生产和使用大国，据统计每年约有6000吨抗生素用于饲料添加剂，占全球抗生素饲料添加剂的50%。
抗生素的大量滥用已经严重威胁到人们的身体健康，专家指出，经常食用含有抗生素的食品，即使是微量的，也能使人出现荨麻疹或造成过敏性休克。
时常摄入含有抗生素的食品，可使某些菌株产生耐药性，从而带来预防与治疗某些人畜疾病的困难。
如果长期食用抗生素残留的食物，可造成人体中一些非致病菌的死亡，使菌群平衡失调或引起核黄素缺乏症和紫癜性损伤。
特别是氯霉素的滥用，极易损害人类骨髓的造血功能，并由此导致再生障碍性贫血的发生。
两年前，四川资阳地区曾暴发猪链球菌疫情，微生物专家李明远教授认为，很可能是养殖业者长期在猪饲料里滥用抗生素导致的。
常用抗生素包括β-内酰胺类、四环素类，氨基糖苷类，大环内酯类，磺胺类等，世界各国均对抗生素的使用量提出严格标准，欧盟的标准比日本和美国的标准更加严格，限量值更低，我国要想保障本国食品安全并出口产品到上述国家，就必须加强我国的自身的检测能力。
一般来说，肉类（畜禽），鱼虾（水产），蛋类，奶类，饲料、蜂蜜等产品需要进行抗生素检测，常用方法包括：液相色谱或液相色谱与质谱联用，微生物抑制法和酶联免疫方法。
色谱方法是一种理化检测方法,一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，但检测程序复杂，费用较高，需购买色谱仪等检测设备，不适合小型检验室。
微生物抑制法和酶联免疫方法属于筛选方法，操作简便、快速，消耗成本低，不需要购买大型仪器，但阳性结果需要其他方法进行确认。
酶联免疫方法存在一定的假阳性，下面针对微生物方法进行详细介绍。
动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法_微生物法
取供试样品 , 作为供试试料。 取空白样品 , 作为空白试料。 取空白样品 , 将青霉素标准储备液稀释成 10 ng/ m L 的溶液, 作为空白添加试料。 取供试样品适量 , 按每 1mL 计加青霉素酶 0. 10 mL , 在( 37 试料。 4. 4. 2 样品处理 2) 培养 30 min, 作为判定试验 取试料适量, ( 82 2) 水浴加
热 2 m in, 冷却后, 作为试样溶液 , 供微生物法测定。 4. 4. 3 双碟的制备 将检定培养基 ( 见附录 A. 3) 融化 , 置水浴中冷却至 55~ 64 , 加入菌悬液 ( 每 100 mL 培 养 基 加 0. 6 ~ 0. 8 mL ) , 摇 匀 , 吸 取 6. 0 mL置平皿中, 使其均匀摊布, 待凝固 15 m in 后 备用。
蛋白胨 0. 3 g , 葡萄糖 5. 25 g , 氯化钠 0. 5 g, 磷酸氢 二钾 0. 25 g, 吐温 - 80 1 g, 溴甲酚紫 0. 06 g, 琼脂 15 g, 水 1 000 m L。混合上述成分 , 调节 pH 值使灭 菌后为 7. 8 0. 2, 分装, 115 灭菌 15 min。
动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法
1 范围 本标准规定了动物性食品中青霉素类抗生素残 留的微生物学检测方法。 本标准适用于牛奶中青霉素类抗生素的残留筛 选检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本 标准的条款。凡是注日期的引用文件, 其随后所有 的修改单 ( 不包括勘误的内容 ) 或修订版均不适用于 本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的 引用文件 , 其最新版本适用于本标准。 GB/ T 1. 1- 20001 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准的 结构和编 写规则 ( ISO/ IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for t he structure and draft ing of In t ernat ional St andards, NEQ) 中华人民共和国兽药典 GB/ T 6682- 1992 验方法 NY/ T 二 年版 分析实验室用水规则和试 动物源食品中兽药残
牛奶中抗生素残留的微生物检测方法应用分析
利描分析与检测牛奶中抗生素残留的微生物检测方法应用分析□朱建恩广东产品质量监督检验研究院摘要：牛奶因其高营养价值得到了人们的青睐，但牛奶抗生素残留问题受到了社会各界的广泛关注。
本文使用微生 物检测方式分析牛奶内抗生素的残留，旨在强化原料、产品质量检测，为保护居民身体健康提供有效参考意见。
关键词：牛奶；抗生素残留；微生物检测；应用牛奶属于老少皆宜的营养品，若 是牛奶中含有抗生素，在长期饮用中 会导致服用者产生a敏反应，对服用 者的健康造成影响。
我国相关政策明 确规定，禁止抗生素残留a量的牛奶 在市场上销售，但就实际情况而言，政策未能得到有效落实[11。
1微生物检测法的原理微生物检测法主要依据抗生素对微生物的生理机能、代谢作用、抑制 作用等定性、定量确定出样品内的抗 生素残留。
通a在被检测牛奶内培养 出抗生素敏感微生物，若是牛奶内的 样品不存在抗生素，在微生物的生长 繁殖中，能够观察到培养基变得浑浊、不透明，且各种指示剂的颜色也 会发生相应的变化P]。
微生物检测法 在应用中，具有检测可靠性高、操作 便捷、成本低的特点，并且存在着一 定的特异性，微生物检测法原理如图1所示。
由于抗生素对人体会产生较大的危害，主要包括：破坏人体菌种平衡，极易造成“二重感染”；使得a敏体 质的人产生a敏反应，危机其健康；促使人体产生耐药菌株，对后期患病 的抗生素治疗产生影响，因此，微生 物检测法的应用十分重要。
2牛奶中的抗生素残留的微生物检测方法应用牛奶抗生素残留微生物检测方式常用的包括：TTC检测法、纸片法、牛乳活性检测法等，其应用主要如下。
2.1纸片检测法纸片检测法也称之为“PD检测 法”，常用的纸片检测法，需要枯草 杆菌纸片、嗜热脂肪菌纸片，如图2 所示。
通过应用两类检测方式，可以 检测牛奶中的抗生素，检测过程与TTC基本一致，在菌种选择上有着较 大的差异性[3]。
枯草杆菌纸片法检测 的结果呈假阳性，为了确定阳性物质 是否为青霉素、>8-内酰胺类，针对加 热后的乳样需要使用青霉素酰处理，核酸提取9>体系配制分装加疆反应液+8st酶反应体系图1微生物检测法原理示意图图2纸片检测法试纸图将牛奶内的青霉素处理掉，接着开展 抗生素检测。
牛奶中抗生素残留检测的研究现状
第１７期 收稿日期：２０２０－０６－１３作者简介：马 娅（１９８７—），女，甘肃定西人，兰州石化职业技术学院讲师，硕士研究生，主要研究方向为化学与生物传感器。
牛奶中抗生素残留检测的研究现状马 娅，马丽娜，史俊杰，焦林宏，王红玉（兰州石化职业技术学院，甘肃兰州 ７３００６０）摘要：牛奶在人们饮食中占有重要地位，但是种种原因使得抗生素残留于牛奶中，严重影响奶品品质及人体安全，乳品中抗生素残留的检测和管理尤为重要。
本文主要介绍牛奶中抗生素残留的三种检测方法：微生物检测法、理化检测法和免疫法。
而我国在生产管理上常用的筛查检测方法有ＴＴＣ法和ＳＮＡＰ法，两种方法各有优劣，而基于ＴＴＣ法的试纸检测法是一种正在研发的有潜力的筛查分析方法。
关键词：牛乳；抗生素；残留；检测方法中图分类号：Ｏ６５７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０２０）１７－００８３－０２ 牛奶因其营养成分齐全、营养价值高、易消化吸收等特点，被誉为“食品之王”，逐渐成为人们生活中不可或缺的一种食品。
然而，奶牛饲养中为预防疾病常在饲料中添加抗生素，服用大剂量抗生素药物，获得的奶品中添加抗生素防止其腐坏［１］，这些因素均会导致抗生素在牛奶中残留，长期饮用含抗生素残留的牛奶不仅危害人类的健康，同时由于抗生素对发酵乳中发酵菌种的繁殖产生抑制作用使其发酵异常从而影响奶制品的品质［２］。
世界卫生组织（ＷＨＯ）在１９７９年就已经将抗生素列为污染物，之后各个国家都开始关注牛奶中抗生素残留检测，提出了不应检出抗生素的要求。
２００１年中华人民共和国农业行业标准也规定了无公害食品－生鲜牛乳中不能检出抗生素。
我国农业部在２００１年１０月发布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》，明确规定“新鲜牛乳中抗生素不得检出”。
２００２年发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，奶中最高允许残留量（单位ｎｇ／Ｌ）标准是：新霉素为５００；庆大霉素为２００；林可霉素为１５０；四环素、土霉素、磺胺类等均为１００［３］。
微生物抑制法快速检测动物源性食品多种抗生素残留
1
( 11 Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China; 21 Guangzhou Center for D isease Con2 trol and Prevention, Guangzhou 510080, China) [ Abstract] O bjective: To establish a rap id determ ination method for several antibiotics residues in ani m al derived food1M ethods: Fifteen antibiotics residues in ani m al derived food were rap idly determ ined by m icrobial inhibition method1 Results: The detection lim its of established determ ination method could meet national standards of requirements of veteri2 nary drug residues in anim al derived food1Conclusion: Established m icrobial inhibition method is a low - cost, stabile, sensitive screening method for several antibiotics residues in anim al derived food and the detection tim e is 18 ～22 h1 [ Key words] Anim al derived food; Antibiotic residues; M icrobial inhibition method; Rap id detection
抗生素残留量检查法标准操作规程
抗生素残留量检查法标准操作规程目录1 目的 (2)2 范围 (2)3 职责 (2)4 依据 (2)5 定义 (2)6 内容 (2)6.1 说明............................................................................................... 错误！未定义书签。
6.2 原理 (2)6.3 实验材料 (2)6.4 操作步骤 (3)6.5 判定标准 (3)6.6 注意事项 (4)7 相关文件 (4)8 附件 (4)9 变更历史记录 (4)1目的1.1本规程规范了抗生素残留量检查法的操作过程。
2范围2.1本规程适用于供试品中氨苄西林的残留量检查。
3职责3.1质量检验人员：应严格执行本规程的规定。
3.2质量保证人员：负责对本程序的执行进行监督、检查。
4依据4.1《中国药典》2010年版三部，附录ⅨA，“抗生素残留量检查法”P59~P60。
5定义N/A6内容6.1原理6.1.1抗生素残留量检查法是依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中抗生素的残留量。
6.2实验材料6.2.1仪器6.2.1.1生物安全柜6.2.1.2恒温培养箱6.2.1.3恒温水浴锅6.2.1.4游标卡尺6.2.2器具6.2.2.1牛津杯规格：内径6mm、外径8mm、高10mm 6.2.2.2玻璃平皿规格：直径约90mm6.2.2.3试管及硅胶塞规格：18×180mm6.2.2.4吸管规格：10ml6.2.3标准物质6.2.3.1取氨苄西林对照品适量，用0.01mol/L的盐酸溶解，并稀释成每1ml中含氨苄西林10mg的溶液，作为氨苄西林对照品储备液，200ul/支无菌分装，-20℃保存，备用。
6.2.4试剂、试液6.2.4.1磷酸盐缓冲液（pH6.0）●称取磷酸二氢钾8.0g、磷酸氢二钾2.0g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃灭菌30分钟。
抗生素残留分析报告
利用荧光物质标记抗体或抗原，通过荧光信号的强度来判断样品中抗生素残留的浓度。
高效液相色谱法
• 高效液相色谱法是一种分离和检测复杂样品中微量组分的方法， 具有高分辨率、高灵敏度、高重复性等优点。通过与不同的检 测器联用，可以实现多种抗生素残留的同时检测。
气相色谱-质谱联用法
• 气相色谱-质谱联用法是一种将气 相色谱的高效分离能力与质谱的 定性鉴别能力相结合的方法，适 用于检测具有挥发性的抗生素残 留。通过质谱分析，可以获得抗 生素分子量、结构等信息，有助 于确定抗生素的种类和浓度。
04
抗生素残留的检测结果
动物源性食品中的抗生素残留
牛奶与奶制品
在牛奶和奶制品中检测 到四环素类、青霉素类、 磺胺类等抗生素残留。
肉类与肉制品
在牛肉、猪肉、鸡肉等 肉类及其制品中检出氟 喹诺酮类、大环内酯类、 β-内酰胺类等抗生素残 留。
蛋类
在鸡蛋、鸭蛋等蛋类中 检测到氟ห้องสมุดไป่ตู้尼考、磺胺 类等抗生素残留。
耐药性
长期摄入含有抗生素残留的食物， 可导致人体内的细菌产生耐药性， 降低抗生素的治疗效果。
过敏反应
部分人群可能对抗生素残留物产 生过敏反应，出现皮疹、呼吸急 促等症状。
生态风险
抗生素残留进入环境后，可能对 土壤、水体等生态系统造成影响， 破坏生态平衡。
抗生素残留的检测标准
检测方法
采用高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法等检测技术对动物性食品中的抗生素残留进行 定量和定性分析。
抗生素残留的检测方法
微生物检测法
微生物抑制法
通过观察微生物的生长情况来判断样品中是否存在抗生素残留，通常用于肉类、禽类和乳制品的检测。
微生物鉴定法
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法work Information Technology Company.2020YEAR抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度0.02mm。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
浅析原料乳及乳制品中抗生素残留现状及微生物检测方法
129原料乳及乳制品中的抗生素残留是影响乳制品安全的关键因素，而通过微生物检测法可以有效检测出原料乳及乳制品中的抗生素残留，本文重点论述了我国原料乳及乳制品中抗生素残留的现状以及微生物检测方法。
一、我国原料乳及乳制品中抗生素残留现状在我国，原料乳及乳制品的安全问题主要是因为其中存在一定量的抗生素（用于治疗牛乳腺炎症）。
从食品保鲜的角度来说，抗生素能够有效抑制鲜奶中微生物的生长繁殖过程，从而延长鲜奶的保质期，但是不正确、不恰当用药却会导致乳制品中存在抗生素残留，从而造成食品安全隐患。
考虑到乳制品加工过程中会有大量微生物参与其中，所以抗生素残留较高必然会对微生物繁殖过程产生一定影响。
再者，如果长期食用抗生素残留超标的乳制品，人体健康也会深受影响，主要表现是抗生素残留超标，增加病原菌耐药性，同时严重破坏人体肠道中的微生物菌落平衡，导致人体出现不同程度的过敏反应。
因此，对原料乳及乳制品进行抗生素残留检测是必不可少的。
值得注意的是，我国原料乳及乳制品中抗生素残留的现状并不容乐观。
例如，一份针对北京、天津、石家庄5个零售点共77个牛奶样品的β－内酰胺酶残留检测结果显示，63.6％的样品检测呈阳性；一项针对西宁、南宁、广州、杭州、泉州、北京等城市乳制品质量的检测调查结果显示，在近800份乳品采样中，抗生素残留超标位居不合格项目之首。
二、原料乳及乳制品中抗生素残留的微生物检测方法抗生素检测技术的种类较多，根据技术原理主要包括免疫法、微生物检测法以及理化分析法。
其中，微生物检测方法能够实现对原料乳及乳制品中抗生素残留、微生物代谢及其生理机能的有效分析，同时了解抗生素残留对于浅析原料乳及乳制品中抗生素残留现状及微生物检测方法微生物代谢生理机能的抑制作用。
在检测过程中，如果原料乳及乳制品样品中存在对抗生素敏感的微生物，则表示待检测样品中没有抗生素残留；反之，微生物的生长则会受到严重抑制，在培养基上逐渐形成明显的抑菌圈。
微生物抑制法快速检测鲜奶中多种抗生素残留
微生物抑制法快速检测鲜奶中多种抗生素残留王志强;胡国媛;李志勇;凌莉;胡科峰【期刊名称】《中国食品卫生杂志》【年(卷),期】2008(20)2【摘要】目的建立牛奶中多种抗生素残留的快速检验方法。
方法以抗生素对敏感细菌能够产生抑制作用原理，采用微生物抑制法快速检测牛奶中10种抗生素残留。
结果该方法最低检出限为：氨苄青霉素、青霉素0．001μg/ml，金霉素、土霉素、红霉素、四环素0．01μg/ml，链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素0．1μg/ml，优于GB／T4789．27—2003TTC法的最低检出量：青霉素0．004μg/ml，链霉素0．5μg/ml、庆大霉素0．4μg/ml、卡那霉素5μg/ml。
结论该方法成本低廉，稳定性好，灵敏度高，检测时间仅需18～22h，检测低限符合国家标准要求，能够同时检测10种抗生素。
【总页数】3页(P139-141)【关键词】乳;抗菌药;药物残留物;微生物学技术【作者】王志强;胡国媛;李志勇;凌莉;胡科峰【作者单位】广东检验检疫局技术中心【正文语种】中文【中图分类】R15;R446.5【相关文献】1.高通量微生物显色法快速检测动物源性食品中抗生素残留 [J], 范维;高晓月;李贺楠;李莹莹;郭文萍;陈淑敏2.快速检测乳及乳制品中多种抗生素残留的微生物抑制法 [J], 高静静;王一村;李娜;才美佳;赵彤彤;张宇鑫;周莉莉3.快速检测乳及乳制品中多种抗生素残留的微生物抑制法 [J], 高静静;王一村;李娜;才美佳;赵彤彤;张宇鑫;周莉莉4.鸡蛋中抗生素残留微生物法快速检测的研究 [J], 翟云忠;吴建敏;徐俊;赵强强;闫凤林5.微生物抑制法快速检测动物源性食品多种抗生素残留 [J], 王志强;胡国媛;李志勇;凌莉;胡科峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
浅谈食品中抗生素残留的常用检测技术
602021/01中国食品工业安全与检测SAFETY AND TESTING梁艳冰 珠海市食品药品检验所 广东珠海 519000浅谈食品中抗生素残留的常用检测技术引言结合目前的实际情况来看，在对抗生素开展相应的研究工作时，主要是将动物源性食品与植物源性食品之间进行了划分，或者是针对一种食品中的抗生素进行检测，其覆盖范围比较有限。
因此，为了在更大程度上保证食品的安全性，一定要加强对食品抗生素残留检测技术的研究工作，对各项技术应用中的优势与缺陷进行深入分析，从而在更大程度上提升抗生素检测水平。
1高效液相色谱法对于高效液相色谱法而言，主要将重点放在了液体方面，通过对高压输液系统的合理应用，可以将级性不一样的单一溶剂或者是比例不同的缓和溶剂、缓冲液等装入到固定相的色谱柱中，当溶液各相关成分逐渐被分离之后，采用检测器来对其进行准确检测，通过这种方式完成对试样的分析过程。
一般情况下HPLC 检测技术有着比较广泛的应用，主要是因为该技术在应用过程中不但涉及到的范围比较广泛，同时还能发挥出比较好的分离效果，可以方便检测人员进行操作，能有效保证最终实现较高的检测率。
但是，这项技术在应用过程中也存在一定的缺陷，主要是不容易对生物大分子或者是无机离子进行准确检测。
一般情况下主要是将高效液相色谱检测技术应用于动物源食品抗生素检测工作中，也可以将其应用于植物性食品抗生素的检测环节中，最终可以取得比较好的检测效果。
2液质联用法液质联用法通常是将分离系统作为主要的液相色谱，检测系统为质谱，这样色谱与质谱之间的优势可以得到充分发挥，从而在更大程度上提升检测过程的灵活性，并且还能实现相关溶剂有效划分。
目前，在对液相色谱与质谱法进行应用时，主要是通过多反应检测方式来对抗生素进行摘要：抗生素主要指的是代谢产物，可以实现对微生物的有效抑制与消灭，是在动植物、真菌或者是细菌等微生物代谢基础上逐渐形成的。
通常情况下，相关人员在对抗生素进行制备时，主要是通过生物合成、化学合成以及半合成等几种方式来进行。
微生物法检测乳粉中抗生素残留的构建
为 ７ ． ０ ，分 装 于 锥 形 瓶 中，１ ２ １ ℃ 下 高 压 灭 菌 ２ ０ ｍｉ ｎ 。培 养前 ，加入 ０ ． ５ ｇ的 Ｍｇ Ｓ Ｏ ，制 成 产 孢
培 养基 。
酸 碱度 变 化 的 规 律 ，建 立 了 一 种 简 易 高效 抗 生 素
化钠 ５ ｇ ；蒸 馏水 １ ０ ０ ０ ｍＬ ，用 Ｎ ａ Ｏ Ｈ溶 液调 ｐ Ｈ值
色 谱 法 和免 疫 分 析 法 等 方 法
， 当前 应 用 的标
准 方 法为 免 疫 分 析 法 灵 敏 度 高 ，但 是 检 测 成 本 要 求 较 高 ，只 能 检 测 单 一 抗 生 素 ，不 易 于 推 广 。本
王 超 逸 ， 马 凯 ， 王 勇 军
（ 浙 江 农 林 大 学 林 业 与生 பைடு நூலகம்技 术 学 院 ，浙江 临 安 ３ １ １ ３ ０ ０ ）
摘
要 ：探 索 了 嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌 芽 孢 制 备 的 最 优 条 件 ，通 过 纸 片 法 平 板 抑 制 生 长 试 验 确 定 了 嗜 热 脂 肪 芽
检测 方 法 。
检 测培 养基 ：蛋 白胨 ５ ｇ ；葡 萄 糖 １ ０ ｇ ；酵 母
粉 ２ ｇ ；指 示 剂 ０ ． ０ ３ ｇ ；蒸 馏 水 定 容 至 １ ０ ０ ０ ｍ Ｌ，
ｌ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
ｐ Ｈ值调 至 ７ ． ５ ，分装 于锥 形瓶 中 ，１ ２ １℃ 高压灭 菌
孢 杆 菌对 乳 粉 中青 霉 素 Ｇ、土 霉 素 、链 霉 素 和 头 孢 拉 定 的检 测 限 为 ０ ． ０ ８～ ０ ． １ ６ ｍｇ・ ｋ ｇ ～；通 过 不 同酸 碱 指 示 剂 ，
微生物抑制法检测牛乳中青霉素类药物残留的研究
Ｍｏ ｄ ｅ ｒ ｎ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ９ ， Ｎ ｏ ． １
微生物ｇ ｐ ￥ ￣ Ｊ 法检测牛乳 中青霉素类药物残 留的研 究
马 丽苹 ，纠敏 ，秦 翠丽 ，赵君 峰 ，张春 雷
豆蛋 白胨和胰蛋白胨的培养基细分更适合嗜热脂肪 芽孢杆菌生长，从而便于检 测限的测定。 关键词 ：嗜热脂肪 芽孢杆菌；芽孢；青霉素；纸 片法；检测限
文章篇号：１ ６ ７ ３ ． ９ ０ ７ ８ （ ２ ０ １ ３ ） １ — １ ９ ３ － １ ９ ６
Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ Ｉ ｎｈ ｉ ｂｉ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐｅ ｎｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｎ － ｔ ｙ ｐｅ Ｄｒ ｕｇ ｓ Ｒｅ ｓ ｉ ｄｕｅ ｉ ｎ Ｍｉ ｌ ｋ
抗 生素残 留菌种为嗜热脂肪 芽胞杆菌 。因此 ，本试 验 采用 嗜热脂 肪芽孢杆菌作 为指示菌 ，对 牛乳 中青霉 素 类 药物残 留进 行检测 ，采用 滤纸片法研 究 了青霉素 钠
的检 测 限以及不 同营养 组分 、不 同药物 对检测 限结果 的影响 ，以期为后续青霉 素类药物快速 检测试剂盒 的 开发提供理 论依据 。 １ 材料 与方 法
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｔ ｅ ａ ｒ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｕ ｓ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｓ ａ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｏ ｒ ｏ ｔ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｎ ｒ ｅ ｓ ｉ ｄ ｕ ｅ ｓ ｎ ｉ ｍｉ Ｆ ｉ ｌ ｔ ｅ ｒ ｐ ａ ｐ ｒ ｅ ｍｅ ｈｏ ｔ ｄ Ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ｏ ｆ ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｎ ， ａ ｎ ｄ ｈｅ ｔ ｅ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｉｆ ｄ ｒｅ ｅ ｎ ｔ ｎ ｕ ｔ ｉ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｃ ｏ ｍｐ ｏ ｎ ｅ ｎ ｔ ｓ ， ａ ｎ ｄ ｄ ｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｄ ｒ ｕ ｇ ｓ ｏ ｎ ｈｅ ｔ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ｎ ｉ ｔ ｈ ｉ ｓ ｐ ａ ｐ ｅ ｒ ． Ｔｈ ｅ ｅｓ ｒ ｕ ｌ ｓ ｔ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｌ ｍｉ ｉ ｔ ｏ ｆ ｓ ｏ ｉｕ ｄ ｍ ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｎ ｎｄ ａ ｂ ｅ ｎ ｚ ａ ｔ ｈ ｉ ｎ ｅ ｐ ｅ ｉｃ ｎ ｉ ｌ ｌ ｎ ｉ Ｗａ ｓ １ ｎ ｇ ／ ｍ￣ ａ ｎｄ ２ ｎ ｇ ／ ｒ ｎ ￣ｒ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｔ ｖ ｅ ｌ ｙ ， ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｍｅ ｉｕ ｄ ｍ ｒ ｉ ｃ ｈｉ ｎ ｓ ｏ ｙｐ ｅ ｐ ｔ ｏ ｎ ｅａ ｎ ｄｔ ｒ ｙ ｐ ｏｎ ｔ ｅＷａ ｓ ｍｏ ｒ ｅ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅｆ ｏ ｒ ｈ ｅｇ ｔ ｒ ｏ ｗｔ ｈｏ ｆ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｔ ｅ ａ ｒ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｕ ｓ ， ｈｅ ｔ ｅｂ ｒ ｙｆ ａ ｃ ｉ ｌ ｉ ａｔ ｔ ｉ ｎ ｇｔ ｈ ｅｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｉ ｔ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈｅ ｔ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｔ ｅ ａ ｒ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ ｐｈ ｉ ｌ ｕ ｓ ； Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ； ｐ ｅ ｉｃ ｎ ｉ ｌ ｌ ｎ； ｉ ｐ ａ ｐ ｅ ｒ ｍｅ ｈｏ ｔ ｄ ； ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ
牛奶中抗生素残留的危害及检测方法
牛奶中抗生素残留的危害及检测方法摘要：在奶牛的日常管理过程中，抗生素常作为治疗药物和饲料添加剂，如果大剂量使用会造成药物残留和产生耐药性等问题。
牛奶中残留抗生素既会对人体健康带来危害，还会影响生产。
由于检测和控制牛奶中抗生素残留是一个复杂的过程，且产品生产过程中也可能随时混入一些不是常用的抗生素，进一步加大检测的难度。
因此，奶牛饲养过程中合理利用抗生素，对保证机体及其副产品的安全非常重要。
现主要对牛奶中抗生素残留的危害进行探讨，并介绍常用的检测方法，供大家参考。
关键词：牛奶;抗生素;危害;免疫法;快速检测法中图分类号：S859.79+6 文献标识码：B文章编号：2095-9737（2019）05-0139-021 危害1.1 影响人体健康1.1.1 导致过敏反应由于多种抗菌药（如四环素、青霉素、磺胺类药物等）都具有一定的抗原性，能够导致人体发生过敏反应，如经常饮用含有低剂量抗生素的牛奶，使机体在抗生素的反复刺激下而出现致敏。
如果人已经被致敏，在其再次接触相同抗生素时，会出现过敏反应。
1.1.2 引起肠道菌群失调正常情况下，人体肠道内菌群的变化会与人体相适应，部分菌群可抑制其他菌群的大量繁殖，但如果长时间摄入抗生素，会破坏这种平衡状态，造成条件致病菌大量繁殖，从而致病。
近几年，国外大量研究指出人们食入残留抗生素的动物性食品，会对胃肠道的正常菌群造成不良影响。
1.1.3 影响人体的免疫功能部分抗生素可阻碍免疫活性细胞的生长或者容易使其被破坏，如氨苄青霉素等可影响骨髓白细胞的生成，造成白细胞数量减少，从而使机体的细胞免疫功能降低。
部分抗生素会影响免疫系统的功能，如四环素类会对血清中白细胞的趋化性产生抑制，影响淋巴细胞的增殖，导致中性粒细胞的吞噬功能减弱。
1.2 危害生态平衡废弃牛奶中如果含有一些性质稳定的抗生素，会在环境中长时间保持稳定，从而对环境造成污染。
据报道，环境中的土霉素、链霉素较难被降解;低浓度的螺旋霉素可很快降解，但高浓度则需要6个月才可完全降解;在有氧的条件下，杆菌肽锌需要3～4个月才可完全降解，在无氧环境中需要更长的时间才可降解。
抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
批准：
PH4.5、6.0及8.0磷酸缓冲液要用时才配制，如要保存要在121℃高压杀菌15分钟后密封保存。但如有混浊或有沉淀物时不可使用。
4.试验菌的保存
用普通的细菌斜面培养基30℃培养18小时后确认试验菌在斜面全体上发育后密封冷藏（0-4℃）保存。下代移植每隔一个月至一个半月执行。
三、测定步骤
注：芽孢要染色显微镜观察确定芽孢达到80％以上才可。如果芽孢形成率达不到要求再培养数日即可，但如果培养10天以上，芽孢形成率还达
不到的话，试验菌可能变异，该试验菌不可使用。菌悬液冷藏（0-4℃）保存。
2.检定平板的制备在测定前，需进行预测试，以求得菌悬液最佳使用量。ATCC6633枯草芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30℃培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为12±1mm的菌悬液量为最佳。ATCC11778蕈状芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30℃培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为12±1mm的菌悬液量为最佳。
菌种
培养基
ATCC9341
AM5
ATCC6633
AM5
ATCC11778
AM8
注：尽可能在无菌环境中倾倒平板，打开盖放置于水平台面上冷却1-2分钟后再盖上以减少冷凝水。未用完的平板密封后置4-8℃，可保存2-3天。
4.样品检定
在制备好的检定用平板的底部作好标记，用灭菌镊子将检测用滤纸片浸入提取液，吸足提取液后，放置在制备好的琼脂平板上（也可先将纸片放置于平板上用加液器在每片滤纸上滴加90-100μL提取液），用镊子轻压使其
5001——10000 9 3
10001——15000 12 4
15001——25000 15 5
奶制品抗生素检测方法
奶制品抗生素检测方法引言：随着人们对食品安全的要求越来越高，检测食品中的抗生素残留成为了一个重要的问题。
其中，奶制品作为重要的食品之一，其抗生素残留问题尤为重要。
本文将介绍一些常用的奶制品抗生素检测方法，包括微生物学方法、生物传感器方法和色谱法等，以期提高奶制品抗生素残留检测的准确性和可靠性。
一、微生物学方法1. Bacillus subtilis生物传感器法该方法主要是利用Bacillus subtilis感应菌株的响应来检测奶制品中抗生素的残留。
此感应菌株具有对多种抗生素具有特异性响应的特点，通过菌株呼吸过程中释放的二氧化碳的生成量来检测抗生素的残留水平。
2.抑菌圈法抑菌圈法是通过将抗生素加入到含有抗生素敏感菌的培养基上，观察形成的抑菌圈的大小，从而判断抗生素的残留水平。
这是一种简单、快速、经济的奶制品抗生素检测方法。
二、生物传感器方法1.酶传感器法酶传感器法是以酶为敏感元件，通过测定酶催化底物的反应产物或底物消失的速度，来确定奶制品中抗生素的残留水平。
例如，可以利用氨化酶催化酶法检测β-内酰胺类抗生素。
2.免疫传感器法免疫传感器法利用抗生素抗原和特异性抗体之间的结合反应来检测奶制品中抗生素的残留。
可以采用电化学、光学等方法来检测抗生素-抗体结合反应产生的信号差异。
三、色谱法1.高效液相色谱法高效液相色谱法是常用的奶制品抗生素检测方法之一、它通过在液相中将混合物分离，然后通过检测不同组分的保留时间、峰面积等参数来确定抗生素的残留水平。
2.气相色谱法气相色谱法是另一种常用的奶制品抗生素检测方法。
首先将奶制品中的抗生素以化学方法提取，然后通过气相色谱的分离和检测来确定抗生素的残留水平。
该方法具有高灵敏度和高分辨率的优点。
结论：奶制品抗生素残留检测是食品安全中的重要环节，需要提高检测方法的准确性和可靠性。
微生物学方法、生物传感器方法和色谱法是常用的奶制品抗生素检测方法，它们各有优缺点，需要根据实际情况选择合适的方法。
四环素类药物残留分析技术——测定微生物法
四环素类药物残留分析技术——测定微生物法12.1.4.2 测定办法 TCs的残留测定办法已有大量文献报道，主要有微生物检测法、免疫分析法、薄层色谱法、毛细管电泳法、液相色谱法、液相色谱-质谱法等。
目前，一些新兴的检测技术，如传感器技术、流淌注射法、表面等离子共振技术等也开头在TCs残留分析中应用。
(1) 微生物法(microbiological analysis) 微生物法是测定抗生素的基本分析办法，其优点在于不需要复杂的样品前处理、不需要精密仪器、操作简便和检测费用低廉等，适用于大量样品的筛选，缺点是特异性较差，且不能用于定量检测。
常用于TCs测定的是蜡状芽孢杆菌(ATCC11778)，其对CTC的敏捷度为0.005mg/L，对CTC和OTC的敏捷度均为0.025mg/L，对MNC的敏捷度均为0.001～0.002mg/L。
林修光等建立了用标准纸片法迅速测定鸡肉中TCs残留量的微生物检测办法。
精确称取鸡肉样品10.0g，加入20mL缓冲液(pH4.5)，3000～4000r/min均质2min，静置10min以上，4000r/min离心10min，取上清液检验。
未浮现抑菌圈者则判为TCs抗生素阴性，检验液与0.05mg/kg标准溶液犹如样产生10mm以上显然的抑菌圈时，需举行加热确认实验。
取两支试管分离加入检验液、0.2mg/kg TCs标准稀释液各4mL，置于沸水浴中加热30min，取两个实验平m分离放置纸片为加热检验液、加热的0.2mg/kg TCs标准稀释液、未加热的检验液、未加热的0.2mg/kg标准稀释液等四种溶液后，置于35℃孵育17h观看结果，未加热的检验液和0.2mg/kg标准稀释液浮现正常的抑菌圈，加热的检验液和0.2mg/kg标准稀释液不浮现抑菌圈，可判为TCs抗生素阳性。
该办法的敏捷度为0.05mg/kg。
DeWasch等采纳微生物抑制测试筛选检测猪肉和鸡肉中的TCs残留。
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a.ATCC6633枯草芽孢杆菌
将二代保存的菌株接种于普通细菌培养基平板上，30℃培养一星期后形成芽孢。用灭菌生理盐水洗下平板上发育的菌苔，用65℃加热30分钟，再于3000rpm离心20分钟后取掉上清液。让沉淀物在悬浮在灭菌生理盐水中，这就是芽孢原液。
b.ATCC9341藤黄微球菌
1.样品制备：方法同三3。
2.提取缓冲液配制：同二3（2）。
3.检定用平板的制备
（1）检测用培养基准备：将3瓶检测用培养基分装3个三角烧瓶内，各加入100mL蒸馏水，作好标记，121℃，15分钟高压灭菌后冷却到50℃备用。
（2）平板制备：三种菌液（必须充分振荡至无细胞沉淀物）各取1mL，分别按下表所示加入各自对应的检测培养基内，充分混匀（约10秒）后倾倒平板，每块平板约8mL。
试剂盒内提供AM8培养基干粉1瓶、AM5培养基干粉2瓶，藤黄微球菌ATCC9341菌悬液1瓶、枯草芽胞杆菌ATCC6633芽胞悬液1瓶、蜡样芽胞杆
QS-F006
作业指导书
第3页共3页
文件编号：QC-WI017(1)文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
拟制：
审核：
批准：
菌蕈状变种ATCC11778芽胞悬液1瓶，土霉素标准纸片、红霉素标准纸片、卡那霉素标准纸片。
注：芽孢要染色显微镜观察确定芽孢达到80％以上才可。如果芽孢形成率达不到要求再培养数日即可，但如果培养10天以上，芽孢形成率还达
不到的话，试验菌可能变异，该试验菌不可使用。菌悬液冷藏（0-4℃）保存。
2.检定平板的制备在测定前，需进行预测试，以求得菌悬液最佳使用量。ATCC6633枯草芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30℃培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为12±1mm的菌悬液量为最佳。ATCC11778蕈状芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30℃培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为12±1mm的菌悬液量为最佳。
样液、标准液及阴性对照液（提取液），每份样品做两个平板上的平行试验，冷藏放置30分钟后，置30±1℃培养18±1小时。
四、结果报告：抑菌圈直径在10mm以上者为阳性，同时确认抗生素标准对照的抑菌圈在12mm以上。抑菌圈小于10mm，大于8mm的视为可疑，必要时重新测试，或用其它方法进行确认。
五、试剂盒检验方法
2、菌种：
ATCC9341藤黄微球菌（检测青霉素、氨基糖苷类）
ATCC6633枯草芽孢杆菌（检测大环内酯类）
ATCC11778蕈状芽孢杆菌（检测四环素族类）。
3.试剂和材料
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1）标准液：
a.土霉素(四环素类)：用0.1N盐酸溶解后加入适量的灭菌去离子水配制成100mg/L（ppm）母液,用PH4.5磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）。
QS-F006
作业指导书
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文件编号：QC-WI017（1）文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
拟制：
审核：
批准：
工具设备/检验器具：
均质机、离心机、平皿、克氏瓶、恒温培养箱、牛津杯、蒸汽杀菌锅、游标卡尺
一、抽样
抽样数量
批次原料鳗数量（Kg）抽样条数检体数
1——2000 3 1
2000——5000 6 2
c PH6.0磷酸缓冲液:
称取磷酸二氢钾8.0g及磷酸氢二钾2.0g用蒸馏水定容至1000ml。
d PH8.0磷酸缓冲液:
称取磷酸二氢钾0.523g及磷酸氢二钾16.73g用蒸馏水定容至1000ml。
安全预防措施：
环境控制要求：
参考标准/法规/验收准则：
日本畜水产食品中的残留抗生物质简易检查法
SN/T 1750-2006
固定，每块平板放置4-6片滤纸片，通常每份样品需做两个平板上的平行试验。每一批样品做1-2个抗生素标准对照，用灭菌镊子将对照用标准纸片放置在相对应的琼脂平板上（见下表），用加样器在每片对照标准纸片上滴加100μL灭菌蒸馏水，轻压使其固定。已加好样的平板4℃冷藏放置30分钟后，30℃培养18小时。
试验平板
ATCC6633平板
ATCC9341平板
ATCC11778平板
对应使用的对照标准抗生素纸片
卡那霉素标准纸片
红霉素标准纸片
土霉素标准纸片
5.检验结果的判定
抑菌圈直径在12mm以上者为阳性，同时确认抗生素标准对照的抑菌圈在14mm以上。抑菌圈小于12mm，大于10mm的视为可疑，必要时重新测试，或用其它方法进行确认。也可根据试验菌的第三性初步判定抗生素种类。
菌种
培养基
ATCC9341
AM5
ATCC6633
AM5
ATCC11778
AM8
注：尽可能在无菌环境中倾倒平板，打开盖放置于水平台面上冷却1-2分钟后再盖上以减少冷凝水。未用完的平板密封后置4-8℃，可保存2-3天。
4.样品检定
在制备好的检定用平板的底部作好标记，用灭菌镊子将检测用滤纸片浸入提取液，吸足提取液后，放置在制备好的琼脂平板上00μL提取液），用镊子轻压使其
审核：
批准：
PH4.5、6.0及8.0磷酸缓冲液要用时才配制，如要保存要在121℃高压杀菌15分钟后密封保存。但如有混浊或有沉淀物时不可使用。
4.试验菌的保存
用普通的细菌斜面培养基30℃培养18小时后确认试验菌在斜面全体上发育后密封冷藏（0-4℃）保存。下代移植每隔一个月至一个半月执行。
三、测定步骤
将二代保存的菌株接种于增殖用肉汤中，30℃培养18小时的培养液作为试验菌液。
c.ATCC11778蕈状芽孢杆菌
将二代保存的菌株接种于普通细菌培养基平板上，30℃培养一星期后形成芽孢。用灭菌生理盐水洗下平板上发育的菌苔，用65℃加热30分钟，再将它至于3000r/min离心20分钟后取掉上清液。让沉淀物在悬浮在灭菌生理盐水中，这就是芽孢原液。
b.卡那霉素(大环内酯类) :用灭菌去离子水配制成100 mg/L（ppm）母液，用PH8.0磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）
c.氨苄西林（氨基糖苷类）：用灭菌去离子水配制成100 mg/L（ppm）母液，用PH8.0磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）
（2）缓冲液：
a.柠檬酸、丙酮缓冲液
残留抗生物质为“阴性”
必要的记录：
预难检验记录表
原料检验记录表
成品检验记录表
人员配备：
1人
1
增加参考标准,修改必要的记录
2007.10.8
0
2003.11.13
修订次
修订内容
生效期
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文件编号：QC-WI017(1)文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
拟制：
ATCC6633
ATCC9341
ATCC11778
可检出抗生素种类
＋
或－
＋＋
＋
-
-
大环内酯类
或β－内酰胺类
＋
或－
-
-
＋＋
＋
四环素类
＋＋
或＋
-
-
+
-
氨基糖类类
注：“＋”表示有抑菌圈，“－”无抑菌圈。除上表所列的情况外，如果一个试样同时在多个平板上呈阳性，则表示可能同时含有多种抗生素残留。
1/5M柠檬酸溶液和1/2M氢氧化钾溶液等量混合溶液：丙酮：蒸馏=35：35：30比例调制。
1/5M柠檬酸溶液：称取柠檬酸4.2g用蒸馏水定容至100ml。
1/2M氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾2.8g用蒸馏水定容至100ml。
b PH4.5磷酸缓冲液:
称取磷酸二氢钾13.6g用蒸馏水定容至1000ml。
将检定用培养基冷却至50℃左右，加入最佳量的菌悬液，使其充分混合后，每个平板注入8ml作为检定用平板。所用平板需当天制备。
3.样液制备
称取10.0g肉、内脏，加入柠檬酸-丙酮缓冲液20mL均质振荡后，80℃水浴保温20分钟，3000rpm离心15分钟后取上清液作为测试用提取液。
4.样液的测定
四类抗生素（青霉素类、氨基糖苷类、四环素族类、大环内酯类）残留量的检测：在制备好的检定用平板的底部作好标记，上放牛津杯，分别滴加
5001——10000 9 3
10001——15000 12 4
15001——25000 15 5
25001——21 7
二、测定方法
1.检测原理：用含有敏感菌的琼脂作成平板，上放小管或滤纸片，在管中或纸片上滴加已知抗生素标准液和未知试样液，经培养后，抗生素标准液管或纸片周围琼脂不生长细菌，即为抑菌圈，如试管周围也出现抑菌圈表示含有抗生素。