白芨组织培养实施方案设计

白及组织培养实施方案

一、白及简介

白及为兰科白及属多年生草本植物，又名甘根、连及草、地螺丝、羊角七、皲口药、利知子、刀口药、鱼眼兰等。分布在中国、日本以及缅甸北部，主产于贵州、四川、湖南、湖北、安徽、河南、浙江、陕西等地。其味苦、甘、涩,性凉,归肺、胃、肝经。以块茎供药用，能收敛止血，消肿生肌；治肺结核咳血，支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等症。外用治外伤出血、烧烫伤、手足皲裂等症。块茎含黏液质和淀粉等，可作糊料，在生物医药、保健食品、纺织印染、特种涂料和日用化工等方面有巨大的商业利用价值。又因白及为地生兰的一种，花开艳丽，被作为庭院、居室及园林景观绿化苗木大量应用。

白及一般生于海拔110——3200m的山野、山谷较潮湿处或林下半遮阴地带，喜温暖、稍阴湿的环境，耐阴性强，忌强光直射，需排水良好、富含腐殖质的砂质土壤，稍耐寒，冬季可在地下越冬。白及能产生大量的种子(每个蒴果10～30万粒)，但这些种子没有胚乳，自然萌发率极低，繁殖困难，但白及胚的薄壁细胞贮存大量的蛋白质、油脂和碳水化合物，可作为种子萌发的营养成分，因此白及种子在保湿的情况下可以萌发，是兰科植物中种子易萌发的类型。传统的白及繁殖方法大多以分株为主，即将块茎分成小块种植，但繁殖系数低，大面积发展对种源消耗大，不宜推广且难以满足市场需求。

采用白及组织培养可在短时间内大量获取种苗，且成本相对较低，是提高白及产量的强有力措施。目前，国内研究资料报道的白及组织培养方法各异，所采用的外植体各不相同，且培养基及其中所加的植物生长调节剂种类和规格也千差万别。

二、白及组织培养技术路线

参照植物组织组织培养获得再生植株的方式，可通过4种途径获得白及再生植株：一是由愈伤组织形成不定芽再生植株；二是愈伤组织产生胚状体而再生植株；三是由侧芽或顶芽再生植株；四是由茎尖产生原球茎而再生植株。4种方式各有利弊，传统认为采用侧芽或顶芽发育途径获得的后代性状较稳定，但因为白及原球茎带有大量共生菌，组培过程中容易出现污染。

结合卢氏当地实际，探索采用白及无菌播种的技术路线，通过不同浓度和培方的培养基实现白及组织培养的最佳技术路线，建立白及快繁体系。白及组织培养完整的技术路线如下：

经过试验优化后的技术路线为：白及→种子（采集优质种源蒴果）→表面消毒→无菌播种（MS培养基等）→原球茎（分化诱导）→白及小苗（分株、扩繁）→壮苗生根（炼苗）→完整小植株→炼苗20-25天→移栽→白及

三、实验准备：

种子：白及的蒴果中有大量的种子，并且蒴果的消毒较方便，污染率低。另一方面用种子作为外植体操作较容易，并且组培过程中萌发率高，培养的幼苗生长较为迅速，因此，种子作为外植体应用比较广泛，大部分的组培研究都选用种子。本实验选取卢氏本地优质白及（Bletilla striata(Thunb．)Reichb．f．）蒴果，采收时间为8月下旬至9月中旬，此时间段胚龄大约为第8周至第22周。

器材：高压灭菌锅、超净工作台、电子分析天平（精度为千分之一）、电磁炉、接种消毒器、高效能培养架、医用小推车、日光灯、加湿器、紫外灯、晾瓶架、酸度计（或PH试纸）、试管、容量瓶、胶头滴管、试剂瓶、烧杯、试管架、量筒、玻璃漏斗、移液管、三角瓶、广口培养瓶、称量纸、毛刷、洗耳球、塑料筐、无菌脱脂棉、无菌滤纸、酒精灯、喷壶、橡胶手套、医用白大褂、紫外灯、镊子、接种针、剪刀、解剖刀、器械架、接种托盘等。

（1）通用器械

①烧杯：用来盛放、溶解化学药剂等。常用的规格有50 mL、100mL、250mL、500mL、1000mL。

②烘箱：用来烘干器械。

③恒温水浴：用来溶解琼脂等物质。

④玻璃搅拌棒：用来配制培养基。

⑤洗耳球：用来辅助吸取、转移少量液体。

⑥冰箱：用来贮存化学药剂、植物材料等。

⑦牛角勺：用来转移化学药剂。

⑧玻璃漏斗：用来过滤溶液。

⑨剪刀：用来修剪外植体或剪切嫩茎。

⑩器械架：在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。

（2）各种盛具

①搪瓷浅盘：用来承载各种器械容器。

②塑料盆：用于清洗培养容器。

③铁丝筐：用来盛放灭菌容器等物品。

④纯水水桶：用来存放去离子水或蒸馏水。常用的规格有10L、20L。

⑤塑料桶：用来存放洗涤溶液、废弃溶液。

⑥各种规格的磨砂玻璃瓶：用来盛放培养母液，以及各种植物生长物质。

（3）计量器械

①量筒：用来量取一定体积的液体。常用的规格有25mL、50mL、100mL、500mL、1000mL。

②容量瓶：用来配制标准溶液。常用的规格有50mL、100mL、500mL、1000mL。

③大肚移液管：用来吸取定量溶液。常用的规格有1mL、5mL、10mL。

④刻度移液管：用来吸取定量植物生长物质溶液。常用的规格有1mL、5mL、10mL (或可用移液器替换) 。

⑤移液管架：用来放置、固定移液管。

⑥酸度计：用来检测培养基的pH。

⑦药物天平：用来称取配制培养基的药品。

⑧分析天平：用来称取少量有化学试剂，进行化学分析。

（4）灭菌器械

①磨砂口玻璃瓶：用来对植物材料进行表面灭菌。

②酒精灯：用来进行接种器材的表面灭菌。

③细菌过滤器：用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液。

④无菌滤纸：用来汲取器材、植物材料表面的水分。

⑤无菌脱脂棉：用来进行器械、植物材料表面的灭菌处理。

⑥高压灭菌锅：对培养基、接种器材进行灭菌处理。

⑦紫外线灭菌灯：用来对接种室、培养室、操作室等工作环境进行灭菌处理。

（5）接种器械

①超净工作台：用来过滤通过接种工作台面的空气，以便进行无菌操作。

②小型喷雾器：装载灭菌药液，来给超净工作台等处喷雾灭菌。

③钝头镊子：在接种操作、继代培养时移取植物材料。

④尖头镊子：用来分离植物材料。

⑤解剖刀：用来切割植物材料。

⑥接种针：用来转移细胞团、愈伤组织。

（6）培养器械

①试管：用来作为外植体的培养容器。常用的规格有2cm×15cm、3cm×15cm。

②培养皿：用来作为外植体的培养容器。常用的规格有直径9cm、12cm。

③锥形瓶：即三角烧瓶，主要作为培养器材，常用的规格有50mL、100mL。

④铝箔：用于培养容器封口。

⑤橡皮筋：用来束紧培养容器的封口材料。

⑥空调：用来调节操作间、培养室的温度。

药剂：硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾（KNO3）、氯化钙（CaCl2）、硫酸镁（MgSO4•7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、碘化钾（KI）、硼酸（H3BO3）、硫