蛋白质的紫外吸收法

实验八蛋白质的定量测定（三）——紫外（UV）吸收测定法

目的要求

（1）了解紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。

（2）了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。

实验原理

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛使用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤，嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。

不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。

试液和器材

一、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/ml 蛋白溶液。

2.待测蛋白溶液

配制成浓度约1mg/ml的待测蛋白溶液。

二、器材

紫外分光光度计，试管和试管架，移液管。

操作方法

一、标准曲线法：

1.标准曲线的绘制

按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm 波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准

2. 样品测定

取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

注意事项

不同蛋白质酪氨酸的含量有所差异，蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性，尽管利用上述公式进行了校正，但由于不同样品中干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法的准确性稍差。