λDNA(48502 bp)的限制酶切位点图
常见限制性内切酶识别序列
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindII I、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioerHits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如Bam HI、EcoRI、HindII I、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restri ction system s typica lly contai n indivi dualrestri ction enzyme s and modifi catio n enzyme s encode d by separa te genes. The Type II restri ction enzyme s typica lly recogn ize specif ic DNA sequen ces and cleave at consta nt positi ons at or closeto that sequen ce to produc e 5-phosph atesand 3-hydrox yls. Usuall y they requir e Mg 2+ ions as a cofact or, althou gh some have more exotic requir ement s. The methyl trans feras es usuall y recogn ize the same sequen ce althou gh some are more promis cuous. Threetypesof DNA methyl trans feras es have been foundas part of Type II R-M system s formin g either C5-methyl cytos ine, N4-methyl cytos ine or N6-methyl adeni ne.酶类型识别序列ApaIType II restri ctionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restri ctionenzyme5' G^GATCC3'BglIIType II restri ctionenzyme5' A^GATCT3'EcoRIType II restri ctionenzyme5' G^AATTC3'HindII IType II restri ctionenzyme5' A^AGCTT3'KpnIType II restri ctionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restri ctionenzyme5' C^CATGG3' NdeIType II restri ctionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restri ctionenzyme5' G^CTAGC3'NotIType II restri ctionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restri ctionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restri ctionenzyme5' G^TCGAC3' SphIType II restri ctionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restri ctionenzyme5' T^CTAGA3'XhoIType II restri ctionenzyme5' C^TCGAG3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premie r5.0或Bioe dit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBA SE数据库去查（网址：http://rebas/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PC R引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buf fer的选择（MBI、罗氏、NEB、Prom eg a、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要D NA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
限制性酶酶切位点图谱ydl
FastDigest® BlpI (Bpu1102I) FastDigest® Bme1580I (BseSI) FastDigest® BmtI (BspOI) FastDigest® BplI* FastDigest® BpmI (GsuI) FastDigest® Bpu10I FastDigest® BsaAI (Ppu21I) FastDigest® BsaBI (BseJI) FastDigest® BsaHI (Hin1I) FastDigest® BsaJI (BseDI) FastDigest® BseGI FastDigest® BseNI FastDigest® BseXI FastDigest® Bsh1236I FastDigest® BsiEI (Bsh1285I) FastDigest® BsiWI (Pfl23II) FastDigest® BslI (BseLI) FastDigest® BsmBI (Esp3I)* FastDigest® BsmFI (FaqI)* FastDigest® Bsp119I FastDigest® Bsp120I FastDigest® Bsp1286I (SduI) FastDigest® Bsp1407I FastDigest® BspCNI (BseMII)* FastDigest® BspHI (PagI) FastDigest® BspMI (BveI)* FastDigest® BsrBI (MbiI) FastDigest® BsrDI (BseMI) FastDigest® BsrFI (Cfr10I) FastDigest® BssHII (PteI) FastDigest® Bsu36I (Eco81I) FastDigest® BstXI FastDigest® BstZ17I (Bst1107I) FastDigest® ClaI (Bsu15I) FastDigest® Csp6I FastDigest® DdeI (HpyF3I) FastDigest® DpnI FastDigest® DraI FastDigest DraIII (AdeI)
限制性内切酶酶切位点及保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
质粒DNA限制性酶切图谱分析
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的 DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的 数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大， 否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量， 但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散， 对于较大的DNA此现象更明显。
样品：DNA5ul、6X点样液2 ul，电极缓冲液5ul pUC118、pEGFP、 pUC118/ EcoRI 、 pEGFP/ EcoRI 、细菌基因组DNA DNA Marker (2ul，6X点样液2 ul，电极缓冲液5ul )
实验结果：分析酶切图谱
五、注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
五、注意事项——限制性内切酶酶切
２．ＤＮＡ：
作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这 些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过：
增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。
7. DNA不存在该酶识别顺序
1. 标准底物检测酶活性
2. 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3. 检查反应系统是否最佳
4. 换用对DNA甲基化不敏感的同裂 酶酶解，重新将质粒DNA转化至 dcm-，dam-基因型的细菌菌株
5. 换用不同切割非甲基化位点的同裂 酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌 株中扩增
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。
梳子干净晾干有利于梳孔的形成。
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。
3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。
二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。
瓶子。
因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。
保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。
倒胶时尽量减少气泡的产生。
可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。
梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。
不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。
用枪头赶掉气泡。
高，导致背景太深。
摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。
高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。
4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。
时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。
暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。
电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。
05 实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(λ DNA,Hind III)(考核15%)
理和适用范围有什么异同？
如果用EcoR
I酶解λ DNA，电泳后的胶
图会如何？
解释限制性核酸内切酶专一性的机理。
器材
电泳仪（DYY-2C），水平电泳槽 微量加液器（10 uL），枪头（10 离心管0.5 mL，离心管架 恒温水浴
uL）
凝胶成像仪（Gel Logic
Gold
淹没胶孔。
制样
1号样：2 uL λ DNA + 18 uL 蒸馏水 + 5 uL 加样缓冲液，混匀，取10 uL点样。 2号样：20 uL λ DNA酶切液 + 5 uL加样
缓冲液，混匀，取10 uL点样。
点样
吸取10
uL样液；
将枪头贴近样孔上沿，略微插入样孔；
（注意：枪头不要戳破胶孔底部）
212 PRO）
view溶液
10×Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，
100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇， 500 mmol/L NaCl ）
试 剂
5×TBE缓冲液：Tris[111] 54
g，硼酸
[61.83] 27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA
0.5×TBE电泳缓冲液：用5×TBE液稀释 Gold
View：每100 mL琼脂糖胶加5 uL
试 剂
加样缓冲液（5×）（Loading dye）
溴酚蓝 （300 bp） 二甲苯腈蓝 （4000 bp） 蔗糖（甘油） Tris-HCl
思考题
加样缓冲液中各个组分的作用是什么？ 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原
轻轻将样液一次连续注入样孔。
限制酶酶切位点
限制酶酶切位点限制酶酶切位点是一种常见的分子生物学技术，用于在DNA或RNA分子中特定的序列上进行切割。
酶切位点是酶识别的特定序列，一旦找到该序列，酶便会在该位置切割DNA或RNA分子。
限制酶酶切位点在基因工程和分子生物学研究中起着至关重要的作用，下面将详细介绍限制酶酶切位点的相关知识。
酶切位点是由限制酶识别的特定DNA或RNA序列决定的。
限制酶是一类能够识别并切割DNA或RNA特定序列的酶，也被称为内切酶。
限制酶通常识别的切割位点是对称的，可以是4-8个碱基对长。
常见的限制酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。
限制酶酶切位点的限制酶识别序列通常具有一定的保守性，也就是说，相同的限制酶通常会识别相似的序列。
例如，EcoRI识别的酶切位点序列为5'-GAATTC-3'，其中GAATTC为限制酶识别序列，5'和3'分别表示DNA的两个末端。
限制酶酶切位点的限制酶识别序列通常具有一定的特异性，也就是说，相同的限制酶通常只会识别特定的序列。
例如，EcoRI只会识别5'-GAATTC-3'序列，而不会识别其他序列。
限制酶酶切位点的选择对于实验的设计非常重要。
在分子生物学实验中，科研人员常常需要在特定的DNA或RNA序列上进行切割，以便进一步进行下游实验，如限制酶切割后的DNA片段的连接、测序等。
因此，选择适当的限制酶和相应的酶切位点非常关键。
限制酶酶切位点的选择需要考虑多个因素。
首先，需要考虑实验所需的切割位点是否存在于DNA或RNA序列中。
其次，需要考虑限制酶的切割效率和特异性。
一些限制酶可能对特定的序列有更高的切割效率，而对其他序列的切割效率较低。
此外，还需要考虑限制酶的切割位点的位置是否适合实验的要求。
在实际应用中，科研人员常常需要将限制酶切割后的DNA片段进行连接，以构建重组DNA分子。
在这种情况下，选择具有兼容的酶切位点的限制酶非常重要。
兼容的酶切位点是指两个限制酶切割产生的DNA片段的末端具有相同的序列。
史上最全限制性内切酶酶切位点汇总
专业资料分享A系列Aatll识别位点…G ACGT匕…一丁3：.. CJGC AG,, .5^Acc65l识别位点5…GFMK AC …3，3一. CA KMJG. . 5JAccl识别位点5…Gl\lK AC …丁3J. . CA KMJG. . 5JAcil识别位点5 …dtGC …3’ 宙…GG空…莎Acll识别位点5 …A A\；GTT .33\ .. T TG* A (X)Acul识别位点5；. CTG A AG(N). \ . . 3J 3d.. ,GACTTC(N)U A... 5J Afel识别位点5\.. AGC^CT..,3,3 …TCGJCGA..,5JAflll 识别位点5 …(fTT A AG…3，3：…G A A T T& …5"Afllll 识别位点5；.. ^CRYGT , ,3 3：…TGYRqA. . ,5Agel识别位点5P. . /fCCGGT , . .3J3；. . TGGCC^A. , .5^ Ahdl识别位点5P. G ACNN F/N NGTC... 3P 3- CTGNI^NNNCAG^.S^ Alel识别位点5；. .CACNt/NNGTG 3' 3. ..GTGNI^NNCAC, .. h Alul识别位点5 . .. A(jfcT….3P 3…TQSA-SAlwl识别位点5 r,GGATC(N)7「3"3. .. CCTAGIN)^..^AlwNl识别位点5：. CAGNNN T CTG..3F 3；. GTC^NNNG AC.. .5*Apal识别位点5 .., GGGCtft. ..3P3\., C^CCGGG .ApaLl识别位点5\.. (^TGCAC.. ,3J3 .. CACGTjGApeKl识别位点5P. . . t^CWGC., .3r3\. CGWCjp., .5^Apol识别位点5；,. FLATTY,, ,3J3 , _ Y TTA AJl. T.5"Ascl识别位点5：., GG^bGCGCC, .33 CCGCGCJ J G, .5JAsel识别位点5 . B 4A T't A A T t. , 3J3 . .. 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CTGCG<N}1(W. . 5" Hhal识别位点5 …GCdt …3" 宙…中CG…5，Hindi识别位点5：f GT Y T R AC.. .3r3\ .. CAR A YTG fHin dlll 识别位点5；. , A'A G C T T .…3" 3... TTCGA^A., .5JHi nfl识别位点5’ …GklMTC …3 3\., CT NAJG., .5* HinPII识别位点亦…dtGC…:r3 ... CGCp . . 5* Hpal识别位点5. .. GTT> AC.. .T3.., C A AJTG. _5J Hpall识别位点5“...cffeGG (3)3. GGC A C. 5JHphl识别位点51 …GGTGA (N)/.,.3, 3；.. CC AC T (N)7i,., 5" Hpy188l识别位点5 …T G “G A「3A0J CT …£Hpy188lll识别位点5.,TtfNNGA. ..3^3.,AGNN^CT. , ,5JHpy99l识别位点5；.. CGWCG T3：F i GCWGC.. ,5^HpyA V识别位点5.h CCTTC(N)J,3-3：. GGAAG(Nk ...5*%HpyCH4III识别位点h…A C N’G T …3"3 .,. T G^N C A … .5 HpyCH4IVHpyCH4Vm别位点5：. . TC?t A ,. .33■…A QG T…5」Kasl识别位点5.., G^J CGCC.,3P3r.^CCGCG^,..5J Kpnl识别位点5.,, GGT AC't... 3^3■…QCATGG …5，Mbol识专业资料分享别位点5P. .^3ATC .3^3P.. CT AG^. .5^Mboll识别位点专业资料分享5；., GA AGA (N「…3* 3；,, C T T C T (N)J A，. .5* Mfel识别位点5；.. C'X ATTG. ..3^3；T . GTT A Ajp . . 5JMlul识别位点5... /T CGCGT.,，3r3 ：.. T G C G C^A ... 5JMlyl识别位点5 …GAGTC(N, 一33\. .CTCA G (N) . 5-Mmel识别位点5； . .TCC RAC(N)M T.3' 3： . ,AG G YTG(NJ ia>. ..5*MnII识别位点5 ….CC「C (N}/ . 3 3…GGAG㈣立,5-Mscl识别位点5 , F TG(?fc：C A t,3P 3"…ACC^J GT.+J5JMsel识别位点5... f*T A A.. 3P3；T. A A TJ .. . 5^Msll识别位点5 …CAYNNV IN RYG. .,3J3 ...GTRNN^NNYAC (5)MspAII识别位点5P. . . CMCSfcKG, . .3 3•…GKYMC…扩Mspl识别位点5；F. dfcGG …3’3；. . GGqp …5’Mwol识别位点5 . . G C N N N N NVj N G C.. . 3\_ CGNN^NNN NNCG., Nael识别位点5 ... GCC\3GC,. .3r 3：…GGG&GG-.hNarl识别位点5 …GG^t GCC.. .3 3…CCGQGG …5“Ncil识别位点5 .C(7SGG,. ,3r 肚…GGS&C…・h Ncol识别位点5. ,,C T CATGG,. .3*3\ ,. G G T A CJ3 ... 5JNdel识别位点5； ., C /T T A T G ,. 3^ 3... GT A\AC…hNgoMlV识别位点5 . _ (itCGGC,. 3^ 3•…CGGCC^G. . 5Nhel识别位点5 . • T AGO . .,3"3 …GGATqp …hNlalll 识别位点亍…CATCf…3’AG…hNlalV识别位点5\,. GGt/NCC-.3 .. CCN^NGG.. .5JNmeAlll识别位点5：.. GCCGAG{N—G 3 ...CGGCTC(N)ia.^.^5rNotl识别位点5〔GdtGCCGC …;r3 ...CGCCGtyCG (5)Nrul识别位点5 . BT TCG^GA …3J3 …MCFCT …hNsil识别位点5 .ATGC^T T .. .3^ 3... I^ACGTA .. ,5JNspl识别位点5 . RCATG T Y. . 3J 3；.，X h GTACR.,.5rPacl识别位点5...TTAAf r TAA...3-3：+ , A ATJ A ATT T J+5JPaeR7l识别位点专业资料分享5；.. CG AG . ,3P. +G AGCTJC , . 5JPcil识别位点5：…A%島TGT….3*3* . . TGT A CA.. .S,APfIFl识别位点5；, .GAChiVlNGTC .…扩3 . . . C T G N N A N C A G ... 5* PflMI识别位点5； .. C C A N N N wTl T G G.. . 3^ 3；^GGTN A NNNNACC., .5^ Phol识别位点5：...GGfcC (3)3：. CCjjG.. 5JPlel识别位点5\.. GAGTC .3* 3：. CTCAG (N),,. hMiPmel识别位点5：. GTTT^AAC. . .3J3；.T C AAAJ T TG.T 5JPmll识别位点5；,, C AC^TG.. .33P.. GTGJ：AC- .5HPpuMI识别位点5 , h RdTj W c C Y ・”，3“3；_ YCC WGJ3R ., 5J PshAI识别位点5；ACNl7NNGTC . +.3J3 , . .CTGNNJNNC AG . .5'Psil识别位点5；., TT^T A A…X .. A A T A T T ... S HJLPspGl识别位点5 …1tC WGG …3“3；r,GG WCC^ ,.5PspOMI识别位点5；,. (fGGCCC.,. 33：…CCCGGJ3…5’PspXl识别位点5 V(7T CGAGB . b3J3. 8GAGC\CV.. .5*Pstl识别位点5 …CTGC 屆.33；. . G^ACGTC-. S-Pvul识别位点5 …CG ATEG …3" 3；.. GCJ AGC. . . 5JPvull识别位点5；…CAtSfcTG…富. . G T CJ3 A C ... 5^Rsal识别位点5...GT^C (3)3... 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限制性内切酶酶切位点汇总
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细菌染色体DNA的提纯与纯化
细菌染色体DNA的提纯、纯化与电泳检测摘要本实验用试剂盒 Bacterial DNA isolation kit(Omega) 提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA, 并且通过一系列的分离纯化技术将其染色体DNA与RNA、蛋白质、脂类、碳水化合物等杂质分开从而得到纯化的染色体DNA分子。
通过琼脂糖凝胶电泳的方法可以分析所提取染色DNA的量的多少，纯化结果如何，以及杂带产生的原因，从而在今后的实验中完善实验方法，严谨实验步骤。
关键词黄色粘球菌试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)琼脂糖凝胶电泳引言黄色粘球菌DK1622是一种特殊的细菌，它不含质粒DNA，只含染色体DNA，所以用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)提取的是他的染色体DNA。
此外，它还有其他特性：基因组全长9.13Mb，代时4小时，胞外基质富含粘多糖等。
生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。
真核细胞的DNA 主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。
而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合，因此，黄色粘球菌DK1622的染色体DNA是裸露的，不与任何组蛋白结合。
染色体DNA的提取一般包括：①破碎细胞；②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；③沉淀核酸；④去除盐类、有机溶剂等杂质；⑤纯化干燥；⑥溶解等几个主要步骤。
破碎细胞是为了释放DNA，其方法因样本不同而不同，可用反复冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。
蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此，在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。
一般去除蛋白质常用酚／氯仿抽提法。
酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经酚／氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。
这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的，因此也是DNA纯化中的基本方法。
限制性酶的酶切位点
各种限制性酶的酶切位点Enzyme Name SequenceAatI AGG!CCTAatII GACGT!CAccI GT!MKACAccII CG!CGAccIII T!CCGGAAcyI GR!CGYCAflI G!GWCCAflII C!TTAAGAflIII A!CRYGTAhaI CC!SGGAhaII GR!CGYCAhaIII TTT!AAAAluI AG!CT AlwI GGATCNNNN! AlwI !NNNNNGATCC AlwNI CAGNNN!CTGAocI CC!TNAGGAocII GDGCH!C AosI TGC!GCAAosII GR!CGYCApaI GGGCC!CApaLI G!TGCACApyI CC!WGGAquI C!YCGRGAseI AT!TAATAspI GAANN!NNTTCAspI G!GTACCAspI GACN!NNGTCAsuI G!GNCC AsuII TT!CGAAAvaI C!YCGRGAvaII G!GWCCAvaIII ATGCA!TAvrI !CYCGRGAvrII C!CTAGGAxyI CC!TNAGGBalI TGG!CCABamHI G!GATCCBanI G!GYRCCBanII GRGCY!CBanIII AT!CGATBbeI GGCGC!CBbiII/AcyI GR!CGYCBbvI GCAGCNNNNNNNN!BbvI !NNNNNNNNNNNNGCTGCBbvII GAAGACNN!BbvII !NNNNNNGTCTTCBcefI ACGGCNNNNNNNNNNNN!BcefI !NNNNNNNNNNNNNGCCGTBclI T!GATCABcnI CC!SGGBglI GCCNNNN!NGGCBglII A!GATCTBinI !NNNNNGATCC BinI GGATCNNNN! BsePI !GCGCGCBsmAI !GTCTCBsmAI !GAGACBsmI GAATGCN!BsmI G!CATTCBspI GDGCH!CBspHI T!CATGABspMI ACCTGCNNNN!BspMI !NNNNNNNNGCAGGTBspMII T!CCGGABsrI ACTGGN!BsrI C!CAGTBssHII G!CGCGCBstBI TT!CGAABstEII G!GTNACCBstI G!GATCCBstNI CC!WGGBstPI G!GTNACCBstUI CG!CGBstXI CCANNNNN!NTGGBstYI R!GATCYBsuI CC!TNAGGCcrI C!TCGAGCfoI GCG!CCfrI R!CCGGYCfrI G!GNCCCfrI Y!GGCCRClaI AT!CGATCviJI RG!CY CvnI CC!TNAGGDdeI C!TNAGDpnI GA!TC DraI TTT!AAADraII RG!GNCCYDraIII CACNNN!GTGDsaI C!CRYGGEaeI Y!GGCCREagI C!GGCCGEarI !CTCTTCEarI !GAAGAGEclXI C!GGCCGEcoI TAC!GTAEcoI GGTCTCN!EcoI !NNNNNGAGACCEcoI G!GWCCEcoIII AGC!GCTEcoI C!GGCCGEcoI !CTGAAGEcoI !CTTCAGEcoI CC!TNAGGEcoNI CCTNN!NNNAGGEcoOI RG!GNCCYEcoRI G!AATTCEcoRII !CCWGGEcoRV GAT!ATC EcoTI C!CWWGGEcoTI ATGCA!TEcoTI GRGCY!C EheI GGC!GCCEspI GC!TNAGCFinI !GTCCCFinI !GGGACFnuHI GC!NGCFokI GGATGNNNNNNNNN!FokI !NNNNNNNNNNNNNCATCCFspI TGC!GCAGdiII !NNNNNYGGCCGGdiII CGGCCRN!GsuI !CTCCAGGsuI !CTGGAGHaeI WGG!CCWHaeII RGCGC!YHaeIII GG!CC HapII C!CGGHgaI GACGCNNNNN!HgaI !NNNNNNNNNNGCGTCHgiAI GWGCW!CHgiEII !ACCNNNNNNGGTHhaI GCG!CHinI GR!CGYCHinPI G!CGCHincII GTY!RACHindIII A!AGCTT HinfI G!ANTCHpaI GTT!AACHpaII C!CGGHphI GGTGANNNNNNNN!HphI !NNNNNNNTCACCKpnI GGTAC!CKspI CTCTTCN!KspI !NNNNGAAGAGMaeI C!TAGMaeII A!CGTMaeIII !GTNACMboI !GATC MboII GAAGANNNNNNNN!MboII !NNNNNNNTCTTCMfeI !CAATTGMflI R!GATCYMluI A!CGCGTMmeI !TCCRACMmeI !GTYGGAMnlI CCTCNNNNNNN!MnlI !NNNNNNNGAGGMroI T!CCGGAMseI T!TAAMspI C!CGGMstI TGC!GCAMstII CC!TNAGGMvaI CC!WGGNaeI GCC!GGCNarI GG!CGCCNciI CC!SGGNcoI C!CATGGNdeI CA!TATGNdeII !GATCNheI G!CTAGCNlaIII CATG!NlaIV GGN!NCCNruI TCG!CGANsiI ATGCA!TNsp()I RCATG!YNsp()V TT!CGAANspBII CMG!CKGNspII GDGCH!CNspIII C!YCGRGNspIV G!GNCC NunII GG!CGCCPaeR C!TCGAGPalI GG!CCPflMI CCANNNN!NTGGPleI GAGTCNNNN!PleI !NNNNNGACTCPmaCI CAC!GTGPpuMI RG!GWCCYPstI CTGCA!GPvuI CGAT!CGPvuII CAG!CTGRsaI GT!ACRsrI G!AATTCSacI GAGCT!CSacII CCGC!GGSalI G!TCGACSauAI !GATCSauI G!GNCC SauI CC!TNAGGScaI AGT!ACTScrFI CC!NGGSduI GDGCH!CSecI C!CNNGGSexI !CTCGAGSfaNI GCATCNNNNN!SfaNI !NNNNNNNNNGATGCSfiI GGCCNNNN!NGGCCSinI G!GWCCSmaI CCC!GGGSnaBI TAC!GTASnaI !GTATACSpeI A!CTAGTSphI GCATG!CSplI C!GTACGSspI AAT!ATTSstI GAGCT!CSstII CCGC!GGSstIII !ACGTStuI AGG!CCTStyI C!CWWGGStySJI !GAGNNNNNNGTRCStySJI !GYACNNNNNNCTCTaqI T!CGATaqII GACCGANNNNNNNNNNN!TaqII !NNNNNNNNNTCGGTCTaqII CACCCANNNNNNNNNNN!TaqII !NNNNNNNNNTGGGTGThaI CG!CGTspI !GTSACTspEI !AATT TthI GACN!NNGTCTthII CAARCANNNNNNNNNNN!TthII !NNNNNNNNNTGYTTGTthHBI T!CGAVspI AT!TAATXbaI T!CTAGAXcyI C!CCGGGXhoI C!TCGAGXhoII R!GATCY XmaI C!CCGGGXmaIII C!GGCCGXmnI GAANN!NNTTCXorII CGAT!CG。
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(CleavageClosetotheEndofDNAFragments(oligonucleotides))为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A单位的寡260核苷酸。
取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别,5 mMDTT 反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mMTris-HCl(pH7.6),10 mMMgCl2及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。
其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列。
限制性内切酶酶切位点及保护碱基（DOC）
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
DNA的限制性酶切实验原理
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
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Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其 杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的 强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽 中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避 免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出 现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
限制性内切酶酶切位点方便搜索（word版本）
限制性内切酶酶切位点方便搜索（word版本）AatII 识别位点GACGTCCTGCAGAcc65I 识别位点GTMKACCAKMTGAccI 识别位点GTMKACCAKMTGAciI 识别位点CCGCGGCGAclI 识别位点AACGTTTTGCAAAcuI 识别位点CTGAAGAfeI 识别位点AGCGCTTCGCGAAflII 识别位点CTTAAGGAATTCAflIII 识别位点ACRYGTTGYRCAAgeI 识别位点ACCGGT TGGCCAAhdI 识别位点GACNNNNNGTC CTGNNNNNCAG AleI 识别位点CACNNNNGTG GTGNNNNCAC AluI 识别位点AGCTTCGAAlwI 识别位点CCTAG AlwNI 识别位点CAGNNNCTG GTCNNNGAC ApaI 识别位点GGGCCC CCCGGG ApaLI 识别位点GTGCAC CACGTG ApeKI 识别位点GCWGC CGWCGApoI 识别位点RAATTYYTTAARAscI 识别位点GGCGCGCCCCGCGCGGAseI 识别位点ATTAATTAATTAAsiSI 识别位点GCGATCGCCGCTAGCGAvaI 识别位点CYCGRGGRGCYCAvaII 识别位点GGWCCCCWGGAvrII 识别位点CCTAGGGGATCCBaeI 识别位点NACNGTAYCNBamHI 识别位点GGATCC CCTAGGBanI 识别位点GGYRCC CCRYGGBanII 识别位点GRGCYC CYCGRGBbsI 识别位点GAAGAC CTTCTGBbvCI 识别位点CCTCAGC GGAGTCGBbvI 识别位点GCAGCCGTCGBccI 识别位点 CCATC GGTAGBceAI 识别位点ACGGCTGCCGBcgI 识别位点CGANTGN GCTNACGBciVI 识别位点GTATCCCATAGGBclI 识别位点TGATCAACTACTBfaI 识别位点CTAGGATCBfuAI 识别位点ACCTGC TGGACGBglI 识别位点GCCNNNNNGGC CGGNNNNNCCGBglII 识别位点AGATCT TCTAGABlpI 识别位点GCTNAGC CGANTCGBme1580I 识别位点GKGCMCCMCGKGCACGTC 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λDNA的限制酶切位点图
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DNA的碱基数与分子量的换算
DNA的碱基数与分子量的换算DNA碱基对（钠盐）的平均分子量 = 650 道尔顿A260 unit ds DNA = 50 μg/ml = 0.15 mM (in nucleotides)A260 unit ss DNA = 33 μg/ml = 0.10 mM (in nucleotides)A260 unit ss RNA = 40 μg/ml = 0.11 mM (in nucleotides)双链DNA分子的分子量(道尔顿) = 碱基对目×650双链DNA分子的末端摩尔数= 2 ×DNA质量（克）/ DNA分子量（道尔顿）限制性内切酶酶切后的DNA末端摩尔数：环状DNA分子： 2 × DNA摩尔数× 位点数线性DNA分子： 2 × DNA摩尔数×位点数+ 2 × DNA摩尔数1 μg 1000 bp DNA = 1.52 pmol = 9.1 × 1011 molecules1 μg pUC18/19 DNA (2686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 × 1011 molecules1 μg pBR322 DNA (4361 bp) = 0.35 pmol = 2.1 × 1011 molecules1 μg M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 0.21 pmol = 1.3 × 1011 molecules1 μg λDNA (48502 bp) = 0.03 pmol = 1.8 ×1010 molecules1 pmol 1000 bp DNA = 0.66 μg1 pmol pUC18/19 DNA (2686 bp) = 1.77 μg1 pmol pBR322 DNA (4361 bp) = 2.88 μg1 pmol M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 4.78 μg1 pmol λDNA (48502 bp) = 32.01 μgkb DNA = 333个氨基酸的编码量≈ 37,000 道尔顿蛋白质10,000道尔顿蛋白质≈270 bp DNA50,000道尔顿蛋白质≈ 1.35 kb DNADNA的碱基数与分子量的换算DNA碱基对（钠盐）的平均分子量 = 650 道尔顿A260 unit ds DNA = 50 μg/ml = 0.15 mM (in nucleotides)A260 unit ss DNA = 33 μg/ml = 0.10 mM (in nucleotides)A260 unit ss RNA = 40 μg/ml = 0.11 mM (in nucleotides)双链DNA分子的分子量(道尔顿) = 碱基对目×650双链DNA分子的末端摩尔数= 2 ×DNA质量（克）/ DNA分子量（道尔顿）限制性内切酶酶切后的DNA末端摩尔数：环状DNA分子： 2 × DNA摩尔数× 位点数线性DNA分子： 2 × DNA摩尔数×位点数+ 2 × DNA摩尔数1 μg 1000 bp DNA = 1.52 pmol = 9.1 × 1011 molecules1 μg pUC18/19 DNA (2686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 × 1011 molecules 1 μg pBR322 DNA (4361 bp) = 0.35 pmol = 2.1 × 1011 molecules1 μg M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 0.21 pmol = 1.3 × 1011 molecules 1 μg λDNA (48502 bp) = 0.03 pmol = 1.8 ×1010 molecules1 pmol 1000 bp DNA = 0.66 μg1 pmol pUC18/19 DNA (2686 bp) = 1.77 μg1 pmol pBR322 DNA (4361 bp) = 2.88 μg1 pmol M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 4.78 μg1 pmol λDNA (48502 bp) = 32.01 μgkb DNA = 333个氨基酸的编码量≈ 37,000 道尔顿蛋白质10,000道尔顿蛋白质≈270 bp DNA50,000道尔顿蛋白质≈ 1.35 kb DNADNA的碱基数与分子量的换算DNA碱基对（钠盐）的平均分子量 = 650 道尔顿A260 unit ds DNA = 50 μg/ml = 0.15 mM (in nucleotides)A260 unit ss DNA = 33 μg/ml = 0.10 mM (in nucleotides)A260 unit ss RNA = 40 μg/ml = 0.11 mM (in nucleotides)双链DNA分子的分子量(道尔顿) = 碱基对目×650双链DNA分子的末端摩尔数= 2 ×DNA质量（克）/ DNA分子量（道尔顿）限制性内切酶酶切后的DNA末端摩尔数：环状DNA分子： 2 × DNA摩尔数× 位点数线性DNA分子： 2 × DNA摩尔数×位点数+ 2 × DNA摩尔数1 μg 1000 bp DNA = 1.52 pmol = 9.1 × 1011 molecules1 μg pUC18/19 DNA (2686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 × 1011 molecules1 μg pBR322 DNA (4361 bp) = 0.35 pmol = 2.1 × 1011 molecules1 μg M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 0.21 pmol = 1.3 × 1011 molecules1 μg λDNA (48502 bp) = 0.03 pmol = 1.8 ×1010 molecules1 pmol 1000 bp DNA = 0.66 μg1 pmol pUC18/19 DNA (2686 bp) = 1.77 μg1 pmol pBR322 DNA (4361 bp) = 2.88 μg1 pmol M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 4.78 μg1 pmol λDNA (48502 bp) = 32.01 μgkb DNA = 333个氨基酸的编码量≈ 37,000 道尔顿蛋白质10,000道尔顿蛋白质≈270 bp DNA50,000道尔顿蛋白质≈ 1.35 kb DNADNA的碱基数与分子量的换算DNA碱基对（钠盐）的平均分子量 = 650 道尔顿A260 unit ds DNA = 50 μg/ml = 0.15 mM (in nucleotides)A260 unit ss DNA = 33 μg/ml = 0.10 mM (in nucleotides)A260 unit ss RNA = 40 μg/ml = 0.11 mM (in nucleotides)双链DNA分子的分子量(道尔顿) = 碱基对目×650双链DNA分子的末端摩尔数= 2 ×DNA质量（克）/ DNA分子量（道尔顿）限制性内切酶酶切后的DNA末端摩尔数：环状DNA分子： 2 × DNA摩尔数× 位点数线性DNA分子： 2 × DNA摩尔数×位点数+ 2 × DNA摩尔数1 μg 1000 bp DNA = 1.52 pmol = 9.1 × 1011 molecu les1 μg pUC18/19 DNA (2686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 × 1011 molecules1 μg pBR322 DNA (4361 bp) = 0.35 pmol = 2.1 × 1011 molecules1 μg M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 0.21 pmol = 1.3 × 1011 molecules 1 μg λDNA (48502 bp) = 0.03 pmol = 1.8 ×1010 molecules1 pmol 1000 bp DNA = 0.66 μg1 pmol pUC18/19 DNA (2686 bp) = 1.77 μg1 pmol pBR322 DNA (4361 bp) = 2.88 μg1 pmol M13mp18/19 DNA (7249 bp) = 4.78 μg1 pmol λDNA (48502 bp) = 32.01 μgkb DNA = 333个氨基酸的编码量≈ 37,000 道尔顿蛋白质10,000道尔顿蛋白质≈270 bp DNA50,000道尔顿蛋白质≈ 1.35 kb DNA。