受体配体简
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第八节 受体的放射性配体结合分析 （radioligand binding assay of receptors, RBA）
岳 凌
Biblioteka Baidu
一、总 论
受体（receptor，R） 受体
细胞膜上或细胞内能识别生物活性物质并与 之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。 之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。
2
11
2. 饱和曲线 饱和曲线(saturation curve)
1）饱和曲线 ）
当配体的浓度从零开始上升时， 当配体的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐 增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此[RL]的 增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此 的 增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线， 增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后 绝大部分受体与配体结合时， 的增加就非常缓慢， 绝大部分受体与配体结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐 的增加就非常缓慢 趋水平，即受体已经饱和了， 趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线 。
25
单点法实验只适用于简单单位点系统， 单点法实验只适用于简单单位点系统，其计算公式 如下： 如下：
[RT] =
_____________RL的cpm______________ 探测效率（％）×配体比活度×标本的蛋白量（DNA量）或细胞数
26
2. 简单单位点 简单单位点RBA的多点法实验 的多点法实验
20
的数据处理时， 在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性 的数据处理时 (total binding，TB)，必须减去 ， ，必须减去NSB，才能得到特 ， 异性结合(specific binding，SB)的数据。 异性结合 ， 的数据。 的数据
21
四、RBA的基本方法 的基本方法
离体RBA的基本方法可概述如下： 的基本方法可概述如下： 离体 的基本方法可概述如下 1. 制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、细胞 制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、 组分的分离制备等） 组分的分离制备等） 2. 加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等） 加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等） 3. 温育 4. 分离结合和游离的放射性标记配体 5. 测定结合部分的放射性 6. 数据处理
12
2）设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的 ） 为配体的初始浓度， 为配体的初始浓度 为受体的
初始浓度，则有： 初始浓度，则有： [L] = [LT] – [RL] [R] = [RT] – [RL] 将上式代入(1.1)式，经整理得： 式 经整理得 将上式代入 [RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0
22
标记配体的基本要求
1）高比活度 ） 2）亲和力高 ） 3）特异性强 ） 4）放射化学纯度高 ）
23
五、定量RBA的数据处理 定量 的数据处理
定量RBA主要是通过已知标记配体的量 主要是通过已知标记配体的量 定量 和比活度，以及测得的样本的数据， 和比活度，以及测得的样本的数据，应 用数学模型求出受体的有关参数如受体 密度[RT]、KD等。 密度 、 等
17
简单单位点系统RBA的Scatchard作图 图3 简单单位点系统 的 作图
18
（二）非特异性结合 (non-specific binding，NSB)
NSB
系统中， 在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还 系统中 放射性配体除与受体特异性结合外， 可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等） 可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等） 结合。 结合。
8
受体与配体特异性结合的特点： 受体与配体特异性结合的特点：
亲和力高，结合容量小。 亲和力高，结合容量小。
亲和力：受体与配体的结合能力。 亲和力：受体与配体的结合能力。 平衡解离常数（ 平衡解离常数（equilibrium dissociation constant，KD） ， ）
指占据半数受体所需的配体浓度。 指占据半数受体所需的配体浓度。 KD值愈小，表明亲和力愈高；KD值愈大，亲和力愈低。 值愈小，表明亲和力愈高； 值愈大 亲和力愈低。 值愈大， 值愈小
29
2. 计算机曲线拟合
饱和曲线的直接表达式为： 饱和曲线的直接表达式为： [RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0 其中， 是自变量（ ），[RL]是因变量（纵坐标）， 是因变量（ 其中，[LT]是自变量（横坐标）， 是自变量 横坐标）， 是因变量 纵坐标）， [RT]和KD是固定值。应用计算机以最小二乘法或稳健回归 是固定值。 和 是固定值 法进行曲线拟合，可以得到[RT]和KD的值。 的值。 法进行曲线拟合，可以得到 和 的值
35
复习题
1. 受体和配体结合的特点 2. RBA的概念、原理 的概念、 的概念
36
参考文献
在线资料： 在线资料 http://www.gzhmc.edu.cn/IMAGE/PPT/addhyx/g.ppt
37
NSB的特点 的特点
亲和力小而结合容量大，不易被饱和， 亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配 体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（ 体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见 图4）。 ）。
19
饱和曲线实验中TB、 和 图4 饱和曲线实验中 、SB和NSB的关系 的关系
由式（ ）整理可得： 由式（1.1）整理可得 KD ＝ [RT-RL][L] [RL] 将上式整理可得： 将上式整理可得 [RL] = [RT] － 1_ × [RL] [L] KD KD
16
以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游 为横坐标， 以复合物浓度 为横坐标 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为 为纵坐标作图， 离配体的浓度比值 为纵坐标作图 Scatchard作图。 作图。 作图 简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜 作图为一条直线， 简单单位点系统 作图为一条直线 ），横轴截距为 率为 -（1/KD），横轴截距为 （ ），横轴截距为[RT]，纵轴截距为 ，纵轴截距为[RT]/ KD（见图 ）。 （见图3）。
4
RBA的分类 的分类
定量RBA 定量 可以测定靶组织或靶细胞中能与配体结合的受体 以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（ 数（以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（常 以平衡解离常数表示）。 以平衡解离常数表示）。 定性RBA 定性 发现和确定新的受体和受体亚型， 发现和确定新的受体和受体亚型，及在分子水平研 究受体-配体的相互作用等 配体的相互作用等。 究受体 配体的相互作用等。
24
1. 单点法实验的数据处理
通常是计算饱和区的受体密度， 通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量 （maximum binding capacity，Rmax）。 ， ）。 受体密度的表示方式有以下几种： 受体密度的表示方式有以下几种： 胞浆胞膜等的受体含量： 蛋白； ① 胞浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白； 蛋白 胞核的受体含量： ② 胞核的受体含量：fmol/mgDNA； ； 完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或 ③ 完整细胞受体的含量：结合位点 （ ） fmol/106细胞。 细胞。
多点法实验可分为简单单位点和双位点(多位点 多点法实验可分为简单单位点和双位点 多位点) 多位点 两方面， 两方面，它们又可各自分为饱和曲线实验和竞争 结合实验两类。 结合实验两类。
27
简单单位点饱和曲线的数据处理
1. Scatchard模型 模型 以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游 为横坐标， 以复合物浓度 为横坐标 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图 为纵坐标作图， 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，实际应 用时， 的浓度比值由放射性的比值B/F代 用时，[RL]/[L]的浓度比值由放射性的比值 的浓度比值由放射性的比值 代 表。
9
三、单位点系统RBA的基本规律 单位点系统 的基本规律
（一）简单单位点系统受体和配体结合反应的基本规律 1. 质量作用定律 k1,v1 [R] + [L] k2,v2 根据质量作用定律： 根据质量作用定律 v1 = k1 [R] [L] v2 = k2 [RL]
10
[RL]
当反应达到平衡后， 当反应达到平衡后， v1 = v2 即： k1 [R][L] = k2 [RL] KD＝ k2 ＝ [R][L] k1 [RL] 则平衡解离常数（ ）的数学表达式（ ） 则平衡解离常数（KD）的数学表达式（1.1）为：
5
RBA的应用 的应用
神经递质 激素和药物等的作用机制 疾病的病因和发病机制 新药设计和药物筛选 受体显像与受体介导治疗
6
二、概 述
1. 受体的分类 类(class) 膜受体 核受体 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype)
7
2. 受体与配体结合的基本特点
1）可饱和性(saturability) ）可饱和性 2）特异性(specificity) ）特异性 3）适度的亲和力（affinity） ）适度的亲和力（ ） 4）可逆性(reversibility) ）可逆性 5）识别能力(recognition)和生物效应的一致性 ）识别能力 和生物效应的一致性
28
具体公式如下： 具体公式如下 ： [RL] = B = [RT] － 1_ × [RL] [L] F KD KD 作图应为一条直线， 以B/F对[RL]作图应为一条直线，斜率为 对 作图应为一条直线 斜率为-(1/KD)， ， 直线与横轴的交点为[RT]值，与纵轴交点为 直线与横轴的交点为 值 [RT]/KD。 。
配体（ligand，L） 配体
能与受体特异性结合的生物活性分子。 能与受体特异性结合的生物活性分子。 配体 内源性配体 外源性配体
3
RBA
原理是基于放射性核素标记的配体与特异受体的理化结 合反应。 合反应。 应用放射性标记配体和组织、 应用放射性标记配体和组织、细胞或含有受体的制剂一 起温育，使受体和配体充分结合，形成受体-配体复合物 配体复合物， 起温育，使受体和配体充分结合，形成受体 配体复合物， 终止反应后， 终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记 测定受体-配体复合物的放射性 经过数据处理， 配体复合物的放射性， 物，测定受体 配体复合物的放射性，经过数据处理，可 求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。 求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。
13
饱和曲线的形状和KD有关（如图1） 饱和曲线的形状和 有关（如图 ）。 有关
图1 KD对饱和曲线的影响 对饱和曲线的影响
14
饱和曲线曲线的高度取决于[RT]（如图2）。 （如图 ）。 饱和曲线曲线的高度取决于
图2 [RT]对饱和曲线影响 对饱和曲线影响
15
3. Scatchard作图 作图
30
应 用
1. 放射受体显像： 放射受体显像： 放射性配体与靶细胞上受体结合，显像。 放射性配体与靶细胞上受体结合，显像。
31
32
33
34
2. 受体介导的靶向治疗 放射性配体注入体内， 放射性配体注入体内，到相应受体高密度的 靶器官，形成放射性配体-受体复合物 受体复合物， 靶器官，形成放射性配体 受体复合物，经受 体介导作用将放射性复合物导入细胞， 体介导作用将放射性复合物导入细胞，发挥 射线的辐射生物效应，以及利用配体-受体的 射线的辐射生物效应，以及利用配体 受体的 载体作用，载上药物，进行靶向治疗。 载体作用，载上药物，进行靶向治疗。
岳 凌
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一、总 论
受体（receptor，R） 受体
细胞膜上或细胞内能识别生物活性物质并与 之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。 之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。
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2. 饱和曲线 饱和曲线(saturation curve)
1）饱和曲线 ）
当配体的浓度从零开始上升时， 当配体的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐 增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此[RL]的 增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此 的 增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线， 增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后 绝大部分受体与配体结合时， 的增加就非常缓慢， 绝大部分受体与配体结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐 的增加就非常缓慢 趋水平，即受体已经饱和了， 趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线 。
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单点法实验只适用于简单单位点系统， 单点法实验只适用于简单单位点系统，其计算公式 如下： 如下：
[RT] =
_____________RL的cpm______________ 探测效率（％）×配体比活度×标本的蛋白量（DNA量）或细胞数
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2. 简单单位点 简单单位点RBA的多点法实验 的多点法实验
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的数据处理时， 在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性 的数据处理时 (total binding，TB)，必须减去 ， ，必须减去NSB，才能得到特 ， 异性结合(specific binding，SB)的数据。 异性结合 ， 的数据。 的数据
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四、RBA的基本方法 的基本方法
离体RBA的基本方法可概述如下： 的基本方法可概述如下： 离体 的基本方法可概述如下 1. 制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、细胞 制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、 组分的分离制备等） 组分的分离制备等） 2. 加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等） 加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等） 3. 温育 4. 分离结合和游离的放射性标记配体 5. 测定结合部分的放射性 6. 数据处理
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2）设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的 ） 为配体的初始浓度， 为配体的初始浓度 为受体的
初始浓度，则有： 初始浓度，则有： [L] = [LT] – [RL] [R] = [RT] – [RL] 将上式代入(1.1)式，经整理得： 式 经整理得 将上式代入 [RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0
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标记配体的基本要求
1）高比活度 ） 2）亲和力高 ） 3）特异性强 ） 4）放射化学纯度高 ）
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五、定量RBA的数据处理 定量 的数据处理
定量RBA主要是通过已知标记配体的量 主要是通过已知标记配体的量 定量 和比活度，以及测得的样本的数据， 和比活度，以及测得的样本的数据，应 用数学模型求出受体的有关参数如受体 密度[RT]、KD等。 密度 、 等
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简单单位点系统RBA的Scatchard作图 图3 简单单位点系统 的 作图
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（二）非特异性结合 (non-specific binding，NSB)
NSB
系统中， 在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还 系统中 放射性配体除与受体特异性结合外， 可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等） 可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等） 结合。 结合。
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受体与配体特异性结合的特点： 受体与配体特异性结合的特点：
亲和力高，结合容量小。 亲和力高，结合容量小。
亲和力：受体与配体的结合能力。 亲和力：受体与配体的结合能力。 平衡解离常数（ 平衡解离常数（equilibrium dissociation constant，KD） ， ）
指占据半数受体所需的配体浓度。 指占据半数受体所需的配体浓度。 KD值愈小，表明亲和力愈高；KD值愈大，亲和力愈低。 值愈小，表明亲和力愈高； 值愈大 亲和力愈低。 值愈大， 值愈小
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2. 计算机曲线拟合
饱和曲线的直接表达式为： 饱和曲线的直接表达式为： [RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0 其中， 是自变量（ ），[RL]是因变量（纵坐标）， 是因变量（ 其中，[LT]是自变量（横坐标）， 是自变量 横坐标）， 是因变量 纵坐标）， [RT]和KD是固定值。应用计算机以最小二乘法或稳健回归 是固定值。 和 是固定值 法进行曲线拟合，可以得到[RT]和KD的值。 的值。 法进行曲线拟合，可以得到 和 的值
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复习题
1. 受体和配体结合的特点 2. RBA的概念、原理 的概念、 的概念
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参考文献
在线资料： 在线资料 http://www.gzhmc.edu.cn/IMAGE/PPT/addhyx/g.ppt
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NSB的特点 的特点
亲和力小而结合容量大，不易被饱和， 亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配 体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（ 体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见 图4）。 ）。
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饱和曲线实验中TB、 和 图4 饱和曲线实验中 、SB和NSB的关系 的关系
由式（ ）整理可得： 由式（1.1）整理可得 KD ＝ [RT-RL][L] [RL] 将上式整理可得： 将上式整理可得 [RL] = [RT] － 1_ × [RL] [L] KD KD
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以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游 为横坐标， 以复合物浓度 为横坐标 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为 为纵坐标作图， 离配体的浓度比值 为纵坐标作图 Scatchard作图。 作图。 作图 简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜 作图为一条直线， 简单单位点系统 作图为一条直线 ），横轴截距为 率为 -（1/KD），横轴截距为 （ ），横轴截距为[RT]，纵轴截距为 ，纵轴截距为[RT]/ KD（见图 ）。 （见图3）。
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RBA的分类 的分类
定量RBA 定量 可以测定靶组织或靶细胞中能与配体结合的受体 以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（ 数（以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（常 以平衡解离常数表示）。 以平衡解离常数表示）。 定性RBA 定性 发现和确定新的受体和受体亚型， 发现和确定新的受体和受体亚型，及在分子水平研 究受体-配体的相互作用等 配体的相互作用等。 究受体 配体的相互作用等。
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1. 单点法实验的数据处理
通常是计算饱和区的受体密度， 通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量 （maximum binding capacity，Rmax）。 ， ）。 受体密度的表示方式有以下几种： 受体密度的表示方式有以下几种： 胞浆胞膜等的受体含量： 蛋白； ① 胞浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白； 蛋白 胞核的受体含量： ② 胞核的受体含量：fmol/mgDNA； ； 完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或 ③ 完整细胞受体的含量：结合位点 （ ） fmol/106细胞。 细胞。
多点法实验可分为简单单位点和双位点(多位点 多点法实验可分为简单单位点和双位点 多位点) 多位点 两方面， 两方面，它们又可各自分为饱和曲线实验和竞争 结合实验两类。 结合实验两类。
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简单单位点饱和曲线的数据处理
1. Scatchard模型 模型 以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游 为横坐标， 以复合物浓度 为横坐标 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图 为纵坐标作图， 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，实际应 用时， 的浓度比值由放射性的比值B/F代 用时，[RL]/[L]的浓度比值由放射性的比值 的浓度比值由放射性的比值 代 表。
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三、单位点系统RBA的基本规律 单位点系统 的基本规律
（一）简单单位点系统受体和配体结合反应的基本规律 1. 质量作用定律 k1,v1 [R] + [L] k2,v2 根据质量作用定律： 根据质量作用定律 v1 = k1 [R] [L] v2 = k2 [RL]
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[RL]
当反应达到平衡后， 当反应达到平衡后， v1 = v2 即： k1 [R][L] = k2 [RL] KD＝ k2 ＝ [R][L] k1 [RL] 则平衡解离常数（ ）的数学表达式（ ） 则平衡解离常数（KD）的数学表达式（1.1）为：
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RBA的应用 的应用
神经递质 激素和药物等的作用机制 疾病的病因和发病机制 新药设计和药物筛选 受体显像与受体介导治疗
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二、概 述
1. 受体的分类 类(class) 膜受体 核受体 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype)
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2. 受体与配体结合的基本特点
1）可饱和性(saturability) ）可饱和性 2）特异性(specificity) ）特异性 3）适度的亲和力（affinity） ）适度的亲和力（ ） 4）可逆性(reversibility) ）可逆性 5）识别能力(recognition)和生物效应的一致性 ）识别能力 和生物效应的一致性
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具体公式如下： 具体公式如下 ： [RL] = B = [RT] － 1_ × [RL] [L] F KD KD 作图应为一条直线， 以B/F对[RL]作图应为一条直线，斜率为 对 作图应为一条直线 斜率为-(1/KD)， ， 直线与横轴的交点为[RT]值，与纵轴交点为 直线与横轴的交点为 值 [RT]/KD。 。
配体（ligand，L） 配体
能与受体特异性结合的生物活性分子。 能与受体特异性结合的生物活性分子。 配体 内源性配体 外源性配体
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RBA
原理是基于放射性核素标记的配体与特异受体的理化结 合反应。 合反应。 应用放射性标记配体和组织、 应用放射性标记配体和组织、细胞或含有受体的制剂一 起温育，使受体和配体充分结合，形成受体-配体复合物 配体复合物， 起温育，使受体和配体充分结合，形成受体 配体复合物， 终止反应后， 终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记 测定受体-配体复合物的放射性 经过数据处理， 配体复合物的放射性， 物，测定受体 配体复合物的放射性，经过数据处理，可 求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。 求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。
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饱和曲线的形状和KD有关（如图1） 饱和曲线的形状和 有关（如图 ）。 有关
图1 KD对饱和曲线的影响 对饱和曲线的影响
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饱和曲线曲线的高度取决于[RT]（如图2）。 （如图 ）。 饱和曲线曲线的高度取决于
图2 [RT]对饱和曲线影响 对饱和曲线影响
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3. Scatchard作图 作图
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应 用
1. 放射受体显像： 放射受体显像： 放射性配体与靶细胞上受体结合，显像。 放射性配体与靶细胞上受体结合，显像。
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2. 受体介导的靶向治疗 放射性配体注入体内， 放射性配体注入体内，到相应受体高密度的 靶器官，形成放射性配体-受体复合物 受体复合物， 靶器官，形成放射性配体 受体复合物，经受 体介导作用将放射性复合物导入细胞， 体介导作用将放射性复合物导入细胞，发挥 射线的辐射生物效应，以及利用配体-受体的 射线的辐射生物效应，以及利用配体 受体的 载体作用，载上药物，进行靶向治疗。 载体作用，载上药物，进行靶向治疗。