高中生物 线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察 【实验目的】 掌握一 ...
线粒体和液泡系的超活染色与观察(“观察”文档)共7张
(燥2)，实必验要者时用(可2牙再)签加用宽滴头双染在液自面)，己刀盖口上腔片盖颊玻把粘片膜初，处用稍生吸用的水力纸刮小吸取去麦上四皮或周细溢胞黄出，豆的将染刮幼液下，的苗置粘根显液微状尖镜物下(放约观入察1载。~玻2片c的m染液长滴)中小，染心色切10~一l5m纵in(注切意面不可，使染液干 (器3)材吸：去显染微液镜，、滴恒放一温滴入水R浴i载n锅ge、玻r液剪，片刀盖、中上镊盖内子玻、片的双，面1并刀/用片3镊、0子载0轻玻0轻片中地、下性盖压玻红盖片玻染、片表，液面使皿滴根、尖中吸压管，扁、，牙染利签于色、观吸5察水~。纸1。0min。 观 人察口动腔、 粘植 膜(物 上3活 皮) 细 细吸胞 胞去内 线线粒染粒 体体 的液、 超，液 活泡 染滴系 色的 与一形 观滴态 察、R数in量g与e分r布液；，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻 观(2)察实动验、者植用物牙活签细片宽胞头，内在线使自粒己体根口、腔尖液颊泡压粘系膜扁的处形稍，态用、利力数刮于量取与观上分皮察布细；胞。，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10~l5min(注意不可使染液干 燥(2)，用必双要面时刀(可4片再)把加进初滴生行染的液镜小)，麦检盖或。上黄盖豆玻幼片苗，根用尖吸(约水1纸~2吸cm去长四)小周心溢切出一的纵染切液面，，置放显入微载镜玻下片观中察内。的1/3000中性红染液滴中，染色5~10min。
观察动、植物活细置胞显内线微粒体镜、下液泡观系察的形。态、数量与分布；
线粒体和液泡系的超活染色与观察
人人口口腔 腔粘粘膜膜(上上3皮皮) 细细在胞胞低线线倍粒粒体体镜的的下超超活活，染染选色色与与择观观平察察展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。
线粒体的活体染色
实验四线粒体的活体染色实验目的：1.掌握线粒体的活体染色原理及方法。
2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞法处死兔子的方法。
3.了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。
实验原理：线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。
细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
不同细胞中线粒体的形态和数目不同。
在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。
线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。
一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。
脊的横切面呈囊状或管状。
脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。
实验用品：一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。
二、器材和仪器普通光学显微镜、手术器材一套、解剖盘、腊盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、20ml注射器、吸管。
三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、0.9%Ringer氏液(哺乳类用)。
实验内容和方法：一、兔肝细胞线粒体的活体染色（一）方法1.用空气栓塞法处死兔子（见图4-1），置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（约2～3mm3大小）。
2.放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，再用吸管吸去Ringer 氏液。
3.在平皿内滴加1／300詹纳斯绿B（Janus green B）染液，，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。
当组织块边缘染成蓝色时即可，一般需要染色30分钟。
mitochondria
微粒体 游离核糖体 多核糖体 细胞质
内含物 异体吞噬泡 自体吞噬泡 分泌自噬泡
细胞氧化 质子动力势 氧化磷酸化 基粒
电子传递链（呼吸链）
1.何谓内膜，内膜的存在对细胞有什么意义？ 2.内质网和高尔基体都可对蛋白质进行加工，试
比较两者所进行的加工有何不同？ 3.细胞质中有哪些有形成分？ 4.核糖体在蛋白质的合成过程中起到了哪些作
（化学梯度、膜电位）
质子动力势的作用
电子传递链
化学渗透偶联磷酸化作用 return
ATP合成
结合－改变机制 （binding-change mechanism）
三种构象的循环改变；O(open) L(low) T(tight)
氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）
第七节 线粒体
（mitochondrion）
线粒体是真核细胞进行氧化和能量转 换的主要场所，被喻为细胞的“动力工 厂”或“换能中心”。
一、线粒体的形态特性
显微结构：线状，颗粒状
亚显微结构：两层单位膜构成 的膜囊结构
（一）、外膜(porin,孔蛋白) 外腔（膜间腔）
（二）、内膜 （通透性很低，多种转运蛋白） 嵴（cristae） 基粒（elementary particle）
氧化过程
物质氧化 高能电子 氧 energy
质子动力势
energy
ADP+Pi
ATP
磷酸化过程
将生物氧化所释放能量的转移过 程与ADP的磷酸化过程结合起来， 而将生物氧化释放的能量转移到 ATP的高能磷酸键中，又称氧化磷 酸化偶联。
2e-
1/2O2
H2O
to
glucose
（二）线粒体与细胞凋亡(apoptosis)
线粒体遗传病
2、线粒体脑肌病
3、线粒体心肌病
4、帕金森病
5、其他病变
线粒体疾病的遗传规律和特点
1、母系遗传（maternal inheritance）
2、阈值效应（threshold effects）
突变型DNA达到一定数量（阈值）才足以引起 细胞的功能障碍，这种现象称为阈值效应。
3、表型的高度多态（polymorphism）
在一个家系中，患病个体的表现可以完全不 同；有的以血管病变为主，如中风、冠心病等； 有的表现为不同程度的肌无力；有的以精神症状 为主；有的以眼科疾病为突出表现。发病的年龄 差异也很大。
小
结
一、掌握线粒体遗传病的概念和特点 二、了解线粒体基因组的特点
三、了解线粒体病遗传规律
线粒体遗传病
（mitochondrial diseases）
线粒体电镜图
mtDNA
第一节 人类线粒体基因组
• 含义：
线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）是独立于细胞核染色体外的又一 基因组，称为25号染色体。非孟德尔遗 传方式。
特点
1、裸露环形双链，H链和L链 2、分为编码区和非编码区，无内含子，基因之间间 隔极短或无间隔。 3、非孟德尔遗传，又称核外遗传 4、分子量小，进化速度快，细胞中含量丰富。
5、半自主性。（M染色体，25号染色体）
mtDNA能独立复制、转录和翻译。但受核DNA影 响（线粒体内大部分功能和结构蛋白依赖于核 DNA）。 6、两条链都有编码功能，部分遗传密码与核不同
7、突变率极高（比核基因大10-20 线粒体病
• 定义：
指由于mtDNA的突变所导致的遗传病。
• 分类
一、生化分类：底物转运缺陷、底物利用缺陷、 Krebs循环缺陷、电子传到缺陷和氧化磷酸化偶联 缺陷5种类型 二、遗传分类：nDNA缺陷、mtDNA缺陷、nDNA和mtDNA 联合缺陷
实验三 线粒体活体染色
油镜下小鼠骨髓细胞染色体
油镜下观察
染色体标本观察
线粒体活体染色
线粒体活体染色
线粒体电镜观察
A
C
M
C
N
M
线粒体电镜观察
C C C
N M
MV L
线粒体电镜观察
B M
M
N L
MV
MV
N
L
N
1、人口腔粘膜上皮细胞活体染色显示线粒体 （1）用消毒牙签刮取口腔粘膜细胞，用力应稍重些， 以便得到生活力教旺盛的细胞，将刮取物涂在载玻片 中央。 （2）滴1滴詹纳斯绿B染液于细胞涂片处，2~3分钟后 盖上盖玻片。 （3）用显微镜观察，在高倍镜下可见细胞质中散在一 些被染成亮绿色的短棒状和圆形颗粒，即为线粒体。
实验三 线粒体活体染色
线粒体活体染色
实验目的： 掌握线粒体活体染色的方法与原理
实验原理：
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。 活 体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而 又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线粒体的专一 性活体染色剂。呈碱性，具有脂溶性，能够穿过细胞膜进入细胞内，并 通过其结构中带有正电荷的染色基团结合到带负电荷的线粒体内膜上。 线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细 胞质中染料被还原，成为无色状态。
线粒体活体染色
活体染色：是使生活有机体的细胞或组织特异性着色， 但对该样本又没有毒害作用的一种染色方法。 目的：既显示活体细胞内的某些结构，又不影响细胞 的生命活动和产生任何物理和化学变化以致细胞的死亡。 应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形 态结构和细胞生理、病理状态
线粒体活体染色
线粒体的超活染色与观察
【实验目的】掌握动物细胞活体染色的原理和相关的技术。
【实验原理】活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。
一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。
詹纳斯绿 B（ Janus green B）和中性红（ neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿 B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。
【实验用品】1、材料：小白鼠肝脏、睾丸2、试剂：Ringer 溶液： NaCl 0.85g + KCl 0.25g + CaCl 2 0.03g + 蒸馏水 100ml；1%、1/5000 詹纳斯绿 B 溶液：称取 50mg 詹纳斯绿 B 溶于 5ml Ringer 溶液中， 30-40 ℃加热，使之溶解，用滤纸过滤后，即为 1%原液。
16-17线粒体-36
4.与“通用密码子”不同。 (p149，表12-3)
5.突变频率高，为 nDNA的10倍以上。
6.遗传方式： 母系遗传及不完全母系遗传。原因是某些突 变的线粒体基因组不能够通过遗传瓶颈。
遗传瓶颈：卵细胞形成过程中线粒体数量急 剧减少(10万到少于100个)的过程。这使得只 有少数线粒体真正传给后代，也是造成子代 差异的原因。如果通过遗传瓶颈保留的一个 线粒体携带一种突变，这种突变就会在个体 中占有一定的数量。 7.遗传的异质性、阈值效应、广谱性。 (p149)
化学渗透学说
当电子沿呼吸链传递时，所释放的能量将质子从内膜基质侧泵至膜间隙， 由于线粒体内膜对离子是高度不通透的，从而使膜间隙的质子浓度高于基质， 在内膜的两侧形成pH梯度（△pH）及电位梯度（Ψ），两者共同构成电化 学梯度，即质子动力势（△P）。 质子沿电化学梯度穿过内膜上的ATP酶复合物流回基质，使ATP酶的构 象发生改变，将ADP和Pi合成ATP。
ATP合成酶工作特点： 双向复合酶
线粒体、叶绿体、细菌中的ATP合成酶
（三）线粒体内外膜转位接触点
线粒体蛋白质分别定位于外膜、 内膜、基质以及内外膜间隙。它 们的运送途径不尽相同。 定位于基质的蛋白质的运送途 径，即多肽链穿越线粒体双层膜 的过程：前导肽(leading peptide) 引导，与线粒体外膜受体识别结 合，通过外膜及内膜蛋白转运体 进入线粒体基质，期间分子伴侣 蛋白协同作用，消耗ATP。
线粒体
（Mitochondrion，Mit，mt）
细胞生物学及遗传学教研室 蒲淑萍
细胞内各种供能物质的氧化中心 及细胞能量(ATP)产生、储存和供应 中心——氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）。 Mit还与细胞中氧自由基的生成、 细胞凋亡、细胞的信号转导、细胞内 多种离子(如Ca2+)的跨膜转运及电解 质稳态平衡的调控有关。 （p147）
细胞生物学实验手册
细胞生物学实验手册前言这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制临床专业和研究生班。
细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。
为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。
大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。
选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。
全书内容共23个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。
本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。
荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。
教材初稿曾于1989年《全国医学细胞生物学实验课培训班》试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。
现在第四版在1993年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。
由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。
目录前言实验室规则 (1)常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2)细胞生物学实验绘图方法与要求 (4)实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量 (5)实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察 (8)实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察 (10)实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察 (13)实验六细胞生理活动的观察 (16)实验七细胞组分的化学反应 (20)实验八细胞核与线粒体的分级分离 (23)实验九细胞分裂的形态观察 (26)实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)实验十一细胞融合 (36)实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本 (38)实验十三培养细胞的形态观察和计数 (40)实验十四细胞的原代和传代培养 (43)实验十五酸性磷酸酶的显示 (46)实验十六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定 (48)实验十七电镜生物标本的制备及镜下观察 (50)实验十八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察 (54)实验十九免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原 (56)实验二十姊妹染色单体互换标本制备与分析 (58)实验二十一银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察 (60)实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察 (63)实验二十三细胞显微摄影 (65)附录一离心机转数与离心力的换算表 (67)附录二溶液的配制 (68)主要参考资料 (77)实验室规则一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。
实验二液泡系和线粒体的活体染色及观察解读
二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或 组织能着色但又无毒害的一种染色方法。 它的目的是显示生活细胞内的某些结构， 而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、 化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术 可用来研究生活状态下的细胞形态结构和 生理、病理状态。
二、实验原理
根据所用染色剂的性质和染色方法的 不同，通常把活体染色分为体内活染与体 外活染两类。体内活染是以胶体状的染料 溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、 堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于 识别的目的。体外活染又称超活染色，它 是由活的动、植物分离出部分细胞或组织 小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定 在活细胞的某种结构上而显色。
四、实验步骤
⑵实验者用牙签宽头在自己口腔颊部粘膜处稍用 力刮取上皮细胞，将第一次刮下的粘液状物洗 去，将第二次刮下的粘液状物放入载玻片的染液 滴中，染色10～15min（注意不可使染液干燥， 必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸 吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。 ⑶在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高 倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核 周围胞质中分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或 短棒状的结构，即线粒体。
七．实验作业
1．绘制口腔上皮细胞线粒体形态示意图。
2．绘制黄豆根尖细胞液泡形态示意图。
3．请谈谈实验中有哪些注意事项?
二、液泡系的超活染色与观察
中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高 尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的 液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着 色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
小麦或黄豆根尖细胞液泡系的中性红染色 观察
⑴ 实验前，把黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其 发芽，胚根生长到1以上备用。 ⑵ 用双面刀片把黄豆幼苗根尖（约1～2cm长）小心切一 纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色 5～10min。 ⑶ 吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子 轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。 ⑷ 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见 细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡， 这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察， 在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增 大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色 的巨大液泡，占据细胞的绝大部分空间，将细胞核挤到 细胞一侧贴近细胞壁处。
实验四、线粒体的超活染色与观察
实验四线粒体的超活染色1、材料：口腔上皮细胞、洋葱表皮临时装片一、原理：詹姆斯绿染料是专一性用于线粒体染色的活细胞染液，可以将线粒体染成蓝绿色，而线粒体周围的细胞质中的詹姆斯绿被还原成无色状态，从而显示线粒体。
二、实验材料与试剂1、材料：人的口腔上皮细胞、洋葱内表皮2、器具：显微镜，载玻片，盖玻片，消毒牙签，吸水纸，镊子；3、试剂的配制：（1）Ringer液（复合生理盐水）：0.25g kcl+0.85gNacl+0.03gCacl 加入100ml水）（2）1%詹姆斯绿染液（原液）50mg 詹姆斯绿溶解于5ml Ringer液。
稍加热（30-40℃）使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
（3）詹姆斯绿染液（应用液）取1%詹姆斯绿1ml，加入49ml Ringer液，混匀装入棕色瓶备用。
现用现配。
三、步骤1.观察人口腔上皮细胞线粒体(1)把清洁的载玻片平放在桌上，滴几滴健那绿绿染液于载玻片中央。
(2)用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上皮细胞，均匀地涂到载玻片的染液中。
盖上盖玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干。
(3) 10分钟后用高倍镜或油镜观察，可以看到在接近无色的口腔上皮细胞的细胞质中，特别是在细胞核周围，散布着许多被染成蓝绿色的短棒状或颗粒状结构，即为线粒体。
2.观察洋葱鳞茎表皮细胞线粒体(1)撕取5×5毫米一块新鲜洋葱鳞茎内表皮，展平在洁净载玻片中央。
(2)滴几滴健那绿绿染液，染色10分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去周围溢出的染液。
(3)在高倍镜或油镜下可以观察到细胞质中的线粒体被染成蓝绿色，呈条状或颗粒状。
四、注意事项1、詹姆斯绿染液浓度不宜过高，染色时间不宜太长，否则细胞质会重新氧化成有色状态而不能充分还原染料成无色状态。
2、配制时间：詹姆斯绿染液宜在使用时配制新鲜液，不可久存。
3、如果观察发现染色不足，在盖玻片一侧滴加健那绿液，另一侧用吸水纸吸。
细胞生物学实验手册
细胞生物学实验手册前言这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制临床专业和研究生班。
细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。
为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。
大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。
选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。
全书内容共23个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。
本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。
荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。
教材初稿曾于1989年《全国医学细胞生物学实验课培训班》试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。
现在第四版在1993年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。
由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。
目录前言实验室规则 (1)常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2)细胞生物学实验绘图方法与要求 (4)实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量 (5)实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察 (8)实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察 (10)实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察 (13)实验六细胞生理活动的观察 (16)实验七细胞组分的化学反应 (20)实验八细胞核与线粒体的分级分离 (23)实验九细胞分裂的形态观察 (26)实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)实验十一细胞融合 (36)实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本 (38)实验十三培养细胞的形态观察和计数 (40)实验十四细胞的原代和传代培养 (43)实验十五酸性磷酸酶的显示 (46)实验十六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定 (48)实验十七电镜生物标本的制备及镜下观察 (50)实验十八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察 (54)实验十九免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原 (56)实验二十姊妹染色单体互换标本制备与分析 (58)实验二十一银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察 (60)实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察 (63)实验二十三细胞显微摄影 (65)附录一离心机转数与离心力的换算表 (67)附录二溶液的配制 (68)主要参考资料 (77)实验室规则一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。
线粒体
1分子葡萄糖完 全氧化可形成 3 8 分 子 ATP， 其中36分子是 在线粒体内形 成的，因此线 粒体是物质氧 化的主要场所， 是细胞的动力 工厂。
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线粒体 （Mitochondrion）
线粒体的基本特征 细胞呼吸与能量转换 线粒体与细胞死亡 线粒体与人类疾病
线粒体与细胞死亡
基粒结构模式图
线粒体的基本特征
线粒体的超微结构及化学组成
膜间腔 膜间腔含可溶性酶类，其 中的标志酶是腺苷酸激酶 膜间腔的局部区域内外膜 相互接触，形成转位接触点， 是蛋白质进入线粒体的通道
线粒体的基本特征
线粒体的超微结构及化学组成
基质腔 标志酶：苹果酸脱氢酶 线粒体基质中含有2-10个裸露、 环状的线粒体DNA（mtDNA） 含有线粒体自身的核糖体，并 与线粒体DNA共同构成线粒体 独立的遗传系统。
膜间腔
内膜
细胞呼吸与能量转换
葡萄糖的氧化放能：糖酵解-TAC循环-氧化磷酸化
葡 萄 糖 在 胞 内 的 代 谢 通 路
细胞呼吸与能量转换
葡萄糖的氧化放能：糖酵解-TAC循环-氧化磷酸化 ①葡萄糖在胞质中糖酵解形 成丙酮酸，后者进入线粒体 基质，氧化形成乙酰CoA
②三羧酸循环
(线粒体基质)
H受体（NADH/FADH2）
基本结构：双层单位膜包被起来而形成的封闭 性膜囊结构，具有自身的DNA 多数细胞的线粒体呈线状、粒状或杆状，常相 互连接形成网络，形态具有高度可塑性 不同细胞内线粒体的数量和分布不尽相同，但 与功能是相适应的 细胞内线粒体是可移动的，往往与微管结合并 沿微管移动
线粒体的基本形态
线粒体的基本特征
细胞死亡的两种形式 细胞坏死
两个特点： 被动死亡—他杀 炎症反应
实验二-线粒体超活染色技术及观察PPT课件
• （4）染色10～15min，盖上盖玻片，吸去周围染液， 显微镜下观察。
• （5）计数50个细胞中线粒体数目，得出平均值。
• ２、洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察
• （1）取载玻片于37℃恒温水浴：
• （2）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 2滴
• （3）洋葱鳞茎内表皮 镊子撕取
• （4）染色10～15min，吸去染液，加Ringer溶液１ 滴，盖上盖玻片，显微镜下观察．
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• 【实验用品】
• 材料：
• 人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞
• 器材：
• 显微镜、恒温水浴锅、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、牙 签、吸水纸、洋葱
• ２、试剂：
• （1）Ringer溶液
• 氯化钠
0.85 g
• 氯化钾
0.25 g
• 氯化钙
0.03 g
• （2）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液：
• 称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5ml Ringer溶液中，稍加热(3040℃)溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
• 但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应 选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质) 并配成较稀的溶液来使用.詹纳斯绿Ｂ是活体染色 中重要的染料，对线粒体有专一性．詹纳斯绿Ｂ可 专一性地对对线粒体进行活染，这是由于线粒体内 的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化 状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞 质中,这些染料被还原为无色的色基。
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• 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同, 活体染 色可分为体内活染与体外活染两类.体内活染是以 胶体状的染料溶液注入动植物体内,染料的胶粒固 定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的. 体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部 分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料因其 “电化学”特性与被染部分相互吸引被选择固定在 活细胞的某种结构中而显色。
2019秋CB第07章线粒体
NAD、FAD——递氢体
NAD——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I）
FAD——黄素腺嘌呤二核苷酸
两者均为含有 B族维生素的辅酶。
NAD + + 2H
NADH + H +
FAD ＋ 2H
FADH2
三羧酸循环的4步脱氢——4对氢原子
其中3对氢原子由NAD结合传递。
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NAD +
NADH
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mtDNA为双链环状。不同物种大小不同。
人mtDNA：双链环状，含16569 bp， 共 37个基因（22种 tRNA基因、2种 rRNA基 因、13种 mRNA基因——编码13种蛋白）
mtDNA能自我复制（半保留，基质中）
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DNA
人 的 线 粒 体
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7.3.2 线粒体内蛋白自主合成
1.线粒体的蛋白合成系统 线粒体DNA； 线粒体RNA； 线粒体核糖体； 线粒体蛋白合成与细菌相似。
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线粒体与疾病
克山病，是一种心肌线粒体病，因缺硒导致 心肌线粒体膨胀、结构破坏。
线粒体病有100多种，都是mtDNA异常 （突变、缺失、重排）引起的遗传疾病，表 现为电子传递酶系和氧化磷酸化酶系的异常。
线粒体与细胞衰老和细胞凋亡有关： 机体95％ 的氧自由基来自于线粒体。
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第7章完
多种酶系 。
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线粒体的内膜
*基粒——ATP合成酶 （F1F0－ATP酶）， 含多个亚基。
头部——F1因子。突出膜外——合成ATP。 基部——F0因子。嵌入膜内——质子通道。
*电 结 构 示 意 图
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基粒——ATP 酶复合体。
有柄的小球体。由头、柄和基部组成
实验六 线粒体的活体染色和观察PPT课件
色、毒性最小的碱性染料，由于线粒体中细胞色素酶 系的作用，使它始终保持氧化状态，并呈现蓝绿色， 在线粒体周围的细胞质中的染料被还原为无色的色基。
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• 三、实验材料：常规解剖器、大白鼠肝细胞 • 四、步骤及方法 • 1、鼠肝边沿较薄组织小块，放入盛有Ringer
鼠肝边沿较薄组织小块放入盛有ringer15000janusgreen染液倒入另一培养皿中将肝组织移入其内但不可将组织块完全淹没要让组织上面部分半裸露在染液外面这样细胞内的线粒体的酶系可充分得到氧化线粒体才易染色一般染3040分钟组织块边缘染成蓝绿色即可
实验七、线粒体的活体染色和观察
一、实验目的： 了解线粒体在细胞中的分布及形态、掌握研究方法。
• 3、染色后，用两根解剖针，同时用左右两手， 用一手的针压住组织块，然后用另一手的针稍 稍用力拉肝组织块边缘，就会有一些细胞或细 胞群和组织块分离。
• 4、用吸管将分离的细胞吸起，放在载玻片中央 的Ringer氏液中。垫两根头发，盖上盖玻片， 液体不要太多。
• 5、油镜观察：观察时，不断地上下微调节螺旋， 使盖玻片上下稍稍移动，这样所观察到的材料 总得到充足的氧气，线粒体的染色才显示得非 常清楚。
氏液的培养皿内，洗去血液。 • 2、将1/5000Janus Green B 染液倒入另一培
养皿中，将肝组织移入其内，但不可将组织块 完全淹没，要让组织上面部分半裸露在染液外 面，这样，细胞内的线粒体的酶系可充分得到 氧化，线粒体才易染色，一般染30-40分钟 （组织块边缘染成蓝绿色即可）。
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• 6、结果：油镜下，可见肝细胞质中线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状或线 条状，在细胞核周围分布得特别多。
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线粒体(Mitochondrion)的活体染色
及电镜照片观察
【实验目的】
掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。
【实验用品】
一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。
二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml 注射器、吸管。
三、试剂 l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。
【实验内容】
一、兔肝细胞线粒体的活体染色
（一）原理
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。
细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
（二）方法
用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。
当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。
染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。
将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。
(三)结果
显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。
二、线粒体的光镜切片观察
用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。
三．线粒体的电镜照片观察
不同细胞中线粒体的形态和数目不同。
线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。
线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。
一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。
脊的横切面呈囊状或管状。
脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。
这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长
轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。
第二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。
可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。
第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。