乙肝病毒cccDNA检测
HBVcccDNA定量检测在拉米夫定阻断乙肝病毒宫内感染中的应用价值
Ｈ Ｂ Ｖ ｃ ｃ ｃ Ｄ Ｎ Ａ可作为 Ｈ Ｂ Ｖ宫 内感染 的重要 指标 ， 同时也 能作为 评价母婴 阻断疗效 的 良好指标 ， 其检 测具有较 高
的临床 价值 ， 值得推广应用 。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【 关键词】 乙型肝炎病毒； 疾病传播； 宫内感染； 拉米夫定 ； 共价闭合环状 Ｄ Ｎ Ａ 【 中图分类号】 Ｒ ５ １ ２ ． ６ ２ 【 文献标识码】 Ａ 【 文章编号】 １ ０ ０ ３ －６ ３ ５ ０ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ —Ｏ ２ ２ ３ —Ｏ ３
ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ（ ＝ ３ ２ ） ａ ｎ ｄ ｈｅ ｔ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ｎ ＝ ２ ８ ） ． Ｂ ｌ ｏ ｏ ｄ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ａ ｔ ２ ８ ｗｅ ｅ ｋ ｓ ｇ ｅ ｓ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ｐ ｒ ｅ ｎ ａ ａｌ ｔ
组２ ８ 例， 孕 妇 均于 孕 ２ ８ 周、 产前 ， 产后 ２ ４ ｈ与产后 ３ 个 月采 血 ， 对Ｈ ＢＶ ＤＮ Ａ、 Ｈ ＢＶ ｃ ｃ ｃ ＤＮ Ａ水平 采用 Ｐ Ｃ Ｒ方法 进 行 检测 ， 并 收 集结 果 ， 同时收集 产 时胎盘 组 织 Ｈ ＢＶ ｃ ｃ ｃ ＤＮＡ定量 结果 及 宫 内感染率 ， 对两 组数 据进 行分 析 。 结果 治疗组 孕妇在孕 ２ ８ 周 检测 ＨＢ Ｖ － Ｄ ＮＡ、 ＨＢ Ｖ ｃ ｃ ｃ ＤＮＡ水平 与对 照组 比较 ， 差异无 统计学 意义 （ Ｐ ＞ ０ ． ０ ５ ） ； 治 疗 组孕 妇在产前 ， 产后 ２ ４ ｈ 与产后 ３ 个 月 ＨＢ Ｖ － Ｄ ＮＡ、 ＨＢ Ｖｃ ｃ ｃ Ｄ ＮＡ水平及 产时胎 盘组织 Ｈ Ｂ Ｖｃ ｃ ｃ Ｄ ＮＡ水平 与对 照组 相 比 明显 不 同 ， 差 异 具有 统计 学 意义 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 其新 生 儿 宫 内感 染 率 明显 低 于对 照组 （ Ｐ ＜ Ｏ ． ０ ５ ） 。 结 论
乙肝病毒相关终末期肝病患者肝移植术后外周血HBVcccDNA检测
现 代 检 验 医学 杂 志
第２ ３卷
第 ３期
２ ０ 年 ５月 ０８
ＪＭｏ ａ ｄ， １２ ， ． ， ｙ ２ ０ ｄＬ ｂＭｅ Ｖｏ． ３ Ｎｏ ３ Ｍａ ． ０ ８
６９
乙肝病毒相关终末期肝病患者肝移植术后 外周血 ＨＢ ｃＤ Ｖｃｃ ＮＡ检测
吴 月平 ， 勇武 ， 凌 王世 蓬 ， 罗文 明， 黄松 平 ， 吴 萍 ， 刘先 进 ， 韩 刚 ， 陆军 王 （ 南通 市第三 人 民 医院 ， 苏南通 ２ ６ ０ ） 江 ２ ０ ６
摘要 ： 目的 通 过 外 周 血 ＨＢ ｃＤ Ｖｃｃ ＮＡ 与 ＨＢ Ｄ Ｖ ＮＡ 及 Ｈ ＶＭ 的 相 关 性 检 测 分析 ， 讨 乙肝 病 毒 相 关 终末 期肝 病 患 者 原 Ｂ 探
～
１ ３ 方 法 血 清 ＨＢ Ｄ ． Ｖ— ＮＡ 含量 检 测 和 白细胞 中 ＨＢ ｃＤ Ｖｃｃ ＮＡ 检 测 分别 采用 竞 争 Ｐ Ｒ 微 流 芯 Ｃ 一 片 法和 Ｐ Ｒ一 流芯片 法 （ Ｃ 微 上海 浩源公 司试剂 ） 。取 １ ０ ＤＴ Ｋ２ 凝 全 血 加 １ ０ 红 细胞 裂 解 ０ １ Ｅ Ａ— 抗 ０ １ 液， 生理 盐水 洗 涤 、 淀 白细胞 排 除血 清 中 ｒＤ 沉 ｃ ＮＡ 干 扰 （ 次 洗 涤 直 至洗 液 中检 测 不 到 ＨＢ ＮＡ 多 ＶＤ 等 ） 病 毒 裂 解 后 采 用 酚一 仿 抽 提 ， ， 氯 根据 ｃｃ ｃＤＮＡ 与 ｒＤＮＡ 结 构 的不 同 ， 引 物 分别 设 计 在 ＨＢ ｃ 将 Ｖ一 ＤＮＡ 负 链 缺 口的两 侧 ； ｆｇｏ ｉ 为全 血 中 自 以 ｝ ｌｂｎ作 ＿ 细 胞 提取成 功 与否判 断依据 。 清 中 ＨＢ ｃＤＮＡ 血 Ｖｃｃ 检 测采 用 荧 光 Ｐ Ｒ 法 （ 海 复 星 长 征 试剂 ） ＨＢ Ｃ 上 ， 一 ＶＭ 检 测 采 用 ＭＥ Ａ 法 （ 剂 由美 国雅 培 公 司提 Ｉ 试 供 ）血 清 ＨＢ ， ＶＹＭＤ Ｄ检 测采 用 Ｐ Ｒ 微 孔板 杂交 Ｃ 一 法（ 上海 浩源 公 司试 剂 ） 。 １ ４ 统 计 学分析 ． ２ 结果 采用 ｔ 检验 。
cccDNA是乙肝检测的最权威指标
龙源期刊网 cccDNA是乙肝检测的最权威指标作者：刘士敬来源：《家庭医学》2010年第08期研究发现，细胞外的乙肝病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，有数个碱基的“缺刻”；正链较短，有较大的“缺口”。
在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(英文简称cccDNA)。
cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。
近年来，国内一些大医院已建立了可靠的检测方法。
评价慢性乙肝抗病毒治疗疗效目前考核抗病毒药物疗效的标准，都是建立在乙肝病毒被抑制或可能被清除的间接评价指标之上，比如，病毒DNA达到不可测水平、HBeAg消失或血清转换、HBsAg消失或血清转换等。
只有彻底清除了细胞核内的cccDNA，乙肝病毒复制的基础不复存在了，才是真正治愈了乙肝。
可见，考核抗病毒治疗的最终疗效标准，应该是清除cccDNA，其他任何指标与之相比只能是“次要”标准。
有研究表明，在血清HBsAg被清除的乙肝病毒感染者中，肝细胞内仍有cccDNA存在。
但清除cccDNA的过程比较漫长，需要较高的社会和经济成本，而且在现有条件下进行长期治疗，伴随的必然是药物不良反应的增加以及病毒耐药突变等。
因此，是否把清除cccDNA作为治疗终点，还需要进行更多的研究。
筛选抗病毒药物目前的抗病毒药物均不能有效清除CCCDNA，因此，开发新的、能清除CCCDNA的药物是患者和医生共同的期待。
遗憾的是，CCCDNA分子在细胞内形成的一些关键环节，目前还不清楚或存在争论。
如果能阐明这些环节，将有助于指导开发新的、能够清除eecDNA的抗病毒药物。
评价乙肝病毒复制的模型一种细胞或动物模型能否支持乙肝病毒复制，cccDNA可以作为一个较好的评价指标。
乙肝DNA测定结果如何解读
乙肝DNA测定结果如何解读乙肝DNA测定结果的解读：乙肝DNA测定是一项用来检测乙型肝炎病毒是否存在于体内的重要检测手段。
其结果可分为阳性和阴性两种，具体解读如下：1、乙肝DNA测定结果为阴性：表示体内没有乙型肝炎病毒或病毒数量很少。
此时，患者有可能已经从疾病中恢复或处于病毒携带者状态。
2、乙肝DNA测定结果为阳性：表示体内存在乙型肝炎病毒。
阳性结果的大小表示病毒载量的多少，数字越大，病毒载量越高。
数字越小，病毒载量越低。
当病毒载量高时，就需要进行相应的治疗。
乙肝DNA测定的治疗方法：目前，治疗乙肝感染的方法主要是药物治疗以及疫苗预防。
药物治疗依靠抗病毒药物来抑制病毒复制，达到稳定病情、控制病毒、防止病情恶化等效果。
常用的抗病毒药物有：拉米夫定、爱地华、恩替卡韦等。
疫苗预防是针对乙型肝炎病毒产生抗体，从而达到预防感染的目的。
乙肝DNA测定的注意事项：1、准确性：乙肝DNA测定的结果应该由专业医生来解读，因为误判会对治疗方案产生影响。
2、重要性：乙肝DNA测定是乙肝治疗的一个关键指标，检测结果直接关系到患者治疗的方向和疗效。
3、检测周期：乙肝DNA测定结果不是一次就能确定的，需要定期测定。
一般来说，至少每半年进行一次测定，以保证治疗的有效性和及时处理病情。
4、治疗方案：乙肝治疗除了要考虑病毒载量外，还需要注意患者的肝功能情况、乙肝病期、合并症等因素，因为不同的患者情况需要的治疗方案是不同的。
5、生活习惯：患者在治疗期间应该注意生活习惯，比如不要喝酒，不要吃刺激性食物，同时保持充足的休息，加强身体锻炼，避免感染其他疾病。
乙肝核心抗体阳性是不是曾经感染能跟他吃饭乙肝核心抗体阳性是什么意思？乙肝核心抗体（HBcAb）是乙型肝炎病毒感染后体内产生的抗体之一，其出现表明人体曾经感染过乙型肝炎病毒。
乙肝核心抗体阳性的患者可以被诊断为曾经患有乙型肝炎，但并不一定表示这个人正在患有乙型肝炎。
跟乙肝核心抗体阳性的人吃饭是否安全？乙肝核心抗体阳性的患者可以跟大多数人一样吃饭，因为乙肝病毒不通过空气、水、食物传播。
乙肝病毒DNA检测Microsoft Word 文档
乙肝病毒DNA检测乙肝病毒DNA指的是脱氧核糖核酸，病毒的复制是靠DNA的复制来完成的，DNA的浓度越高，病毒的复制越活跃。
合起来，HBV-DNA指的就是乙肝病毒的脱氧核糖核酸。
乙肝病毒DNA检测是判断乙肝病毒复制的常用手段。
一般的，把数值大于10的3次方为阳性，把3-5次方认为是低量复制，5-7为中等量，大于7次方为大量。
乙肝两对半并不能准确的判断病毒复制情况，DNA弥补了这个的不足。
不过由于DNA检测技术要求严格，容易受到干扰，因此，一次结果不足以说明问题，遇到阳性，可以换医院再次检查。
目录1DNA检测2作用3临床意义4复制过程▪第一步：黏附▪第二步:脱壳▪第三步：入核▪第四步：转录▪第五步：翻译▪第六步：逆转录▪第七步：组装5频率6注意事项7检测方法8检测报告9检测费用10检测要空腹吗11乙肝病毒DNA检测的作用1DNA检测以往乙肝患者抗病毒治疗的指征是：乙肝病毒e抗原阳性（大三阳）患者HBVDNA数值要求达到10的5次方拷贝/毫升（20000U/ml），乙肝病毒e抗原阴性（小三阳）患者乙肝病毒DNA数值要求达到10的4次方拷贝/毫升（2000U/ml），但是10的4次方拷贝/毫升以下也不能认为就没有问题了，最新的国际研究资料表明：和肝脏疾病进展相关的病毒DNA水平域值尚不清楚，即使HBVDNA水平持续低于20000U/ml，也可能乙肝病毒情仍在进一步发展，因此HBVDNA数值应该越低越好，目前国际建议的HBVDNA检测正常值应该是：< 50U/ml 。
2作用目前，乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中使用的越来越普遍，可见乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中占的分量越来越重，这是因为乙肝病毒DNA检测对确诊乙肝和评估乙肝治疗效果具有十分重要的作用。
主要表现在以下七个方面：1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。
2、乙肝病毒是否复制。
3、乙肝是否传染，传染性有多强。
4、是否有必要服药。
5、肝功能异常改变是否由病毒引起。
乙型肝炎患者血清HBV cccDNA检测的临床意义
１ 材 料 与 方 法
１ １ 病例选 择 ．
选 取本 院 ２ ０ 年 ６月 至 ２ ０ 年 ５月住 院 乙型 ０５ ０６
肝 炎患 者 １ ２例 ， １ ８例 ， １ ６ 男 ４ 女 ４例 ； 龄 １ ～ ６ 年 ６ ８
提 供 。主要检 测 仪器 为美 国产 Ｆ Ｃ ２ ０ Ｔ 一０ ０荧 光 Ｐ Ｒ Ｃ 检测 仪 ， 国 Ｃ ｄ 美 ｏ ａ全 自动 酶 免 分 析 仪 。实 验 操 作 步骤 按试 剂盒 说 明书 要求 进行 。
１ ３ 统 计学 处理 ． 采用 Ｙ 检 验 。
因组 复制 中间 体 ｍＲ ＮＡ 和 前 基 因组 Ｒ ＮＡ 的合 成
（ ｅ 、 Ｖ ＮＡ） ＨＢ Ａｇ ＨＢ Ｄ 的关 系 。方 法
检测 １ ２ 乙 型肝 炎 患 者 外 周 血 清 中 ＨＢ ｃＤ ６例 Ｖ ｃｃ ＮＡ 定 量 、 Ｖ ＤＮＡ 定 量 和 乙 型 肝 炎 病 毒 标 志 物 。 结 果 １ ２例 ＨＢ ６ 乙型肝炎患者 ， 血清 ＨＢ ｃＤＮ 阳性 率 为 ４ ． ５ （８ ６ ） ＨＢ ｃＤ Ｖ ｃｃ Ａ ８ １ ７／ ２ 。 Ｖ ｃｃ ＮＡ 阳性 率 在 ＨＢ ＮＡ 阳 性 患 者 中 为 ＶＤ
维普资讯
・４ ・
实用 临床 医学 ２ ０ ０ ８年 第 ９卷 第 ７期
Ｐ ａ ｔ ａ Ｃ ｉ ｉ ｌ ｅ ｉ ｎ ，２ ０ ， ｏ ９ Ｎ ７ ｒ ｃｉ ｌ ｌ ｃ ｄ ｃ ｅ ０ ８ Ｖ ｉ ， ｏ ｃ ｎ ａＭ ｉ
乙型 肝 炎 患 者 血 清 ＨＢ ｃＤＮ 检 测 的 临 床 意 义 Ｖ ｃｃ Ａ
HBV cccDNA检测技术进展
Ｈ Ｖ 基 因组 结 构 及 ｃｃ Ｎ 的 形 成 Ｂ ｃＤ Ａ
细胞外乙型肝炎病毒 Ｄ Ａ是一种松弛环状的双 Ｎ 链 Ｄ Ａ （ｅ ｘ ｄｃｒ ｌ Ｎ Ｎ ｒｌ ｅ ｉ ｕａ Ｄ Ａ，ｒＤ Ａ 分子 ，其 两 ａ ｃｒ ｃＮ ） 条链均不闭合 ， 其中负链较长 ，约 ３０ ２０个碱基，含 有 乙肝病 毒 基 因组 的全 长基 因 ，在其 ５ ’起 始 端 与
胞 内 保 持 一 个 动 态 平 衡 水 平 ，形 成 一 个 Ｈ Ｖ Ｂ
ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ池 。
ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ检测 的分子 基础
乙肝 病毒在 一个 完整 的生活周期 中有多 种 同源
度和特异性 ，而新 的荧光探针和荧光引物技术使准 确 检测 ＨＢ ｃＤ Ａ成为可 能 。 Ｖｃｃ Ｎ
中图分类号 ：Ｒ １． ２ ５２６
陈保德 陈瑜 审校
文献标识码 ：Ａ 文章编 号：１ ０ ０ ３ （０ ０ ５—０ １ ０ ０７－ ９ １ ２ １ ）０ ０ ９— ４
乙型 肝炎 病 毒共 价 闭合 环 状 Ｄ Ａ （ ｅａｔ Ｎ ｈｐｔｉ Ｂ ｉｓ
ｖ ｕ ｏａ ｎｌ ｃ ｓｄ ｃ ｃｌｒＤ Ａ，Ｈ Ｖ ｃＤ Ａ） ｉ ｓｃｖｌ ｔ ｌ ｅ ｉ ｕａ Ｎ ｒ ｅ ｙ ｏ ｒ Ｂ ｃｃ Ｎ
浙江预防医学 ２ １ ００年第 ２ ２卷第 ５期
Ｚ ￣ ａｇＰｅｅｔｅＭｅｉ ｎ ，Ｍａ ００，Ｖ ｌ ２ ｏ５ ｈ ｉ ｒ ｎｉ ｄｃ ｅ ｎ ｖ ｖ ｉ ｙ １ ２ ｏ ２ ，Ｎ ．
・
１ ・ ９
・
综述 ・
Ｈ Ｖ ｃｃ Ｎ Ｂ ｃＤ Ａ检 测 技 术 进 展
齐雪芬 徐 益 飞 综 述
３ ’末 端 之 间 有 一 个 包 含 数 个 碱 基 的 “ 刻 ” 缺
乙肝病毒cccDNA检测
1.选择性PCR
选择性PCR：rcDNA不被扩增
选择性PCR：cccDNA能被扩增
“选择性”PCR：并非万无一失
PCR产物自身退火（self annealing）
rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠
Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC）
解决方案
特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法 酶切纯化cccDNA 采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 侵入者探针法（Invader assaay）
P2
cccDNA能被扩增 检测到荧光信号
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
结果 ： 标准曲线方程YCtcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml
与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。
01
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
02
rcDNA不能被扩增 无荧光信号
EcoR I
5‘
+
P1
P2
3200(1)
5‘
3‘
1590
3‘
1820
P1
1820
1590
+
3200（1）
EcoR I
World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清)
慢性HBV携带者检测血清CCCDNA的临床意义
近１ 年来均未接受过干扰素和核甘类似物抗病毒 治疗 。
标 本采 集 ： 于清晨 用 一次性 注 射 器采血 ， 分离
者 比较差异有显著性 （ ＜００ ） Ｐ ．１ 。 Ａ Ｃ和 ＮＡ Ｓ 患 者 血 清 ｃｃ Ａ 含 量 分 Ｓ ＡＣ ｃＤＮ 布： Ａ Ｓ Ｎ Ａ Ｃ血清 ｃ Ｄ Ａ含量较低 ， ｃ Ｎ ｃ 位于 ４７ ．Ｅ一 ０ －３ ８ ７ ．Ｅ＋０ ｏ ／ ３ ｃｐ Ｌ之 间 ， ３例 为 低 水 平 阳 有
３ 讨
论
在 慢性 ＨＢ 感 染 过 程 中 ， 产 生 一 种 不 同 Ｖ 会 形 式 的病 毒 Ｄ —— 共 价 闭合 环 状 ＤＮ ｃｃ ＮＡ Ａ（ｃＤ—
如下 。
荧光检测 ： 待各 Ｐ Ｒ反 应 液管充分冷 却至 Ｃ
２ ８℃ 后 短 暂 离 心 ， 后 放 人 荧 光 检 测 仪 ， 取 并 然 读
Ｃ 血清 ｃ Ｄ Ａ， ） ｃ Ｎ 现将相关结果报道 ｃ
记录荧光值 ， 荧光激发波长为 ４７ｒ 检测波长 ８ ｍ， ｉ 为 ５ ８ｌ １ ｍ。 ｑ 荧光值确定 ： ｘ ＝标 本或者各对照荧光 Ａ 值
平ＨＶ Ｎ Ｂ Ｄ Ａ患者）其他患者检测值为 １４ ０ ， ．Ｅ＋ ４
～
４． Ｅ ＋０７ ｃ ５ ｏｐ／ Ｌ。
Ａ Ｃ患者 血清 Ｈ Ｖ Ｎ Ｓ Ｂ Ｄ Ａ和 ｃ Ｄ Ａ均值 ： ｃ Ｎ ｃ ３ 例 Ａ Ｃ患者血清 Ｈ Ｖ Ｎ ０ Ｓ Ｂ Ｄ Ａ均值 （ ｇ 为（ ． １ ） ６７ ｏ ± ． ） ｏ ／ Ｌ， ２ ４ ｃｐ ｍ 而血清 ｃｃ Ｎ 的均值 （ ｇ 为 ｃ Ａ Ｄ １） ｏ
内加 去 离 子 水 ５ ｍ ， 匀 后 １ ０ ０ｐ Ｌ 混 ０ ｍ离 心 ０ ｒ １ Ｓ 然 后 上 机 按 以 下 程 序 扩 增 ： 变 性 ９ ℃ 。 ０ 预 ４ ３ｍｉ； 环 条件 ： ４℃ ３ 、５℃ ３ 、２℃ ｎ 循 ９ ５ｓ５ ５Ｓ７
乙肝定量的意义
乙肝定量的意义乙肝“两对半”定量检测的必要性及可行性众所周知，慢性乙型肝炎是我国常见的慢性传染病之一。
2008年4月，卫生部公布了最新的全国人群乙肝等有关疾病血清流行病学调查结果：我国乙肝表面抗原携带率为7.18%，携带者仍然达9300万人。
调查结果再次表明，乙肝防治工作面临的形势依然严峻，我们应充分认识乙肝危害的严重性和长期性。
根据中华医学会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》，乙肝的实验室检查包括生化学检查、HBV 血清学检测、HBV DNA及基因型和变异检测测、影像学诊断、病理学诊断。
其中，HBV 血清学检测主要指乙肝“两对半”检测，目前常采用酶免疫法 (EIA)、放射免疫法 (RIA)、微粒子酶免分析法 (MEIA) 或化学发光法等。
长期以来，受检测技术水平、检测成本、传统习惯等多方面因素影响，乙肝“两对半”一直处于手工定性检测，这使得该项目成为实验室众多项目中最难实现自动化定量检测的项目之一。
近几年，国内、国外不少厂家纷纷提出“乙肝定量检测”的概念，应该说这是实验室需求及检测技术发展的必然。
受厂家推广的影响，医务工作者不免存在以下疑问：什么是乙肝定量检测、乙肝定量检测有必要性吗？首先我们来讨论第一个问题，个别厂家在宣传定性/定量检测时，往往会“打擦边球”，试剂说明书里给出的单位明明是“COI”或“S/CO”，却被说成是“完全定量”。
这显然是不正确的，国际上公认的乙肝“两对半”定量的单位应该是ng/ml、IU/ml、IU/L 或PEIU/ml。
如何确定某一方法学是定性还是定量，笔者有一简单方法：打开试剂说明书，找到第一段话便一目了然（完整的试剂说明书在第一段话中，就会描述该试剂盒是作定性/qualitative还是定量/quantitative检测）。
对于“乙肝定量检测有必要性吗”这一问题，在医务工作者中存在两种声音：第一种是乙肝定性已能满足临床需要，乙肝定量没必要了；第二种声音是乙肝定量检测与疾病进程密切相关，定量检测极为重要。
乙型肝炎病毒cccDNA检测方法的建立及初步应用
乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ检测方法的建立及初步应用目的：建立和应用聚合酶链反应法(PCR)检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)。
方法：应用选择性PCR的方法检测30例乙肝患者肝组织中cccDNA，同时验证此方法的特异性。
结果：31例慢性乙型肝炎患者肝组织中，10例HBV cccDNA阳性，阳性率为32.3％。
HBV cccDNA阳性组的ALT、HBV DNA、和HBeAg水平均明显高于阴性组(P＜0.01和P＜0.05)。
结论：该方法操作简单，特异性好，可用于测定肝组织中HBV cccDNA，用于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价抗乙肝病毒药物的疗效。
标签：乙型肝炎病毒；共价闭合环状DNA；聚合酶链反应；慢性乙型肝炎在感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cc－cDNA)，不与蛋白共价结合。
cccDNA 是嗜肝DNA病毒科病毒基因组的复制中间体，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板，虽然其含量较少，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，是嗜肝病毒持续感染的关键因素。
因此，我们选择其特异性引物，建立了乙肝病毒肝组织的cccDNA检测方法。
1材料与方法1.1研究对象慢性乙型肝炎患者肝组织标本31例和2例HBV DNA阳性肝癌肝组织标本；HBV DNA阳性血清标本1例，HBV DNA含量为107 copies/ml；HBV DNA阴性血清标本和HBV阴性肝组织标本各l例作为阴性对照，－70℃保存。
诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。
1.2仪器PCR自动循环仪，AG－9600 Thermal Station，AcuGen Sva－terns。
1.3引物的设计和合成由于松弛环状DNA(rcDNA)的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不会被扩增，而cccDNA由于为完整的双链结构，则可以被选择性扩增，通过GENERUN软件设计一对跨越缺口的最佳引物，BA3为：5’－CCG ACC ACG GGG CGC ACC TCT CTI”TAC G－3’，BA4为：5’－CAA GGC ACA GCT TGG AGG CTT GAACAGT－3’，扩增目的基因片段为373 bp。
乙型肝炎病毒相关性肝病患者外周血白细胞中HBVcccDNA检测
２ 。两者 间无 显 著相 关 （ ＞ ．５ 尸 Ｏ０ ）
表 ２ ＨＢ ｃ ｃ Ｎ Ｖ ｃ Ｄ Ａ￣ ＨＢ Ａ ／ ｅ ｂ的关 系 ｅｇ ＨＢ Ａ
组别
例 数 ｅ ｅＡｂ ，ｇ Ａ＋ ｃ
－
红 细胞 裂解 液 ， 理 盐 水洗 涤 、 淀 白细 胞 ， 除 血 生 沉 排 清 中 Ｔ Ｄ Ａ干 扰 。 毒裂解 后采 用 酚一 ｃＮ 病 氯仿 抽提 ， 根 据 ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ与 Ｔ Ｄ Ａ结 构 的不 同 ， 引物 分 别设 计 ｃＮ 将 在 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ负 链 缺 口的两 侧 ； Ｂ ｇ ｂｎ作 为 阳 Ｂ—Ｎ 以 —ｌ ｉ ｏ 性 对 照 区带 。ＨＢ Ｍ 检测 采 用 Ｅ Ａ 法 或 ｍ Ｌ Ｖ— ＵＳ ＥＡ
２２ Ｈ Ｖ ｃＤ Ａ 与 Ｈ ｅ ｇＨ ｅ ｂ 的 关 系 见 表 ． Ｂ ｃｃ Ｎ ＢＡ／ＢＡ
流芯 片法 ， 剂 购 自上 海浩 源公 司 。 白细胞 中 Ｈ — 试 Ｂ Ｖ ｃＤ Ａ检 测采 用 Ｐ Ｒ 微 流芯 片法 。试 剂 购 自上 ｃｃ Ｎ Ｃ一
海浩 源 公 司 。取 １０￣ Ｄ Ａ Ｋ 凝 全 血 加 １０￣ ０ ｔＥ Ｔ — ２ Ｉ 抗 ０ ｔ ｌ
Ｈ Ｖ ｃＤ Ａ是 乙肝病 毒 复制 的 中间体 。 Ｂ ｃｃ Ｎ 是病 毒
前基 因组 Ｒ Ａ转 录的模 板 。肝 细胞 内存在 ｃ ｃ Ｎ Ｎ ｃＤ Ａ
加 。尤 其 ＨＢ － Ｎ Ｖ Ｄ Ａ在 １５ １７ ｐｅ／ ｌ ＨＢ ｃ — ０￣ ０ｃ ｉｓ 间 ｏ ｍ Ｖ ｃ ｃ Ｎ 阳性 率 显 著 高 于 ＨＢ Ｄ Ａ 阴 性 患 者 （ ＜ Ｄ Ａ Ｖ— Ｎ Ｐ ００ ） ．１。９例肝 移植 患者 血 清 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ 阴性 ， 中 ２ Ｂ—Ｎ 其
・２ ． ５１
外周血HBV cccDNA检测的临床应用
１ ｎ ｈｕ Ｔ ｉ ｅｐｅｓ Ｈｏｐｔ ｎ Ｚ ｅ ａ ｇ Ｐｏ ｉｃ ，Ｗｅ ｚｏ ３ ５ ０ ，Ｃ ｉａ ． ｎｈ ｕ Ｍｅ ｉａ Ｃ ｌ ｇ， ． ｚｏ ｈｒ Ｐ ｏ ｌ＂ Ｗｅ ｄ ｓｉ ｌ ｉ ｈｊ ｎ ｒｖｎ ｅ ａ ｉ ｎｈ ｕ ２ ０ ０ ｈｎ ；２Ｗｅ ｚｏ ｄｃｌ ｏｌ ｅ ｅ
３５ ０ ） ２ ００
【 要】目的 通 过 对 乙 型肝 炎 患 者外 周 血单 个 核 细胞 及 血 浆 中共 价 闭合 环 状 ＤＮ ｃ ｃ Ｎ 的 检测 ， 步探 讨 其 外 摘 Ａ（ｃ Ｄ Ａ） 初 周 血检 测对 乙型肝 炎诊 治 的价值 。 方法 将 ８ ６例 确诊 为 乙型 肝 炎患 者根 据病 情 分 为 ３组 ， 性 乙 型肝 炎（ ）慢 急 ＡＨＢ 、 性 乙型 肝 炎 （ＨＢ 及 ＨＢ Ａ Ｃ ） ｓ ｇ无 症 状 携 带 者（ Ｓ ） Ａ Ｃ￥ Ｒ。采 集 外 周 血 ， 别 检 测 Ａ 、 Ｓ 总 胆 红 素 （ Ｂ Ｌ 、ｃＤ Ａ、 分 Ｉ Ａ Ｔ、 Ｔ Ｉ ）ｃ ｅ Ｎ ＨＢ — Ａ 结 果 三组 血 浆 ｃｃ Ａ检 测 结果 有 显 著性 差 异 （ ＜ ．１ 。单 个 核 细 胞 ｃｃ Ｎ 标 本 阳性 ， Ｖ ＤＮ ｃＤＮ Ｐ ００ ） ｃ Ｄ Ａ ７个 血浆
ｗｅ ｅ ｉｎｆ ａ ｔ ｄｆｅｅ ｔ ｍｏ ｏ ｕ ｌａ ｃ ｌ ｃ ｃ ｒ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｌ ｉ ｒｎ ， ｉ ｙ ｆ ｎ ｎ ｃｅ ｒ ｅｌ ｃ ＤＮＡ ｔｒｇ ｐ ｏ ｄ ｅ ｅ ｉｔ ｕ ｉ Ｓ ｏ ｓ ｓｏａ ｅ ｏ ｌ ｏ ｓ ｘｓ ｂ ｔ ｔ ｌｗ ａ ｄ ｉ ｉｕｔ ｏ ｅｅ ｔ ｎ ｄｆ ｃ ｌ ｄ ｔｃ． ｆ ｔ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｃ ｎ ｅ ｔａｉｎ ｏ ｐａ ｍａ ｃ ｃ ｎ ｌｓｏ ｏ ｃ ｎ ｒｔ ｆ ｌｓ ｃ ＤＮＡ ｉ ｅａｅ ｔ ｏ ｓｒｌｔｄ ｗｉｈ ＨＢＶ—ＤＮＡ，ＡＴ ，ＡＳ Ｊ Ｔ Ｔ，ｂ ｔｎ ｉｎｆｃ ｎ ｏ ｅａｉｎ ｗｉ ｕ ｏ ｓｇ ｉ ａ ｔｃ ｒ ｌｔ ｔ ｉ ｏ ｈ
最新HBVcccDNA及其意义
一、HBV感染初期cccDNA的形成 二、HBVcccDNA的稳定性 三、核苷类似物不能阻止初始cccDNA的形成 四、HBVcccDNA检测方法 五、慢性乙肝患者cccDNA检测的意义 六、如何清除HBVcccDNA？ 七、 cccDNA在抗病毒治疗研究中的应用前景
2006-08-15
感染科19
四、HBVcccDNA检测方法
1.细胞内cccDNA的抽提与纯化
最常用的抽提细胞内cccDNA的方法是蛋白质－去污剂沉淀 法，其原理是基于rcDNA和cccDNA与蛋白质结合能力的差 异。rcDNA能与蛋白质共价结合，与绝大多数细胞染色体 DNA一起形成沉淀，而cccDNA不能与蛋白质结合故游离于 上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到cccDNA。根据缪晓辉 等的经验，该方法的主要缺点是：抽提较为费时，一般需 要4-5小时；酚氯仿抽提环节多、得率不高；对于冻存的 富集细胞（pellet）难以充分裂解，单裂解这一步可能需 要3-4小时甚至更长时间。此外，在上清中实际仍然含有 少量的rcDNA，而在沉淀中实际上也存在着一部分cccDNA。
2006-08-15
感染科16
Moraleda等通过土拨鼠原代细胞 抗病毒研究结果显示，cccDNA 的 半衰期很长，其清除依赖于感染 细胞的死亡。
但是也有相反的报道。
尽管用人的原代肝细胞感染HBV， 可以观察到cccDNA的合成和缓慢 增加，但到目前为止还没有原代 人肝细胞中cccDNA的半衰期的报 道。
2006-08-15
感染科17
三、核苷类似物不能阻止
初始cccDNA的形成
Delmas等研究发现，阿德福韦能 降低培养细胞内DHBVDNA(包括 cccDNA)水平，说明病毒感染后起 始的病毒基因组向cccDNA的转换 在阿德福韦存在的情况下仍能发 生，但扩增合成cccDNA的过程被 抑制。
实时荧光定量PCR检测HBVcccDNA临床应用研究
・
特别关注 ・
Ｊ ｅＲ ， ｃ０ ， ｉ６ ｏ２ ｄ ｅＤ ０ Ｖ ． ． Ｍ ｓ ｅ２ ７ ｏ３Ｎ １
实 时荧 光定 量 Ｐ Ｒ检 测 ＨＢ ｃｃ Ｎ 临床 应 用 研 究 Ｃ Ｖ ｃＤ Ａ
李华 东 江建 宁
乙型肝 炎病 毒 （ ｅａｉｓＢ ｖｒｓＨＢ 属 嗜肝 脱 ｈ ｐ ｔｉ ｉ ， Ｖ） ｔ ｕ 氧 核糖 核 酸 科 （ ｅ ａ ｎｖ ｉａ ） 不完 全 双链 Ｄ Ａ病 ｈｐ ｄ ａ ｉｄｅ ， ｒ Ｎ 毒 ， 引起急 慢性 肝炎 的最 主要 病原 之一 。乙型肝 炎 是 病 毒与 其他 Ｄ Ａ病 毒 相 比， 同之处 在 于它 特 殊 的 Ｎ 不 反 转录 复制 形式 ， 以及 特殊 的复 制 中间体 共价 闭合 环
的定量 。此 方法 对 ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ检 测 范 围可 达 １ ～１ ０ ０
受到 Ｈ Ｖ合 成 的 负 反馈 调 节 。ｃｃ Ｎ 的半 寿期 较 Ｂ ｃＤ Ａ
长， ３ 为 ０天左右 ， 容易 受到抗 病 毒药 物和免 疫 因素 不 的影 响 。在 Ｈ Ｖ合 成 受 到 抑制 时 ， 毒 会 优 先 补 充 Ｂ 病 ｃｃ Ｎ 一 旦条 件 适 宜 ， 可 以 大 量 产 生 病 毒 ， 而 ｃＤ Ａ， 又 因 ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ在慢 性肝 炎反 复发 作 和抗病 毒药 物停 药后 病
建立较 成熟 的 ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ检 测法 ， 首先 设 计 一 对特 异 他
性 扩增 ｃｃ Ｎ 的引物 和探 针 ， 计 的探 针 含 有荧 光 ｃＤ Ａ 设
基 团和淬 灭 基 团 ， 交 于 负 链 ３ 端 近 缺 口处 。 由 于 杂 ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ的负链 完 整 ， 引物 可 延伸 至 探 针处 ， ａ Ｎ Ｔ ｑＤ Ａ 聚合 酶将 两基 团剪 切分 离 ， 从而 释放 荧 光 。而 ｒＤ Ａ ｃＮ 负链 有缺 口 ， 引物 延 伸 不 能 到 达 探 针 ， 而 无 法 释放 因
乙肝定性转定量的发展
乙肝定性转定量的发展进程以我们目前人类现有的科技手段，根本无法做到治愈乙肝，我们现阶段的目标不在于治愈乙肝，而在于提高乙肝患者的生活质量，阻止其病情向更糟糕的情况发展。
提到防治乙肝，不能不提到相关的药物，自1991年干扰素（IFN）应用于临床以来，相继有LVD（1998）、ADV（2002）、pegIFN-α和ETV（2005）、LdT（2006）被使用，最新的药物是2008年的TDF。
这些药物的使用，极大的改变了CHB相关Management的修订。
不但如此，对于检验医学来说，科技的进步更意味着与CHB相关检测指标的更新。
首先谈血清HBV DNA。
第一次把血清HBV DNA纳入准则的是2000年的亚太准则（Asian-Pacific Consensus Working Parties on Hepatitis B. Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B: An update J Gastroenterol Hepatol 2003;18:239-45），由于2004年Taqman技术的出现，HBV DNA定量成为可能，因此该准则在2005年进行修订，把HBV DNA定量纳入CHB 检测指标。
但是HBV DNA定量作为一个CHB长期指标被纳入一系列相关准则，只是近期发生的事情。
因为直到2005-2006年才有一系列研究证实：血清HBV DNA升高与肝硬化和原发性肝癌高度相关，而肝硬化和肝癌，正是临床上阻止CHB长期演变的目标。
正是由于这些研究的推动，各种CHB相关防治准则在对于血清HBV DNA定量的态度发生了极大转变，都开始纷纷强调抑制血清HBV DNA和监测其水平（Prophylaxis, diagnosis and therapy of hepatitis B virus (HBV) infection: The German guidelines for the management of HBV infection. Z Gastroenterol 2007;45:1281-328.）。
乙型肝炎cccDNA的检测和临床应用
乙型肝炎cccDNA的检测和临床应用肖春花;张春兰【期刊名称】《河北医药》【年(卷),期】2012(034)019【总页数】4页(P2993-2996)【关键词】乙型肝炎;松弛环状DNA;检测【作者】肖春花;张春兰【作者单位】516002,广东省惠州市第三人民医院感染科;516002,广东省惠州市第三人民医院感染科【正文语种】中文【中图分类】R512.62慢性乙型肝炎仍然是影响人类健康的一个重要问题，全球大约有4亿人感染乙型肝炎，其中中国占很大比例，约3 000万慢性乙型肝炎患者，又约5%最终发展成肝硬化或肝癌，每年约有100万人死于HBV感染引起的各种终末期肝病。
目前研究发现并不是乙型肝炎病毒直接损伤肝组织，而是细胞免疫应答攻击病毒的同时造成肝组织的损伤，导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌［1，2］。
虽然近年来乙型肝炎抗病毒治疗取得了一定进展，但治疗的疗程、停药后的复发等等问题一直困扰人类。
HBV感染的细胞生物学知识展示HBVcccDNA(covalently closed circular DNA)在病毒长期存在、停药后复发和抗药性方面起着重要的作用［3］。
1 cccDNA1.1 HBV基因组 HBV基因组结构独特而精密，由不完全的环状双链DNA组成，成熟病毒的DNA以松弛环状DNA(relaxed circular，rcDNA)形式存在，其中负链(长链)约含3 200个bp，含有HBV基因组的全长基因，在5’起始端与3’末端之间有一个至数个碱基的缺口;正链(短链)的长度可变，相当于长链的50% ～80%［4］。
HBV基因组中4个开放性读框均位于负链，分别是S区、C区、P区和X 区，其中S区完全嵌合于P区内，C区、P区和X区部分相互重叠。
见图1。
图1 HBV基因组的组成和结构1.2 cccDNA形成乙肝病毒感染宿主细胞后在胞质中脱去衣壳，然后rcDNA进入细胞核，经宿主DNA聚合酶和拓扑酶等的“修复”，形成超螺旋结构的cccDNA。
慢性乙肝患者血清H B V c c c D N A 检测的临床意义作者
慢性乙肝患者血清H B V c c c D N A 检测的临床意义作者：编辑时间：2013-01-29 10:42 点击：57 慢性乙肝患者血清H B V c c c D N A 检测的临床意义摘要：目的探讨慢性乙肝患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标(AST、ALT、TBIL、HBeAg、HBV DNA)的相关性。
方法选取309医院2009年5月-2012年5月就诊的慢性乙肝患者58例，采用Roche C6000电化学发光法检测HBeAg；日立Hi7600全自动生化分析仪检测ALT、AST、TBIL；采用实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA、HBV cccDNA载量。
结果血清HBV cccDNA与HBV DNA有很好的相关性(r=0.880，P=0.000)。
HBeAg阳性组HBV cccDNA阳性的比例为67.6%，显著高于HBeAg阴性组的37.5%(χ2=5.170，P=0.023)。
血清HBV cccDNA与肝组织炎症的严重程度呈正相关(χ2=4.819，P=0.028)。
结论血清HBV cccDNA定量检测是评价HBV复制情况和肝细胞损伤程度的较为可靠的指标。
关键词：慢性乙型肝炎；共价闭合环状DNA；HBV DNA；乙肝e抗原；谷丙转氨酶目前慢性乙肝的实验室检查常采用免疫学指标HBeAg、HBV DNA反映病毒复制情况，其特异性好但灵敏度相对较低；采用生化指标ALT、AST、TBIL反映肝细胞损伤程度，其灵敏度好但特异性相对较差。
共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的模板，可长期存在于细胞核中，是HBV持续染的关键，也是乙肝慢性化的主要原因[1-2]。
当肝细胞变性坏死时，肝细胞核内的cccDNA可释放入血。
有研究表明血清cccDNA与肝内cccDNA有非常好的相关性[3]，且血清cccDNA可反映肝细胞损伤的严重程度。
本文通过对58例慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标的相关性分析，探讨其在慢性乙肝患者病毒复制和肝细胞损伤评价中的意义。
外周血淋巴细胞中乙肝病毒cccDNA检测研究
３ ６例 Ｃ Ｈ 患 者 中检 出 ２ Ａ ９例 阳性 （０ ５ 患者 中 检 出 ３ Ｐ ２例 阳性 （２ ４ ％ ） ５ ５ ．６ ，９例 Ａ Ｃ标 本 中检 出 １ 阳性 （ ．２ ） ７例 健 康 人 标 本 检 测 结 果 均 为 阴性 。 Ｃ Ｈ Ｓ 例 ０ ０ ％ 。４ Ａ
Ｄ ｔ 吐 ｎｏ Ｂ ｃ Ｎ ｅ ｐ ｅａ Ｂ ｏｄＬ ｍ ｈ ｃｔ． Ｘ ａ ， ｉｏ ｉ ，Ｗ ｉ ． ａ ｇ ｈ ｕ６ｈ ｅｐ ’ ｈ ｓ ｉ ｌ Ｚ ｅａ ｇ ｅ ｃ ｏ ｆ Ｖ ｃ Ｄ Ａｉ Ｐ ｒ ｈ ｒｌ ｌ ｙ ｐ ｏｙｅ ｅ Ｈ ｃ ｎ ｉ ｏ ｕＤ ｉ ＷｕＸ ａｘｎ ｇ ｕＪ ｇ Ｈ ｎ ｚｏ ｔ ｐ ｏ ｌ Ｓ ｏ ｔ ， ｈ ｎ ｎ ｅ ｐａ ｉ ｆ
静
采 用 淋 巴细 胞 分 离 液 分 离 外
做 外 周 血 淋 巴 细 胞 中 乙肝 病 毒 ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ检 测 研 究 ， 探 讨 其 临床 意义 。方 法 并
周 血 淋 巴 细胞 ， 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ法 检 测 外 周 血 淋 巴 细胞 中 ｃｃ Ｎ 用 Ｃ ｃ Ｄ Ａ含 量 。结 果
ｌ ｍｐｈ ｃｙｅ ｉｏａｉ ｇ ｓ ｌ ｉｎ ｔ ｓ ｌ ｔ ｙ ｈｏ ｙｔｓ ｉ ｈ ｅ ｐｈ ｒ ｌ ｌｏ ｙ ｏ ｔ ｓ ｌｔｎ ｏｕｔ Ｏ ｉｏ ａｅ ｌ ｍｐ ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｐ ｒ ｅ ａ ｂｏ ｄ， ａ ｄ ｑ ｎｔｔｔｖ ｏ ｅ ｃ ｎｔｒａ ｔｍｅ ＰＣＲ ｏ ｉ ｎ ｕａ ｉａ ｉｅ ｆ ｒ ｓ ｅ ｅ ｌｉ ｌ ｗａｓｕｓ ｄ ｔ ｅ ｅ ｔ ｅ Ｏ ｄ ｔ ｃ
组 、 Ｐ 组 、 带 者 及 阴 性 对 照 组 之 间 互 相 存 在 统 计 学 差 异 （ ０ ０ ） 携 带 者 组 和 阴性 对 照 组 之 间 无 统 计 学 差 异 。对 定 量 资 料 ＣＨ 携 Ｐ＜ ．５ ， 的统 计 学 分 析 显 示 ： Ａ 组检 测 的 基 因 拷 贝 数 较 Ｃ Ｈ 组 基 因 拷 贝数 明 显 增 高 ， 者 具 有 统 计 学 差 异 （ Ｃ Ｈ Ｐ 两 Ｐ＜０ ０ ） ． ５ 。结 论 （ ） １ ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ在 外 周 血淋 巴 细 胞 中 的 存 在 ， 于 慢 性 乙 肝 病 毒 持 续 感 染 状 态 的 建 立 和维 持 ， 能 具 有 重 要 意 义 。 （ ） 测 外 周 血 淋 巴 对 可 ２检 细 胞 乙肝 病 毒 ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ存 在 及 其 含 量 高低 ， 以作 为评 估 临 床 抗 乙 肝 病 毒 治 疗 有 效 性 的 一 个 参 考 指 标 。 （ ） 检 测 还 可 用 于 乙 可 ３该 肝 患 者 治 疗 中 的复 发 及 预后 判 断 。 关 键 词 外 周 血 淋 巴 细 胞 乙 肝 病 毒 共 价 闭 合 环 状 Ｄ Ａ Ｎ
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分离cccDNA和rcDNA的分子基础
cccDNA 核酸一级结构 完整的双链 rcDNA 两条链均不完整
核酸空间结构
是否与蛋白质结合
闭合环状，超螺旋 松弛环状，非超螺旋
不结合 共价结合 弱，容易被降解
对某些核酸酶抗性 强，不容易被降解
分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异
二、HBV cccDNA检测技术
持恒定(5－50copy/cell)
病毒自身调节：关于病毒的进化
关于病毒的“思维”
病毒自身的调节
外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果
2.抗病毒药物对cccDNA的影响
现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类 似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能
清除cccDNA
细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了 长疗程抗病毒治疗的必要性
侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点
优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强 缺点：灵敏度低：104copy/ml
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者分析法（Invader assaay） 嵌合引物荧光PCR法
3. 嵌合引物荧光PCR法
无论是选择性荧光PCR，还是侵 入者探针法或嵌合引物荧光PCR，
本身都不能解决在高rcDNA背景条
件下的假阳性问题，必须结合抽提
分离、酶切纯化等步骤，以提高特
异性。
三、影响cccDNA池的因素
cDNA池的自身恒定
cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的
含量在无外来干扰的情况下保
105~107copy/ml携带者血清
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
解决方案
特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA
采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法
酶切纯化cccDNA
采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
1820
1820
rcDNA不能被扩增 无荧光信号
cccDNA能被扩增
检测到荧光信号
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
结果 ：
标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml
3.肝外组织也是cccDNA的储存池？
·肝外组织细胞中HBV标志的存在情况： 肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺 等组织或细胞中均检测到HBV的标志物 ·HBV吸附？暂居？建立感染状态？ 依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA， 但必须解决检测技术问题
(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题
建立cccDNA检测技术必须克服的难点
·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有 效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA ·如何进一步解决特异性的问题？ ·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA 含量的较低），血清中含量？ ·如何简化检测步骤？
3’
+
rcDNA 5’
+
cccDNA
p 3’ 5’ N：与HBVDNA非同源片段 N N
P
Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52
3. 嵌合引物荧光PCR法
3’
5’ N P2
5’
N
P
3’
嵌合引物荧光PCR的优缺点
优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高 缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA被非特异性扩增
· “血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率 越高和含量越高”的现象，使我们对方法 学提出质疑 ·肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放 cccDNA入血 ·细胞坏死后，cccDNA释放入血是必然的， 但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 时间？
肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏
移植术后乙肝复发的来源
还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世
为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?
·研究和开发该检测技术的时间不长 ·检测技术上的难度较大 ·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求 ·现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy /ml左右 ·分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
与定性法比较增加了一个荧光探 针，探针位于扩增片段区（负链缺口 下游），与cccDNA的负链互补。
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
3200(1) EcoR I 3‘ 3200（1） EcoR I
+
P2
+
1590 5‘ 3‘ 5‘
P1 P2
1590
P1
乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 组 结 构 示 意 图
乙 型 肝 炎 病 毒 的 复 制 过 程
我们为什么要关注HBV cccDNA?
cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池
”
目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA
的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
现有的几种cccDNA检测技术简介
选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
缺陷：
·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA 非特异性扩增的问题
·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普
通PCR更高
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
质粒标准品107copy/ml
质粒标准品105copy/ml
3.5×108copy/ml携带者血清
“选择性”PCR：并非万无一 失 Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copy
Hepatology 1996;23:405-413
血清HBV rcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR 可能会出现检测结果假阳性
rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结 果也不可靠
Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清)
2.侵入者探针法(Invader assay)
两个体系：
两 种 特 殊 的 探 针 ： invader probe 和 primary probe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。
荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ (cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第 二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合 ，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光 信号。 特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结 合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧 光信号，呈线性信号放大
乙型肝炎ห้องสมุดไป่ตู้毒cccDNA
——检测方法与应用价值
一、几个相关问题简介
什么是HBV cccDNA?
即 共 价 闭 合 环 状 DNA （ covalently
closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿
主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，
病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核， 利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形 成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。
1.选择性PCR
设计一对特殊引物：跨双缺口引物 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正 链缺口上游
反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负
链缺口下游
目的：rcDNA不被扩增
选择性PCR：rcDNA不被扩增
选择性PCR：cccDNA能被扩增
“选择性”PCR：并非万无一 失
PCR产物自身退火（self annealing）