紫外分光光度法测蛋白酶酶活-2013

2013/05/13

紫外分光光度法测蛋白酶酶活

1、原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

2、试剂和溶液

三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。

2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L

称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L

按GB601配制。

2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L

1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

2.4 缓冲溶液

a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶

甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶

甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。

上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。

2.5 10g/L酪素溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

2.6 100ug/mL L－酪氨酸标准溶液

a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸

60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。

b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。

3 仪器和设备

3.1 恒温水浴40±0.2℃。

3.2 紫外分光光度计应符合GB 9721的规定。

4 分析步骤

4.1 求K值

按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。

4.2 测定

吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm 比色皿，测定其吸光度（A）。

a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；

b、按下列程序操作：

试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）

加酶液2.00 mL加酶液2.00 mL

40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min

加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）

40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时）

加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）

继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心

于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值

c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。标准曲线作同样处理。

5 计算

在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。

X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E

式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；

A——试样溶液的平均吸光度；

K——吸光常数；

8——反应试剂的总体积，mL；

2——吸取酶液2.00mL；

1/10——反应时间10min，以1min计；

n——稀释倍数

E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。

所得结果表示至整数。

6 结果的允许差

平行试验测定值之差不得超过3％。