紫外分光光度法测蛋白酶酶活-2013
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。
2测定原理蛋白酶在一定得温度与pＨ条件下，水解酪素（酪蛋白)底物，产生含有酚基得氨基酸（如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下，将福林试剂（Ｆolｉn）还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长68０nm下测定溶液吸光度.酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品得酶活力。
酶活单位得定义:每１mL粗酶液，在一定温度与pＨ值条件下,10min水解酪素产生１μｇ酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。
3仪器与设备3.1分析天平：精度为0、000１ｇ。
3.2紫外分光光度计.3.3恒温水浴锅:精度±０、2℃。
3.4ＰH计:精度为0、01PH单位.4试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。
4.1福林（Foliｎ）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42、4g/L）称取无水碳酸钠(Nａ2ＣＯ3）42、4g，用水溶解并定容至１000mｌ。
4.4三氯乙酸ｃ(ＣCl３COOH）=0、4ｍｏl/L称取三氯乙酸65、4g，用水溶解并定容至１000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c(NａOH）=０、5mol/L称取氢氧化钠片剂20、0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至10００ml,摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL)=1 mol/L及０、１ mol/L1 ｍol／L ＨCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至１000ｍL.0、1 mｏl/ＬHCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1０00mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pＨ=７、5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Nａ２HPO4•12H2O）6、02g与磷酸二氢钠（NaH2PO４•1２H2O)0、５g，加水溶解并定容至１０00mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝３、0,适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸(8０％～90％）10、6g，加水溶解并定容至1000 mL。
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
2013/05/13紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。
2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
蛋白酶酶活测定方法
蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。
一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。
二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。
底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。
三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。
分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解
分光光度法测定蛋白酶酶活分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了解蛋白酶活力测定的原理；2、掌握蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；② 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）；③ 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④ 5%三氯醋酸（TCA）溶液。
四、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min（准确计时）后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
紫外可见光分光光度计酶活性测定的实验流程和方法
葡萄糖 + ATP
己糖激酶 / Mg 2+
葡萄糖-6-磷酸 + ATP
葡萄糖－６－磷酸脱氢酶
葡萄糖-6-磷酸 + NADP
6-磷酸葡萄糖 + NADPH2
图 2：葡萄糖或 ATP 的间接酶检测 两种物质可以通过己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶催化的偶联反 应得以确定（偶联测试系统 [1]）。通过生成的 NADPH2 的量来计算 两种物质的量。
糖酵解 几乎所有生物新陈代谢的一个中间环节就是葡萄糖分别在细 胞的细胞液或细胞质内进行的酶促降解。这一过程叫做糖酵 解。葡萄糖通过分步反应转化为 2 分子的丙酮酸。1 分子的 葡萄糖生成 2 分子的 ATP 和 2 分子以 NADPH2 形式存在的 氧化还原产物。然后，丙酮酸进入初步代谢途径，即丙酮酸 循环，进一步生成呼吸链的还原产物，最终转化为氧。最终 的降解产物是 H2O 和 CO2。
3C
迟”（Delay））加入己糖激酶开始的，总共检测时间为 6 分钟。
实验参数是根据初步实验使用 “单波长λ- 连续”（Singleλ-
continuous）（见上）设定的。以下公式分别用于计算酶活
性和底物浓度：
图 3：活性测定选项 A) 单波长λ- 连续 B) 简单动力学 C) 高级动力学 （Singleλ- continuous） （Simple kinteics） （Advanced kinetics）
Tris 缓冲液 pH 7.0 MgCl2 葡萄糖 NADP+ ATP 己糖激酶 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶
以上溶液均使用分子生物学用水进行制备，并在 Eppendorf IsoPack 冰盒中以 4 °C 保存。Tris 缓冲液在室温下保存。酶 在使用后立即放回冰箱。
紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究
中木瓜蛋白酶的酶活力大小, 为判断嫩肉粉质量优劣提 供参考依 据。把嫩肉粉 溶于盐酸半 胱氨酸 溶液, 取该
混合液与酪蛋白溶液反应 10m in, 用紫外分光 光度法测 得反应 所生成 酪氨酸 的含量。该 方法具 有较好 的准确
性和重现性, 添加标准回收率为 96 8% ~ 105 8% ; 且步骤简明, 所需测试仪器简单。在该方法条件下, 每分
酶活力是酶性质的重要参数, 显示酶分解底 物能力的强弱。木瓜蛋白酶酶活力的测定, 采用 不同底物衍生的测定方法也不同, 所取得的数值 也不能进行直接比较。传统的作法, 木瓜蛋白酶 是用明胶或血红蛋白作底物来测定的。由于要求 底物具有较高的专一性和便于标准化, 新的测定 方法往往采用合成的 N - 苯甲酰 - L - 精氨酸乙酯 ( BA EE ) [ 3] 。但以 BAEE 为底物的测定 方法所涉 及到的仪器设备昂贵, 成本偏高 [ 4] 。本文采用以 酪蛋白为底物的紫外光谱法来测定嫩肉粉中木瓜 蛋白酶的活力, 该法所需测试仪器简单, 步骤简 明, 容易掌握; 并且该法也常被国内用来测定各 种酶的活力, 所得的数据便于比较。对嫩肉粉中 木瓜蛋白酶活力的测定, 可为嫩肉粉质量优劣提 供一项重要的参考指标。
入三氯乙酸溶液 5m L, 振摇, 置 ( 37 0 2) ! 水
浴中, 反应 10m in后, 准确加入 ( 37 0 2) ! 预
热的底物溶液 5 0mL, 振摇, 于 ( 37 0 2) ! 水
浴中放置 40m in, 用干燥滤纸过滤, 滤液在 2h内
采用分光光度法以水为空白, 在 275nm 的波长处
1 实验部分
1 1 仪器 恒温水浴锅; 751- GW 分光光度计。
1 2 试剂 酪蛋白溶液: 取酪蛋 白 0 6g, 加 0 05m o l/L
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。
蛋白酶的检测方法
解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展1 定义1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/ mL)表示。
2 福林法(第一法)2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。
2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，见水定溶至1000ml。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
2、2、2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。
2、2、5 盐酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液 (PH=7.5)适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。
2测定原理蛋白酶在一定得温度与pH条件下,水解酪素(酪蛋白)底物,产生含有酚基得氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Ｆolin)还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比,由此可以计算产品得酶活力。
酶活单位得定义:每１mL粗酶液,在一定温度与ｐH值条件下,10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以(u／ｍL)表示。
3仪器与设备3.1分析天平:精度为0。
0０01g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅:精度±0。
2℃。
3.4PＨ计:精度为0.0１PＨ单位。
4试剂与溶液除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。
4.1福林(Foｌin)试剂市售分析纯福林试剂、4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合,摇匀。
4.3碳酸钠溶液(42、4ｇ／L)称取无水碳酸钠(Na2CＯ3)4２.4ｇ,用水溶解并定容至1０0０ml。
4.4三氯乙酸c(ＣCl3COOH)=0、4mｏｌ/Ｌ称取三氯乙酸６５、4g,用水溶解并定容至１000 mL、4.5氢氧化钠溶液ｃ(NaOH)＝0.5ｍol／L称取氢氧化钠片剂２0。
0g,加水90０ml并搅拌溶解,待溶液到室温后加水定容至1000ml,摇匀。
4.6盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0。
１mol/L1 ｍol/L HＣL:取９０mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mＬ。
０、1 ｍol/Ｌ HCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至100０ｍＬ、4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pH＝７。
5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Na２ＨPO4•12Ｈ2Ｏ)6、02ｇ与磷酸二氢钠(NaＨ2ＰO4•1２Ｈ2O)0、5ｇ,加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液(ｐH=3。
0,适用于酸性蛋白酶)甲液:称取乳酸(80％～９0％)10、6g,加水溶解并定容至1000 ｍL。
紫外光谱法定量测定不同种蛋白酶活力的研究
［４］彭崇惠，冯建誊．张锡瑜定转化学分析简明教私ｆＭ）．北』ｉ：北
京大学出版社，１９９３．
（责任编辑：黄小平）
万方数据
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图３不同浓度的酪氨酸标准溶液标准曲线
２．３分析结果和比较【４１
取丹麦诺维信公司，卜产的４种蛋白酶作样品分析试验，
并与福林一酚法的测定结果进行比较，结果见表２。
≮罢盖薯嘉鬻擎甚），ｔ１．－Ｉ 表２两种测定方法的结果比较
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本方法与福林一酚法相比较，数据的准确度高，重现性 好，且操作简单，广泛适用于市售蛋白酶的活力测定。
［参考文献］
［１］郭勇．酶［程［Ｍ］．北京：Ｉ｛Ｊ闲轻１．、Ｉｐ出版礼．１９９４． ｛２］ＺＢＹ ４００１８～１９８９．加酶洗涤刹中碱性蛋￡ｆ酶活力的测定ｆｓ］．
［３］冯健雯．紫外吸光光度法测定化妆－Ｉ＾巾术瓜蛋ｆＩ酶的活力［Ｊ１． 理化检验一化学分册．２００１，３７（６）：２７７～２７８．
先将酪素溶液放入（４０±ｏ．２）ｏＣ恒温水浴中，预热５ ｍｉｎ。 然后按下列步骤操作：
收稿日期：２００４—０５—１３ 作者简介：张寒俊（１９７５一），女，实验师，硕士，主要从事仪器分析课程的教学及相关的科研工作。
万方数据
张寒俊等：紫外光谱法定量测定不同种蛋白酶活力的研究／２００４年■９期
试铃Ａ（夸｜，１）一，加酶液１．００ ｍｌ（印＿土‘卜２汽～ｎｆｉ．＋ｎ加二二
本文利用蛋白酶在一定的温度与ｐＨ值条件下，水解酪 素底物，水浴６０℃灭酶，然后加入三氯乙酸使未水解的酪素 沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可采用紫外光谱法测定。 根据吸光度计算蛋白酶活力。本方法采用不同ｐＨ值的磷酸 氢二钠和柠檬酸溶液作为缓冲溶液，使繁琐的操作步骤大为 简化，较福林一酚法【２ Ｊ便捷、快速，且试剂易得，广泛适用于市 售蛋白酶的活力测定。
05-02-014作业习题-蛋白酶活力测定(精)
蛋白酶活力测定作业一、选择题1、温度对酶促反应的影响有（）A、温度对酶促反应有双重影响B、温度越高酶促反应速度越快C、最适温度与反应时间无关D、不同酶的最适温度相同2、下列关于最适pH的叙述，哪项是不正确的（）A、最适pH就是酶的pI值B、酶的作用主要取决于活性中心的解离状态C、只有一种解离状态才是酶的最高活性形式D、最适pH时酶的活性最高3、酶原激活的生理意义是（）A、加速代谢B、恢复酶性C、生物自我保护的方式D、保护酶的方式4、Km值的概念是（）A、达到Vmax所需底物的浓度B、是达到1/2Vmax时的底物浓度C、酶一底物复合物的解离常数D、酶在同一反应中Km值随浓度而变化5、用紫外分光光度法测定蛋白酶活力，其中使用三氯乙酸的目的是（）A、调节溶液pHB、使蛋白酶变性失活C、使酪氨酸变性失活D、稳定反应体系二、填空题1、蛋白酶按其反应的最适pH，可分为蛋白酶，蛋白酶和蛋白酶。
2、蛋白酶可以水解蛋白质中的键，产物可以是或。
3、在测定蛋白酶活力过程中，为了终止反应体系中的酶促反应，可向体系中加入。
4、用紫外分光光度法测定蛋白酶活力过程中，将反应体系进行40℃水浴，其目的是为了达到。
三、应用题1、称取25mg蛋白酶粉配成25ml溶液，取2ml溶液测得含蛋白氮0.2mg，另取0.1ml溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500μg酪氨酸。
假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1μg酪氨酸的酶量，请计算：（1）酶溶液的蛋白浓度及比活力。
（2）每克酶粉的总蛋白含量及总活力。
2、酶在长期保存过程中应注意什么条件？作业答案一、选择题1、A2、A3、C4、B5、B二、填空题1、酸性 中性 碱性2、肽键 肽 氨基酸3、三氯乙酸4、酶的最适温度三、应用题1、称取25mg 蛋白酶粉配成25ml 溶液，取2ml 溶液测得含蛋白氮0.2mg ，另取0.1ml 溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500μg 酪氨酸。
蛋白酶活性测定
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：所属课程名称：食物与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）一、原理采用可溶性淀粉为底物，在必然的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。
二、试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使历时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL滚水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、测定步骤（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。
在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。
0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。
０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。
2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。
５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。
四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。
２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。
在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。
00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。
00ml５％三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。
5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。
酶活性检测——精选推荐
酶活性检测④分光光度法利⽤底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
⼏乎所有的氧化还原酶都使⽤该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，⽽NAD和NADP在该波长下⽆吸收，脱氢酶类可⽤该法测定。
该法测定迅速简便，⾃动扫描分光光度计的使⽤对酶活⼒的快速准确的测定提供的极⼤的⽅便。
酶在⾷品加⼯中的作⽤就像⼀把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作⽤我们要加强，在⾷品加⼯过程中添加酶制剂，使其作⽤充分发挥;消极作⽤我们要尽量避免，可以通过加热等⽅法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应⽤于⾷品加⼯，研究酶的性质是⼗分必要的。
⽽紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要⽅法之⼀。
下⾯我们来介绍⽤-可见分光光度计测定酶活的具体⽅法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β⼀半乳糖苷酶β⼀半乳糖苷酶，⼜称乳糖酶(Lactase)。
能⽔解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从⽽提⾼乳制品的可消化性，⽤于低乳糖⽜奶和⾮结晶型浓缩⽜奶的⽣产及奶酪风味的改变，同时还可⽤于⽣产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活⼒。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lµmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活⼒单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是⼀种⼗分重要的⽣物体防⽌氧化损伤的酶类，是⽣物体内超氧阴离⼦清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD⼴泛存在于各类⽣物体内，所有好氧微⽣物细胞中都含有SOD。
⾃1969年Mccord等⼈⾸次发现了SOD ⽣物活性后，医学界对其医疗作⽤做了许多研究，证明它具有抗衰⽼、抗肿瘤、抗辐射、抗缺⾎、提⾼⼈体免疫⼒等作⽤，被专家称为21世纪最有前途的药⽤酶。
欧美国家已开始将其应⽤于医疗、⾷品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加⼊待测SOD样液，再加⼊10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒⼈光径lcm 的⽐⾊杯，在325nm波长下每隔30s测⼀次A值。
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2013/05/13
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
1、原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液
三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。
2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L
按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液
a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
2.5 10g/L酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
2.6 100ug/mL L－酪氨酸标准溶液
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸
60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。
此溶液在冰箱内贮存或立即使用。
3 仪器和设备
3.1 恒温水浴40±0.2℃。
3.2 紫外分光光度计应符合GB 9721的规定。
4 分析步骤
4.1 求K值
按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。
4.2 测定
吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。
滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm 比色皿，测定其吸光度（A）。
a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；
b、按下列程序操作：
试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）
加酶液2.00 mL加酶液2.00 mL
40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）
40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时）
加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心
于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值
c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。
标准曲线作同样处理。
5 计算
在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E
式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL；
2——吸取酶液2.00mL；
1/10——反应时间10min，以1min计；
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。
所得结果表示至整数。
6 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3％。